Alto rendimento, extração automatizada de DNA e RNA de amostras clínicas utilizando a Tecnologia TruTip em Robots Liquid Handling comuns

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar o DNA genômico humano de sangue total, utilizando a tecnologia de extração com ponteiras True, no sistema automatizado Hamilton Star Liquid Handling. Para alcançar esse objetivo, as células são lisadas em uma solução composta por tampão de lise, proteinase K e etanol, que é aspirada e dispensada através das ponteiras True várias vezes, promovendo a ligação do DNA à matriz da ponteira. Em seguida, dois tampões de lavagem distintos são passados pelas ponteiras True para remover proteínas residuais, tampão de lise e outros contaminantes dos ácidos nucleicos ligados.

No terceiro passo, a matriz de ligação da ponta verdadeira é seca aspirando e dispensando ar várias vezes para evaporar qualquer tampão de lavagem remanescente; na etapa final, o tampão ilusão é movimentado para frente e para trás através da matriz de ligação para liberar o DNA da matriz. Utilizando a tecnologia de ponta verdadeira, o DNA genômico de alto peso molecular, livre de contaminantes, é assim extraído e pode ser confirmado por absorção UV-vis, eletroforese em gel e PCR quantitativa ou sequenciamento. As vantagens da ponta verdadeira em comparação com outros métodos de preparação de amostras baseados em colunas de centrifugação ou partículas magnéticas são que a Tru Tip é fácil de automatizar.

Não requer sistemas caros com centrífugas e hastes magnéticas, e o fluxo de trabalho simples economiza espaço valioso na bancada. Embora hoje nos concentremos em sangue total, o Tru Tip pode ser aplicado a outras aplicações de amostras de DNA genômico, bem como ao RNA viral de amostras clínicas de swab ou ao isolamento de DNA livre de células do plasma, para citar algumas. Demonstrará o procedimento Dane Brady, engenheiro de automação do nosso laboratório, que teve papel fundamental no desenvolvimento do procedimento de extração com Tru Tip na Estação de Tratamento de Líquidos Hamilton.

Neste protocolo, um robô de manipulação líquida Hamilton Star extrai simultaneamente DNA de 96 poços de sangue total. O Hamilton Star possui uma unidade opcional de agitação com aquecimento na plataforma, o que é importante para a digestão enzimática de certas matrizes clínicas, como sangue total. Como o sistema pode ser equipado com uma cabeça de pipetagem de 96 canais, há uma placa de 96 poços dedicada para cada um dos passos verdadeiros com ponteiras e reagentes.

Primeiro, ligue o equipamento associado ao robô Hamilton Star e o computador. Abra o software Hamilton Run Control. Abra o arquivo de execução fornecido pela ACON para 96 amostras.

Agora configure o layout do deck de estrela seguindo o diagrama. Coloque ponteiras filtradas de um mililitro em todas as posições marcadas como um; na posição dois, coloque ponteiras não filtradas de um mililitro; na posição três, coloque uma ponteira Conni Hamilton de um mililitro LPT com pontas verdadeiras de dois milímetros. Continue consultando o gráfico para preencher as posições restantes, da cinco à doze, com os LabWare necessários, mas ainda não carregue as amostras.

Agora distribua os reagentes: 75 mililitros do tampão de lise e ligação. F deve ser carregado na posição cinco do reservatório. Alternativamente, placas pré-preenchidas com tampões também podem ser utilizadas para agilizar a configuração e simplificar o layout da placa.

Continue carregando o robô conforme apropriado. Por fim, remova as tampas dos tubos de sangue e coloque-os nas grades do portador de amostras ou na posição quatro da bancada. Coloque a amostra um na parte traseira do portador mais à esquerda e prossiga sequencialmente ao longo de cada portador, com a amostra 96 terminando na posição dianteira direita.

Após o carregamento de todas as amostras, deixe-as equilibrar à temperatura ambiente. Como o protocolo é totalmente automatizado, há pouca possibilidade de erro operacional. As amostras precisam ser colocadas na ordem correta no suporte, mas a codificação por barras pode ser implementada para garantir o rastreamento adequado das amostras.

