Name: Assembleia da nucleosomal Arrays de recombinantes Núcleo Histones e Nucleosome Posicionamento DNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda a montar arrays nucleossomais usando histonas recombinantes e DNA posicionador de nucleossomos. Este método permite estudar a estrutura da cromatina e a regulação gênica com precisão.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH concede GM45916 e GM66834 para JCH e uma bolsa da Fundação Internacional de Síndrome de Rett para AK Este trabalho também foi financiado pelo NIH conceder GM088409 e do Instituto Médico Howard Hughes contribuições para KL

1. Assembléia dos recombinantes Núcleo Histones em octâmeros Justificativa: O primeiro passo para nucleosomal reconstituição matriz é preparar octâmeros histonas centrais nativas da liofilizados histonas centrais recombinantes. Proteínas histona são combinados em quantidades equimolares e montadas em octâmeros histonas por diálise das amostras de um tampão de desnaturação em tampão de redobragem. <ol><li> Purifica-se e liofiliza histonas centrais recombinantes (H2A, H2B, H3, H4), tal como descrito 13. </li><li> Dissolve-se cerca de 5 mg de cada grupo de histonas liofilizado em 3 ml de tampão de revelação (6 M de guanidina HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM de DTT). Permitir que cada alíquota para dissolver durante pelo menos uma hora. Certifique-se de que nenhuma proteína permanece nos lados do recipiente. </li><li> Medir a absorvância de cada histona a 276 nm, utilizando tampão de desdobramento como referência. </li><li> Calcula-se a molaridade de cada histona usando seus coeficientes de extinção (Ver Tabela 1 </strong&gt; para Xenopus coeficientes de extinção histona). Comparar a absorção determinada concentração de histona para o peso seco liofilizado, e estimar se a maioria da proteína é dissolvida. </li><li> Determine quais histona você tem o menor número de moles de, como este será o número-limite de moles de todos os histonas. </li><li> Combina-se as histonas em quantidades molares iguais e diluir com desdobramento tampão até uma concentração final de 1 mg / ml. </li><li> Coloque a amostra em 6-8 kDa MWCO tubos de diálise. Veda-se o tubo e colocar em 2 L de tampão de re-enrolamento a frio (2 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM de EDTA, 5 mM de β-mercaptoetanol). </li><li> Dializar a amostra durante 18 horas a 4 ° C com agitação. Verifique se o tubo de diálise pode girar livremente e vigorosamente, ou então as histonas pode precipitar. </li><li> Altere o tampão de diálise duas vezes no período de 18 horas (ou seja, mudar o tampão de redobramento sobre cada 6 horas até feito). Mesmo se precipitado é formado não descartea amostra, alguns octâmero pode ser recuperado, embora o rendimento será diminuída. </li></ol> Nota: Veja o passo 2,1-2,2 para preparar a coluna de equilíbrio para o dia seguinte. 2. Purificação de histona octâmeros por cromatografia de exclusão de tamanho Justificativa: Depois de concluir com a secção 1, amostras conterá octâmeros histonas, bem como outros complexos de histona tais como agregados, tetrâmeros H3/H4 e dímeros H2A/H2B. Octâmeros histona vai ser purificado a partir destes outros complexos utilizando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). <ol><li> Conectar um HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 em coluna (S200) a um sistema de FPLC. Certifique-se que as bolhas de ar não entrar no sistema. </li><li> Limpe a coluna S200 com 0,2 m de água filtrada. Use uma taxa de fluxo de 0,3 ml / min e definir um limite de pressão de retorno de 0,5 MPa. Verifique se você tem água suficiente e permitir que a coluna para limpar durante a noite. </li><li> Equilibrar a coluna e a amostra circular do F S200PLC utilizando tampão de redobramento. Use 1 L de 0,2 um tampão de redobragem filtrada. Fluir tampão de redobragem através da coluna a uma taxa de 1 ml / min e uma pressão máxima de 0,5 Mpa durante cerca de 2 horas. </li><li> Equilibrar um concentrador centrífugo Vivaspin (50 kDa MWCO) com 1 ml de tampão de redobragem. Retirar a amostra do tubo de diálise e centrifugar a amostra a 4 ° C, para remover quaisquer precipitados. Pipetar o sobrenadante da amostra no concentrador. Concentra-se a amostra a um volume de aproximadamente 500 ul. </li><li> Retirar a amostra octâmero concentrada para um novo recipiente e enxaguar o concentrador com 1 ml de tampão de redobragem. Concentra-se a lavagem até 500 mL, e adicioná-lo à amostra octâmero. Isto ajuda a recuperar qualquer octâmero remanescente no concentrador. </li><li> Girar a amostra num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml durante 5 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante e transferir para um tubo novo. Isso ajuda a remover qualquer precipitado antes de colocar a amostra no FPLC. </li><li> Carregar a amostra na coluna S200. Carregar um máximo de 1,5 ml de volume total, ou 15 mg de octâmero em um único purificação. </li><li> Eluir a amostra usando o tampão de redobramento feitos na hora. Use uma taxa de fluxo de 1 ml / min e um limite de pressão de retorno de 0,5 MPa. Usar dois volumes de coluna (400 ml) de tampão de redobragem e recolher fracções de 2 ml. Monitorar a absorvância a 280 nm durante a eluição. As espécies diferentes irá eluir por ordem decrescente de tamanho. Agregados histona normalmente elui a aproximadamente 45 ml, octâmero em cerca de 65 ml, e dímero de cerca de 84 ml (Figura 1). </li><li> Analisar as fracções de eluição de pico de interesse, executando as amostras em um 18-20% de SDS-PAGE. As fracções contendo octâmeros purificadas deve ter quantidades molares iguais das quatro proteínas histona nucleares (Figura 1). </li><li> Reunir as fracções que contêm octâmeros purificados, e concentrar a ≤ 15 mg / ml com um filtro centrífugo Vivaspin. Se não for diluído, octâmeros pode dissociar-idímeros nto H2A/H2B e tetrâmeros H3/H4. </li><li> Determinar a concentração de octâmero medindo a absorvância a 280 nm e calcula utilizando o coeficiente de extinção a partir da Tabela 1. </li><li> Octâmeros histonas pode ser mantido curto prazo em tampão de redobramento a 4 ° C. Se a ser armazenadas a longo prazo, os octâmeros será mais estável a -20 ° C e em uma solução de glicerol a 50%. Octâmeros armazenados em glicerol deve ser dialisado para tampão de re-enrolamento fresco, antes de medições de absorvância e utilizar em reconstituições matriz nucleossomais. </li></ol> 3. Reconstituição de nucleosomal matrizes de DNA e purificada octâmeros Justificativa: Reconstituição de matrizes nucleossomais exige que octâmeros histonas e DNA template ser combinados em proporções molares específicas. Misturas de DNA e histonas octâmeros em 2 M NaCl são dialisados ​​passo em buffers de diminuir a força iônica. Uma mudança gradual para reduzir sal garante formação nucleosome adequada. Obtenção de nmatrizes ucleosomal com o nível desejado de saturação histona octâmero do ADN molde requer reconstituições de teste em pequena escala, seguida por uma reconstituição em larga escala preparativa. As condições adequadas definidas pelos reconstituições de pequena escala são utilizados para orientar a reconstituição preparativa. <ol><li> Purifica-se em tandem repetido ADN posicionamento nucleossoma como descrito 4,12. Resumidamente, isolar o DNA de plasmídeo usando o kit Qiagen GigaPrep ou um produto semelhante. Defina-se uma enzima de restrição digerir a fim de libertar o DNA molde e digerir o ADN do plasmídeo a tamanhos menores (≤ 700 pb). O ADN molde pode, então, ser purificado a partir dos pequenos fragmentos de ADN de plasmídeo, utilizando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). A coluna alimentada por gravidade, com uma altura de cerca de 115 cm cheia com Sephacryl S-1000 grânulos é suficiente para a purificação de 601 x de DNA 207bp 12mer. </li></ol> Notas: Para a purificação de DNA plasmídeo em redução de custos, mas aumentou effort, pode-se utilizar a lise alcalina com fenol / clorofórmio, a purificação do DNA a fim de isolar o ADN de plasmídeo a partir de E. coli 23,24. Estratégias para a separação do molde de DNA a partir de DNA de plasmídeo pode variar com mudanças no tamanho do ADN molde. Por SEC é importante estabelecer a enzima de restrição digerir de uma forma que maximiza a diferença no tamanho entre o molde e o DNA de plasmídeo. <ol start="2"><li> Determinar quais as relações molares (r) a ser usado para reconstituições. R é igual à razão de moles de octâmero de moles de repetição de DNA. Para os testes iniciais de pequena escala, os valores de r de 0,9, 1 e 1,1 são apropriadas se a intenção é obter matrizes nucleossomais saturadas. </li><li> Preparar as amostras em pequena escala por meio do cálculo da quantidade de octâmero para adicionar cerca de 18 ug de ADN para cada razão molar a ser testado. Misture o ADN e histonas octâmeros. A concentração final de NaCl, a amostra deve ser ≥ 2 M, e a concentração final de DNA deve ser em torno de 0,3 mg / mL. As condições finais de tampão de amostra devem também incluir 10 mM Tris pH 7,8, e EDTA 1 mM. </li><li> As amostras estão agora prontas para diálise. Coloque as amostras em 12k-14k MWCO tubos de diálise. Dializar as amostras contra 2L de tampão de diminuição da força iónica como se segue. </li></ol> Componentes em todos os tampões: 10 mM Tris pH 7,8, EDTA 1 mM. Tampão 1 (adicionar 1 M de NaCl, 1 mM de DTT) por 5-6 horas. Tampão 2 (adicionar NaCl 0,75 M, DTT a 1 mM) durante a noite. Tampão 3 (adicionar NaCl 2,5 mM, DTT 1 mM) durante 5-6 horas. Tampão 4 (adicionar NaCl 2,5 mM, PMSF 0,1 mM) durante a noite. <ol start="5"><li> Retirar as amostras do tubo de diálise e siga para seções 4-6. Se as amostras de pequena escala produzir os resultados desejados, repita os passos nas seções 3-6 em larga escala. </li></ol> Nota: A fim de preservar os recursos, as amostras de pequeno porte devem ter o volume mínimo necessário para bastar para testes de rastreio a jusante. Para ter enough amostra para as experiências de velocidade de sedimentação e AFM listados aqui, amostras de 50 ul a 0,3 mg / ml de DNA são apropriados. O tamanho de grande escala, amostras de preparação são dependentes do seu uso pretendido. Uma amostra de grande escala, devem ser preparados da mesma maneira que as amostras de pequena dimensão. 4. Sedimentação Velocity Análise de reconstituídos nucleosomal matrizes Razão: experiências de velocidade de sedimentação das informações rendimento ultracentrífuga analítica Beckman Xl-A / I do tamanho e forma das moléculas em solução. Experiências de velocidade de sedimentação realizadas sob condições de baixa de sal são usados ​​para determinar o grau em que as matrizes são reconstituídos saturado com nucleossomas. <ol><li> Dilui-se a amostra a uma absorvância de cerca de 0,5 a 260 nm, utilizando tampão TEN (10 mM Tris pH 7,8, EDTA 1 mM, NaCl 2,5 mM). Carregar 400 ul de amostra em uma célula com uma peça central de duas sector, com a amostra, de um lado e a referênce (tampão TEN) na outra 25. Mantenha as menisco referência mais elevados do que o menisco da amostra (ie adicione 420 mL solução de referência). </li><li> Carregar as células em que o rotor, e alinhar as células usando adequadamente os cerquilhas na parte inferior das células e o rotor 25. Cuidadosamente a poeira das lentes das células usando ar comprimido. </li><li> Ligue a centrífuga XL-A/XL-I, insira o rotor, e anexar e garantir a ótica conforme descrito no manual. Abra o software Proteome Lab e selecione o arquivo: novo. </li><li> Configurar uma única corrida de digitalização a 3.000 rpm e uma temperatura de 25 ° C. Em Opções, selecione Parar após a última verificação e calibração radial run (calibração radial não é necessário se o rotor foi o último rotor utilizado na AUC). </li><li> Para cada célula, o nome das amostras, selecione um comprimento de onda (260 nm), selecione absorção, e escolha um local em seu computador salvar o arquivo. Comece a única