Para iniciar um script automatizado, selecione o botão de reprodução no canto superior esquerdo da janela do arquivo de execução e insira o número de amostras que estão sendo processadas. O primeiro passo executado pelo script é transferir 80 microlitros de proteinase K para a placa de incubação na posição 14 do módulo aquecedor agitador. Em seguida, o script dispensa 200 microlitros de amostra em cada poço da placa de incubação utilizando o braço de oito canais.

Em seguida, são dispensados 600 microlitros do tampão de lise F em cada poço da placa de incubação utilizando o braço de 96 canais. O script então mistura a solução por 10 ciclos e incuba por 20 minutos a 70 graus Celsius e 500 RPM na placa de poços profundos, sendo que a temperatura é de apenas 60 Celsius, dentro da faixa de atividade da proteinase K. Enquanto as amostras estão em incubação, o sistema de manipulação de líquidos continua operando, dispensando os reagentes de extração e eluição dos reservatórios principais para as respectivas placas de 96 poços; 100 microlitros do tampão Elucian A são adicionados a cada poço da placa de poços profundos.

Na posição 13, são depositados 800 microlitros de etanol em cada poço da placa de poços profundos. Na posição 10, 1,6 mililitro de tampão de lavagem K é adicionado a cada poço da placa de poços profundos na posição 12 e 1,6 mililitro de tampão de lavagem J é adicionado a cada poço da placa de poços profundos na posição 11. Após a incubação de 20 minutos, a mistura da amostra é transferida da placa de incubação para a placa de poços profundos contendo etanol na posição 10, onde é misturada por 12 ciclos de pipetagem.

Em todo o processo, as ponteiras de reagentes são descartadas no recipiente de resíduos conforme necessário. O programa prossegue do processo de lise para a extração de DNA carregando primeiro 96 ponteiras verdadeiras da posição três da plataforma. O próximo passo é aspirar e dispensar as amostras na posição 10 por 10 ciclos, ligando assim os ácidos nucleicos ao monólito da ponteira verdadeira.

Em seguida, as pontas verdadeiras movem-se para a posição 11, onde o tampão de lavagem J é passado sobre o monólito cinco vezes para remover resíduos de lise, tampão e matriz da amostra. Então, as pontas verdadeiras movem-se para a posição 12, onde o tampão de lavagem K é passado através delas cinco vezes para remover proteínas e outros contaminantes dos ácidos nucleicos retidos. Em seguida, as pontas verdadeiras são secadas ao ar, realizando 80 ciclos em alta velocidade acima da placa de lavagem.

Agora, as ponteiras verdadeiras movem-se para a posição 13, onde o tampão elucian passa por elas duas vezes em cinco ciclos, liberando o DNA na placa de poços profundos. As ponteiras verdadeiras são agora ejetadas para o recipiente de resíduos. Agora o programa foi concluído.

Remova a placa de eluição do instrumento e transfira as amostras extraídas para os tubos apropriados para armazenamento ou aplicações posteriores. O programa também pode ser personalizado para transferir automaticamente as amostras finais para o tubo ou placa desejado em apenas uma hora. O sistema automatizado extraiu DNA genômico de 96 amostras de sangue utilizando o robô.

Os perfis de absorbância de 45 amostras de sangue positivas foram processados simultaneamente com 45 brancos de reagente. A razão média entre 260 e 280 foi de 1,96, e a razão média entre 260 e 230 foi de 1,93, sugerindo amostras puras em um gel de agarose a 1%. Amostras aleatórias apresentaram alto peso molecular com cisalhamento mínimo.

O rendimento médio foi de cerca de cinco microgramas de DNA por 200 microlitros de sangue total. Ao otimizar o protocolo automatizado com ponteiras verdadeiras, toma-se especial cuidado para garantir que não haja contaminação cruzada entre poços. A PCR em tempo real mostra separação nítida entre positivos e negativos, conforme mostrado aqui.

Para extrações de RNA, a extração completa de 96 amostras pode ser concluída em menos de uma hora, exigindo tempo mínimo de manipulação manual. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar DNA genômico humano de sangue total utilizando a Tecnologia TRU Automatizada no Workstation de Manipulação de Líquidos Hamilton Star.