corrida de varredura. </li><li> Use o único exame para determinar a ra apropriadadiscar o comprimento da digitalização (Figura 2A). Diminuição do comprimento da célula que vai ser digitalizada diminui o tempo de execução. No entanto, não se esqueça de incluir o menisco amostra e estender o fim muito próximo, ou na parte inferior da célula. </li></ol> Nota: scans Solteiro permitir área de medição para ser reduzido por medidas a partir pouco antes do menisco da amostra (Figura 2A). A maioria das verificações gerados durante a execução AUC deve ter fracções de limite últimos menisco, bem como planaltos estável (Figura 2B). As lentes sujas sobre as células da AUC podem gerar scans com grandes picos, que podem afectar a análise dos dados. O software UltraScan inclui um manual, que é um grande recurso para obter informações sobre a análise de dados ultracentrifugação analítica 26. <ol start="7"><li> Usando o painel de controle XL-A/XL-I, digite uma velocidade de 0 e começar a pressionar. Isso fará com que a câmara de centrifugação para puxar um vácuo e todosow a temperatura da câmara para equilibrar. Espere 1 hora para permitir a temperatura de equilíbrio, antes de começar a correr. </li><li> Use o software para definir o prazo para a velocidade desejada eo número de exames. Velocidades mais altas aumenta a resolução, mas deve-se coletar pelo menos 20 exames (de preferência mais) antes de a amostra ter sedimentado para o fundo da célula. É conveniente para sobrepor os últimos exames realizados (no menu de opções), a fim de monitorar o progresso da execução e verificar se há problemas potenciais, tais como células vazando. Monitore o primeiro par de exames para garantir o funcionamento adequado. </li></ol> 5. Editar e analisar dados de sedimentação Velocity Justificativa: dados de velocidade de sedimentação Raw deve ser analisada por um programa que produz uma distribuição coeficiente de sedimentação com correção de difusão. Esta informação, por sua vez indica que a fracção de uma amostra reconstituída que contém um determinado nível de saturação, por exemplo, </em&gt; se estiver usando um modelo de DNA 12-mer, será possível determinar a fração de matrizes reconstituídos, que tem 10, 11 e 12 nucleossomos / DNA. <ol><li> Use AUC software de análise de dados, como UltraScan para editar os dados 26. Edição de dados de varredura deve ser feito para cada célula e cria um conjunto de dados para análise posterior. Edição adequada de varreduras envolve a definição de menisco da amostra, reduzindo os dados para uma região de interesse, e a definição de linha de base, bem como as regiões de planalto (Figura 2). Varreduras indesejadas pode também ser removido do conjunto de dados neste ponto. No entanto, uma vez que é possível remover as verificações não desejadas durante a análise, recomenda-se que todas as verificações de ser mantida a este ponto. </li><li> Nós recomendamos fortemente que o método van Holde-Weischet reforçada ser usado para analisar os dados 27. Este método de análise corrige os efeitos de difusão ao longo da corrida e produz a distribuição integrante dos coeficientes de sedimentação. Em especial, O método aprimorado van Holde-Weischet (implementada em UltraScan) vai permitir a inclusão de exames que faltam platôs estáveis, ou que contêm frações de fronteira que não limpou o menisco na análise 28. </li><li> Determinar a distribuição dos coeficientes de sedimentação para as matrizes montadas. Os resultados representativos para 601-12 (207bp, 12-mer) matrizes nucleossomais são mostrados na Figura 3. </li><li> Se uma das amostras em pequena escala contém matrizes com a faixa desejada de coeficientes de sedimentação, em seguida, repita o processo em um aumento da escala começando com a seção 3. Se nenhuma das amostras de pequena escala tem uma distribuição adequada dos coeficientes de sedimentação, em seguida, repetir os testes de pequena escala com uma nova gama r começando na seção 3. </li></ol> 6. Visualizando nucleosomal matrizes com Microscopia de Força Atômica (AFM) Razão: AFM permite a visualização do nível de saturação de nucleosomal matrizes. Esta técnica complementa velocidade de sedimentação com a AUC e a digestão com enzimas de restrição, como um ensaio de controlo de qualidade. <ol><li> Usando os métodos descritos acima, obter uma matriz de nucleossoma bem saturado (Figura 5A). </li><li> Preparar APTES tratada lâminas de mica, colocando ~ 30 ul de diluição de 1:1.000 comercial (Sigma-Aldrich (3-aminopropil) trietoxi-A3648-100 ml) em 0,22 um filtrado de água nanopura para 30 min. </li><li> Após 30 minutos lave as APTES com água filtrada e seque-os delicadamente em um fluxo de nitrogênio. </li><li> Coloque adequadamente diluído amostra variedade nucleosome (~ 1,5 ng / mL) no slide, e incubar coberto em temperatura ambiente por 15 min. </li><li> Enxágüe provar off com tampão de amostra filtrada, seque como antes, e lugar de slides no palco do AFM (neste caso, um Microscópio de Força Atômica Asylum Research MFP-3D). </li><li> Comece pela imagem 2 x 2 m scans com 512 linhas de varredura. Contar o número de nucleossomos para determinar nível de saturação (Figura 5B). </li><li> Idealmente, você deve áreas de imagem no slide com matrizes nucleossomos bem separados. </li><li> Para imagens de alta resolução, um nm de digitalização de 500 x 500 pode ser obtido (Figura 5C). </li><li> As imagens podem ser achatado e analisados ​​usando o software MFP-3D fornecido pelo Asilo. </li><li> Cada imagem pode ser dividida em quatro quadrantes e ampliada digitalmente para obter uma visão mais clara de matrizes bem separados e várias linhas de mão livre podem ser tiradas através das matrizes e perfis de altura são obtidos para os nucleossomos (Figura 5C, certo traço painel altura e 5D). </li><li> Várias dessas imagens deverá ser analisada para cada tipo de matriz que abrange várias centenas de nucleossomas. Altura perfis são registrados, classificados e plotados em MS Excel. </li></ol>

<ol><li>Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 7, (1997).</li>
<li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+chromatin+fiber+in+solution%3A+determinants%2C+mechanisms%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).</li>
<li>McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+architectural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li>
<li>Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+reconstituted+oligonucleosomes%2C+evidence+for+salt-dependent+folding+in+the+absence+of+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1.</a> Biochemistry. 28 (23), 9129-9136 (1989).</li>
<li>Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activator-dependent+p300+acetylation+of+chromatin+in+vitro%3A+enhancement+of+transcription+by+disruption+of+repressive+nucleosome-nucleosome+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).</li>
<li>Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+compacted+chromatin+by+early+developmental+transcription+factors+HNF3+%28FoxA%29+and+GATA-4%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4.</a> Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).</li>
<li>Nguyen, C., Gonzales, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((chromatin+structure+associated+with+methylation-induced+gene+silencing+in+cancer+cells%3A+correlation+of+accessibility%2C+methylation%2C+MeCP2+binding+and+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation.</a> Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).</li>
<li>Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forkhead+factor+FoxE1+binds+to+the+thyroperoxidase+promoter+during+thyroid+cell+differentiation+and+modifies+compacted+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).</li>
<li>Simpson, R. T., Stafford, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+features+of+a+phased+nucleosome+core+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural features of a phased nucleosome core particle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+motifs+and+free+energies+of+selected+natural+and+non-natural+nucleosome+positioning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences.</a> Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).</li>
<li>Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Core+Histone+N-terminal+Tail+Domains+Function+Independently+and+Additively+during+Salt-dependent+Oligomerization+of+Nucleosomal+Arrays+%2A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).</li>
<li>McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+histone+H4+N-terminal+domain+function+during+nucleosomal+array+oligomerization%3A+roles+of+amino+acid+sequence%2C+domain+length%2C+and+charge+density%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).</li>
<li>Ma Shogren-Knaak,, Fry, C. J., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+peptide+ligation+strategy+for+deciphering+nucleosomal+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).</li>
<li>Lu, X., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+H3K79+dimethylation+and+H4K20+trimethylation+on+nucleosome+and+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).</li>
<li>Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Ultracentrifugation+for+the+Analysis+of+Chromatin+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure.</a> Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).</li>
<li>Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+and+agarose+gel+electrophoresis+as+tools+for+studying+chromatin+folding+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution.</a> Methods. 12 (1), 62-72 (1997).</li>
<li>Montel, F., Menoni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+individual+nucleosomes+controls+the+chromatin+condensation+pathway%3A+direct+atomic+force+microscopy+visualization+of+variant+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin.</a> Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).</li>
<li>Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linker+region+of+macroH2A+promotes+self-association+of+nucleosomal+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+nucleosomes+revealed+by+time-lapse+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).</li>
<li>Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+atomic+force+microscopy+to+study+chromatin+structure+and+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling.</a> Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).</li>
<li>Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+loading%2C+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> J. Vis. Exp. (33), e1530(2009).</li>
<li>Demeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UltraScan%3A+a+comprehensive+data+analysis+software+package+for+analytical+ultracentrifugation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Analytical+Ultracentrifugation%3A+Techniques%22%5BJournal%5D)">UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments.</a> Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).</li>
<li>Holde, K. V., Weischet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boundary+analysis+of+sedimentation+velocity+experiments+with+monodisperse+and+paucidisperse+solutes%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes.</a> Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).</li>
<li>Demeler, B., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sedimentation+velocity+analysis+of+highly+heterogeneous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems.</a> Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).</li>
<li>Hansen, J., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+structural+properties+of+subsaturated+chromatin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays.</a> Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).</li>
<li>Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+repeat+length+and+linker+histone+stoichiometry+determine+chromatin+fiber+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).</li>
<li>Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleosome+surface+regulates+chromatin+compaction+and+couples+it+with+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).</li>
<li>Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+arrays+reveal+the+two-start+organization+of+the+chromatin+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber.</a> Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).</li>
<li>Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Short+nucleosome+repeats+impose+rotational+modulations+on+chromatin+fibre+folding%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding.</a> The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).</li>
<li>Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Silent+Information+Regulator+3+Protein+%2C+SIR3p+%2C+Binds+to+Chromatin+Fibers+and+Assembles+a+Hypercondensed+Chromatin+Architecture+in+the+Presence+of+Salt%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).</li>
<li>Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structure+of+a+tetranucleosome+and+its+implications+for+the+chromatin+fibre%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre.</a> Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).</li>
<li>Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+histone+variant+H2A.Z+regulates+the+equilibrium+between+different+chromatin+conformational+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states.</a> Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).</li>
<li>Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histones+stabilize+the+intrinsic+salt-dependent+folding+of+nucleosomal+arrays%3A+mechanistic+ramifications+for+higher-order+chromatin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding.</a> Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).</li>
<li>Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+In+Vitro+Reconstitution+of+a+Defined+%26%2334%3B30+nm%26%2334%3B+Chromatin+Fibre+Containing+Stoichiometric+Amounts+of+the+Linker+Histone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined &#34;30 nm&#34; Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone.</a> Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).</li>
<li>Dorigo, B., Schalch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+fiber+folding%3A+requirement+for+the+histone+H4+N-terminal+tail%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail.</a> J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).</li>
<li>Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+chromatin+folding+patterns+in+chicken+erythrocytes+by+atomic+force+microscopy+%28AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM.</a> Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

Matrizes nucleossomais modelo são uma ferramenta muito útil para o estudo in vitro da estrutura e função da cromatina. Por exemplo, eles têm sido amplamente utilizado para estudar o mecanismo da condensação de cromatina na fibra solução 30-34, e tornou possível a obtenção de uma estrutura de raios-x de um tetranucleosome 35. Mais recentemente, eles têm se mostrado útil para decifrar os efeitos estruturais de variantes de histonas núcleo específico, mutantes e modificações pós-translacionai...

Genomas eucarióticos não existir como DNA nu, mas sim são compactadas e organizada por proteínas ligadas. Estes complexos de ADN e de proteínas são conhecidos como cromatina. A unidade de repetição básica de cromatina é o nucleossoma. Um nucleossoma é constituído por octâmero histona e 146 pares de bases de ADN envolvida em torno da histona octâmero cerca de 1,6 vezes uma. O octâmero histona é composto por duas cópias de cada um dos H2A histonas centrais, H2B, H3, e H4. Octâmeros histonas centrais que são espaçadas repetitivamente ao longo de uma molécula de DNA são chamados de matrizes nucleossomais. A estrutura estendida de matrizes nucleossomais tem sido referido como a fibra de 10 nm ou as &quot;pérolas num fio&quot; estrutura e está presente in vitro sob condições de baixo teor de sal 2. A fibra de 10 nm é capaz de condensar em estruturas de ordem superior através de compactação intra-array e / ou inter-array oligomerization 2. Estas estruturas de ordem superior pode ser induzida na presença de sais,ou pode ser influenciada por meio da ligação de proteínas de arquitectura da cromatina para a matriz nucleossomal 3,4. Os níveis de compactação da cromatina são inversamente correlacionada com a taxa de transcrição in vivo 5,6. Uma pesquisa recente destaca a importância da organização estrutural de genomas em processos como a diferenciação, o desenvolvimento de câncer, e outros 7,8. O uso de matrizes nucleossomais para estudar a estrutura e função da cromatina tornou-se generalizada. Aqui nós descrevemos um método para a montagem de matrizes nucleossomais de histonas centrais recombinantes e DNA posicionamento nucleosome. Usando DNA recombinante com repetições em série de sequências de posicionamento nucleossomas permite a reconstituição de matrizes que contêm nucleossomas regularmente espaçados. Duas das seqüências de posicionamento mais populares são a seqüência do gene 5S rRNA eo &quot;601&quot; seqüência 9,10. A sequência de 601 foi derivado de experiências de SELEX e more posiciona fortemente nucleossomos do que a seqüência 5S 11. Por conseguinte, o comprimento do DNA adaptador das matrizes 601 é mais homogénea. DNA posicionamento nucleosome tandem repetido é obtido por filtração em gel 4,12. Histonas recombinantes são purificados a partir de E. Coli sob condições de desnaturação 13. O uso de histonas recombinantes permite controlar cuidadosamente a composição das histonas nucleossomais matrizes. Por exemplo, o núcleo histonas com mutações específicas 14 ou modificações pós-traducionais 15,16 pode ser substituído por histonas centrais de tipo selvagem. Experimentos de velocidade de sedimentação monitorar a taxa de sedimentação de macromoléculas em solução sob uma força centrífuga aplicada 17. Este fornece informação sobre o tamanho e forma de macromoléculas numa amostra. Experimentos de velocidade de sedimentação são, portanto, uma ferramenta adequada para o estudo de soluções mudanças de estado em fibras de cromatinaestrutura devido à condensação da cromatina 18. Importante, é primeiro necessário utilizar experiências de velocidade de sedimentação, como um passo de controlo de qualidade em nucleossomal reconstituição matriz. Se o DNA e nucleossomos não são combinados na proporção molar apropriado, os conjuntos podem ser sub-ou sobre-saturado com histonas do núcleo. Assim, a informação obtida a partir de experiências de velocidade de sedimentação é usado para garantir que o ADN está adequadamente saturada com nucleossomas. É importante a utilização de métodos alternativos para estimar a saturação de ADN com os nucleossomas, especialmente se a trabalhar com um molde de ADN anteriormente não caracterizada. Portanto, nós também descrevem um método para análise de matrizes nucleossomais usando microscopia de força atômica (AFM). AFM é uma técnica poderosa que permite a visualização dos efeitos de uma série de parâmetros, tais como o nível de saturação, o efeito da presença de variantes de histona ou os efeitos de MgCl2 19,20. AFM também tem sido aplied para estudar a dinâmica nucleossomos usando tempo de imagem lapso 21. In vitro montado nucleossomais matrizes 12-meros são particularmente passíveis de estudos de AFM, porque eles pertencem à faixa de tamanho certo para AFM 22. No presente estudo, utilizamos AFM de matrizes nucleossomais como um controle de qualidade, bem como um meio de afirmar os dados da AUC (&quot;ver para crer&quot;). Além de simples visualização, AFM permite a medição de perfis de altura de amostras como uma métrica adicional.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropil) trietoxissilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648-100ML</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa MWCO Tubulação de diálise</td><td>Fisher</td><td>21-152-5</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad Superdex 200 16/60 coluna</td><td>GE</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 50 kDa MWCO Concentrador centrífugo</td><td>Sartorius</td><td>VS2031</td><td></td></tr><tr><td>12-14 kDa MWCO Tubulação de diálise</td><td>Fisher</td><td>08-667A</td><td></td></tr><tr><td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td><td>GE</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>XL-A/I Ultracentrífuga</td><td>Analítica Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assembleia da nucleosomal arrays de recombinantes núcleo histones e nucleosome posicionamento dna

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Octâmeros histonas centrais que são espaçadas repetitivamente ao longo de uma molécula de DNA são chamados de matrizes nucleossomais. Matrizes nucleossomais são obtidos de uma de duas maneiras: a purificação de fontes in vivo, ou a reconstituição in vitro a partir de histonas de núcleo e de ADN recombinante em tandem repetido posicionamento nucleossoma. O último método tem a vantagem de permitir a montagem de uma mais uniforme em termos de composição e matriz nucleossomal precisamente posicionado. Experiências de velocidade de sedimentação em a informação analítica rendimento ultracentrífuga sobre o tamanho ea forma das macromoléculas através da análise da velocidade à qual elas migram através de uma solução sob a força centrífuga. Esta técnica, juntamente com a microscopia de força atómica, podem ser usadas para controlo de qualidade, garantir que a maior parte dos moldes de ADN são saturados com nucleossomas após reconstituição. Aqui nós descrevemos os protocolos necessários para reconstituir quantidades de miligramas de comprimento e de composição dmatrizes nucleossomais efined adequados para estudos bioquímicos e biofísicos da estrutura e função da cromatina.

Para ilustrar o protocolo que reconstituído matrizes nucleossomais recombinantes de histonas de núcleo de Xenopus e de ADN consistindo em 12 conjunto 207 repete pb da sequência de posicionamento 601 (601 207 x 12). O primeiro montado octâmeros nativas de histonas de núcleo liofilizados e, em seguida, purificado os octâmeros por FPLC usando uma coluna S200 (Figura 1A). Complexos maiores eluir mais cedo a partir da coluna S200. As histonas geralmente eluir nesta ordem: agregados histon...

Um método é apresentado para a reconstituição do modelo matrizes nucleossomais de histonas centrais recombinantes e de DNA em tandem repetido posicionamento nucleosome. Nós também descrevem como experimentos de velocidade de sedimentação na ultracentrífuga analítica, e microscopia de força atômica (AFM) são usados ​​para monitorar o grau de saturação disposição nucleosomal após a reconstituição.

Assembleia da nucleosomal Arrays de recombinantes Núcleo Histones e Nucleosome Posicionamento DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Este experimento tem como objetivo montar matrizes nucleossômicas que contenham uma série de sequências de DNA com posicionamento nucleossômico repetidas em tandem e um número igual de nucleossomos, primeiramente refazendo os complexos de histonas por diálise das histonas centrais fora do tampão desnaturante. Em seguida, separe o emer de histonas utilizando uma coluna de exclusão por tamanho. A seguir, combine o ER de histonas com o DNA molde em uma faixa de razões molares e deposite sobre o DNA como nucleossomos por diálise em etapas, de sal alto para sal baixo.Em seguida, teste as amostras por velocidade de sedimentação para determinar a proporção molar adequada para o nível desejado de saturação. Os resultados podem mostrar o nível de saturação dos arranjos nucleossômicos com base em sua migração pela solução sob força centrífuga, ou com base em uma imagem gerada por microscopia de força atômica. A principal vantagem dos arranjos nucleossômicos em vez de mononucleossomos é que os nucleossomos são conectados por DNA conector, impondo uma restrição estrutural adicional.Embora este método possa fornecer informações sobre a estrutura da cromatina, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como estudos de transcrição in vitro em modelos de cromatina. Ryan e Anna agora demonstrarão a montagem de arranjos nucleossômicos a partir de histonas recombinantes puras em DNA com posicionamento nucleossômico. Inicie com as proteínas purificadas liofilizadas das histonas recombinantes H two A, H two B, H three e H four; dissolva aproximadamente cinco miligramas de cada uma em três mililitros de tampão desdobrador e incube por pelo menos uma hora à temperatura ambiente com agitação.Agora, meça a absorbância de cada solução de histona a 276 nanômetros, utilizando o tampão de desdobramento como referência. Em seguida, calcule a molaridade de cada histona usando seus coeficientes de extinção. Compare a concentração determinada por absorbância com o peso seco liofilizado e estime se a maior parte da proteína está dissolvida.Identifique a amostra de histona que contém o menor número de mols, pois este será o número limite de mols para todas as histonas. Em seguida, combine as histonas em quantidades molares iguais. Dilua a mistura de histonas com tampão desdobrador até uma concentração final de um miligrama por mililitro.Agora transfira a amostra para um tubo de diálise. Feche o tubo e coloque em dois litros de tampão de refoldagem frio. Realize a diálise da amostra por 18 horas a quatro graus Celsius com agitação.Certifique-se de que o tubo de diálise possa girar livre e vigorosamente para evitar a precipitação deste material. Troque o tampão de diálise a cada seis horas; mesmo que um precipitado se forme, não descarte a amostra, pois parte dos octi pode ser recuperada, embora o rendimento seja reduzido. Conecte a coluna S 200 a um sistema FPLC, garantindo que bolhas de ar não entrem no sistema.Lave a coluna S 200 durante a noite com água filtrada por 0,2 micrômetro utilizando uma vazão de 0,3 mililitros por minuto e o limite de pressão reversa de 0,5 megapascal; em seguida, equilibre o sistema com um litro de tampão de refoldagem filtrado por 0,2 micrômetro por cerca de duas horas. Equilibre também um concentrador centrífugo com um mililitro de tampão de refoldagem. Agora, remova a amostra do tubo de diálise.Centrifugue a amostra a quatro graus Celsius para remover quaisquer precipitados. Pipete o sobrenadante da amostra para o concentrador. Concentre a amostra até um volume de aproximadamente 500 microlitros.Transfira a amostra concentrada de Optimus para um novo recipiente. Enxágue o concentrador com um mililitro de tampão de refoldagem. Concentre o enxágue até 500 microlitros e adicione-o à amostra de ER.Centrifugue a amostra em um tubo microfúgico de 1,5 mililitro por cinco minutos a 10.000 RPM a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Agora, carregue a amostra na coluna S 200.Elua a amostra com 400 mililitros de tampão de refoldagem recém-preparado e colete frações de dois mililitros. Monitore a absorbância a 280 nanômetros durante a eluição. Os agregados de His geralmente eluem em aproximadamente 45 mililitros de EMR, por volta de 65 mililitros e tempo.Em torno de 84 mililitros. Analise as frações eluídas dos picos de interesse realizando as amostras em um gel de SDS-PAGE de 18 a 20%. As frações contendo émus purificados devem apresentar quantidades molares iguais das quatro proteínas histonas centrais.Agora, reúna as frações que contêm OCRs purificadas e concentre-as usando um filtro centrífugo para determinar a concentração final de octr. Meça a absorbância em 280 nm e calcule a concentração utilizando o coeficiente de extinção.Reconstitua matrizes nucleossômicas a partir de DNA e ERs purificados conforme detalhado no texto do protocolo. Em seguida, dilua a amostra até uma absorbância de 0,5 a 260 nanômetros. Carregue 400 microlitros da amostra em uma célula com centro de dois setores, colocando a amostra em um lado e o tampão de referência 10 no outro.Embora o nível do líquido em ambos os setores deva ser próximo ao mesmo, mantenha o menisco de referência mais alto que o menisco da amostra. Carregue as células no rotor e alinhe-as corretamente.Usando as marcas hash na parte inferior das células do rotor, remova suavemente a poeira das lentes das células com ar comprimido. Ligue a centrífuga X-L-A-X-L-I. Insira o rotor e conecte e fixe a óptica conforme descrito no manual.Abra o software do laboratório de proteoma e selecione arquivo novo. Configure uma execução com varredura única a 3000 RPM e temperatura de 25 graus Celsius. Para cada cubeta, nomeie as amostras, selecione um comprimento de onda, selecione absorbância e escolha um local para salvar o arquivo em seu computador.Sob opções, selecione parar. Após a última varredura e a execução da calibração radial, inicie a execução da varredura única. Utilize a varredura única para determinar o comprimento apropriado da varredura radial.Usando o painel de controle X-L-A-X-L-I. Insira uma velocidade de zero e pressione asterisco para equalizar a câmara. Usando o software, defina a velocidade desejada e o número de varreduras.Velocidades mais altas de centrifugação aumentam a resolução do coeficiente de sedimentação. No entanto, deve-se coletar pelo menos 20 varreduras antes que toda a amostra tenha sedimentado até o fundo da célula. Monitore as primeiras varreduras para garantir o funcionamento adequado.Sobreponha os últimos scans para monitorar o progresso da corrida e verificar possíveis problemas, como células com vazamento. A análise dos resultados de velocidade de sedimentação, bem como um protocolo para visualizar arranjos utilizando microscopia de força atômica, são detalhadas no texto do protocolo. Neste experimento.As histonas nucleares liofilizadas de Xenopus foram reconstituídas no octâmero purificado por FPLC em uma coluna S-200. O agregado não específico de histonas eluiu primeiro, seguido pelo octâmero de histonas, tetraímeros de H3 e H4 e dímeros de H2A.H2B. A análise das frações de octâmero purificadas por eletroforese em gel de SDS indica quantidades equimolares das quatro proteínas histônicas. Observe que as H2A e H2B de Xip possuem pesos moleculares que diferem em apenas cerca de 200 daltons e, portanto, frequentemente aparecem como uma única banda em géis de SDS.As frações 64 a 67 foram reunidas e armazenadas para a reconstrução de arranjos nucleossômicos. Uma captura de tela do software Proteome Lab, obtida a partir de um único escaneamento realizado a 3000 RPM, foi utilizada para definir a faixa de medições de um escaneamento de células UC. Em seguida, uma série de escaneamentos de velocidade de sedimentação é editada para gerar um conjunto de dados, no qual as linhas vermelha e verde representam dois métodos diferentes para visualizar a distribuição dos coeficientes de sedimentação.No UltraScan. A linha vermelha é a distribuição integral dos coeficientes de sedimentação, enquanto a verde é a derivada no estudo da organização da cromatina. A microscopia de força atômica in vitro complementa a ultracentrifugação analítica para estabelecer o grau de saturação do molde após a reconstrução.Aqui, a maioria das 27 SARs utilizadas na imagem continha de 10 a 11 nucleossomos. Esta varredura de 500 por 500 nanômetros mostra claramente arranjos nucleossômicos com o DNA conector. Também são apresentados o traçado da amplitude, o traçado da fase e o mesmo traçado de altura com uma linha desenhada à mão livre passando pelos nucleossomos para determinar o perfil de altura dos nucleossomos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro dias, se executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é muito importante lembrar de ser extremamente preciso ao medir as concentrações dos seus reagentes. Após este procedimento, você também pode testar os níveis de saturação de arranjos nucleossômicos utilizando técnicas como microscopia de força atômica. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de cromatina estudarem a estrutura da cromatina e sua compactação.

assembly-nucleosomal-arrays-from-recombinant-core-histones-nucleosome

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos técnicas de microscopia de força atômica de lapso de tempo de alta velocidade, AFM, para estudar a dinâmica dos complexos de nucleossomos. À medida que a ponta do AFM varre a superfície do nucleossomo, ela detecta alterações na altura do nucleossomo e registra o desdobramento do DNA ao longo do tempo.

Microscopia de Força Atômica de Lapso de Tempo de Alta Velocidade para Capturar a Dinâmica do Nucleossomo

Este protocolo descreve a reconstituição de nucleossomas contendo histonas irmã isotopicamente marcados diferencialmente. Ao mesmo tempo, nucleossomas assimetricamente pós-translacionalmente modificados pode ser gerado após o uso de uma cópia da histona premodified. Estas preparações podem ser prontamente usadas para estudar os mecanismos de modificação de diafonia, simultaneamente em ambas as histonas irmã, utilizando espectroscopia de RMN de alta resolução.

Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados

Aqui, apresentamos um protocolo de caracterização de partículas nucleossoma no nível do único-molécula usando microscopia estático e Time-Lapse de força atômica (AFM), técnicas de imagem. O método de superfície functionalization descrito permite a captura da estrutura e dinâmica dos nucleosomes em alta resolução em nanoescala.

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Aqui apresentamos um método para expressar proteínas histonas acetiladas usando expansão de código genético e montar nucleososomos reconstituídos in vitro.

Site Lysine Acetilation specific de Histones para Reconstituição Nucleososome usando Expansão do Código Genético em Escherichia coli

Este protocolo descreve em detalhes a preparação de complexos nucleossômicos usando dois métodos de preparação de amostras para congelamento de grades de TEM.

Preparação de Partículas Nucleares Complexadas com Fatores de Reparo de DNA para Determinação Estrutural por Microscopia Crio-Eletrônica

Este artigo apresenta um procedimento experimental detalhado para reconstituir amarras de DNA contendo nucleossomos para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única. Além disso, descreve vários experimentos a jusante que podem ser conduzidos para visualizar o comportamento de ligação de proteínas que interagem com a cromatina e analisar mudanças nas propriedades físicas dos nucleossomos.

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Este vídeo demonstra a técnica utilizada para a preparação de organizador e explantes pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis, incluindo o uso da faca sobrancelha - uma ferramenta de dissecção especializados feitos da própria sobrancelha. O protocolo para a montagem de um ensaio de aderência também é dado, que investiga para a presença de moléculas de adesão chave presentes na superfície ou organizador de células animais pólo que são críticos para o desenvolvimento adequado.

Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular

Isolamento de DNA genômico de Tails rato

Nós apresentamos uma integração inovadora e poderosa de nanofotônica (QD-FRET) e microfluídica para investigar a formação de polyplexes polieletrólito, que é esperado para prestar um melhor controle e síntese de polyplexes uniforme e personalizável para à base de ácido nucléico futuro terapêutica.

Combinando QD-FRET e microfluídica para monitorar Nanocomplex DNA Automontagem-in Real-Time

A ultracentrífuga analítica (AUC) célula de amostra detém amostra e tampão de referência e durante as experiências e é exposto a alto vácuo e velocidades de rotor até 60.000 rpm. Este vídeo vai demonstrar a atenção rigorosa ao pormenor necessário para o carregamento, montagem e alinhamento deste componente muito importante de um experimento AUC.

Montagem, de carga, e alinhamento de uma célula Analytical ultracentrífuga Amostra

Aprenda a montar arrays nucleossomais usando histonas recombinantes e DNA posicionador de nucleossomos. Este método permite estudar a estrutura da cromatina e a regulação gênica com precisão.

Assembleia da nucleosomal Arrays de recombinantes Núcleo Histones e Nucleosome Posicionamento DNA

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