Name: Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprenda a medir dinâmicas de cálcio em neurônios individuais de C. elegans usando indicadores fluorescentes geneticamente codificados. Esta técnica de imagem in vivo permite analisar respostas neuronais a estímulos sensoriais e danos celulares de forma simples e econômica.

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Várias pessoas contribuíram para o trabalho descrito neste artigo. CVG construiu a configuração experimental, e LS, SHC, e CVG realizados os experimentos. CVG e SHC escreveu o manuscrito. Todos os autores posteriormente participou no processo de revisão e aprovou a versão final do manuscrito. Agradecemos Paulo Sternberg para a cepa GCaMP. Algumas cepas de nematóides utilizados neste trabalho foram fornecidos pelo Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que é financiado pelo NIH National Center for Research Resources (NCRR). O programa de análise de imagem MATLAB foi adaptada da utilizada no 18. Os autores foram apoiados pela Boston University e do Massachusetts Life Sciences Center.

1. Configuração óptica <ol><li> Use um microscópio composto padrão com recursos de imagens de epifluorescência. Nós usamos um microscópio Nikon Eclipse Ti-U invertido com um iluminador HG Intensilight. </li><li> Para uma melhor imagem e qualidade de sinal usar uma grande ampliação, o objetivo alta abertura numérica. Normalmente usamos uma Nikon X60 1,4 NA objetiva de imersão em óleo. Em alguns casos, é possível a utilização de mais baixa ampliação (X40, X20), dependendo do nível de expressão do fluoróforo e intensidade do sinal. </li><li> Use uma alta sensibilidade arrefecida CCD da câmara, tal como uma câmera Clara Andor para maximizar a sensibilidade da imagem e minimizar o ruído de fundo. </li><li> Para fluoróforos de cor única utilização do filtro de fluorescência padrão microscópio ajustado concebido para o comprimento de onda particular do fluoróforo. Para usar um padrão GCaMP GFP filtro definido optimizado para a excitação a 488 nm e emissão a 525 nm. Sem mais modificações ópticas são necessárias. </li><li&gt; Para raciométrica fluoróforos, tais como cameleon, utilizar um sistema de imagem dupla de tal modo que as imagens podem ser idênticas simultaneamente capturado em dois comprimentos de onda separados. Isto é realizado por projecção das imagens duplas lado a lado na câmara. Uma configuração simples de conseguir isto, utilizando componentes ópticos básicos sobre uma placa de montagem de grau óptico, encontra-se ilustrada na Figura 1. É constituída por: <ol class="ualpha"><li> Um filtro microscópio definido com 440 ± 20 nm filtro de excitação e 455 nm de comprimento passar espelho dicróico. </li><li> Uma máscara colocada no plano da imagem inicial imediatamente fora do microscópio de imagem da porta (onde a câmera sensor CCD normalmente sentar). Isto restringe o campo de visão tal que irá preencher apenas metade do sensor da câmara. Colocando a máscara para os resultados de imagem primeiro plano na imagem fronteiras nítidas e sem sobreposição quando as duas imagens são projectadas lado-a-lado. </li><li> A lente primeiro relé definir uma distância focal longe de tele plano de imagem inicial de tal forma que colima a luz. </li><li> Um espelho dicróico que divide a luz em dois comprimentos de onda de imagem separados ou canais que reflectem uma cor (&gt; 515 nm, amarela), enquanto que o outro transmissor (&lt;515 nm, ciano). </li><li> Filtros de emissões (filtros passa-banda) restringindo ainda mais a luz transmitida para os comprimentos de onda específicos de imagem (ciano de 485 ± 40 nm e amarelas em 535 ± 30 nm), </li><li> A segunda lentes de retransmissão (uma para cada canal) colocados nos percursos dos feixes esses que reorienta a luz para um plano de imagem segundo a imagem da câmara CCD. </li><li> Um par de espelhos e um espelho dicróico segunda dirige os percursos dos feixes de modo que as duas imagens e recombinadas são projectadas lado-a-lado sobre o sensor CCD da câmara. Figura 4A mostra um exemplo da imagem resultante. </li></ol></li><li> Alinhamento óptico inicial: Iniciar configuração e alinhamento da óptica com uma imag alto contrastee usando uma lente de ampliação baixa iluminação e da luz transmitida de campo amplo (a preto sharpie desenhada numa lâmina de microscópio funciona bem). Trazer a imagem para focar através das oculares de microscópio e em seguida comutado para a porta de microscópio para ser usado. Com iluminação de luz alta visualizar a imagem em um cartão de índice no plano inicial focal (alguns centímetros fora do porto microscópio). Posicionar a lente do primeiro relê (C) no caminho do feixe de forma que ele é uma distância focal a partir do plano focal inicial e colima a luz, enquanto não desviar o percurso do feixe (isto é, está directamente centrado no caminho do feixe). Coloque a máscara no primeiro plano focal, ajustados para restringir metade do campo de visão e produzir uma fronteira nítida na imagem. Posicionar os espelhos e filtros (D, E, G) de tal forma que o percurso do feixe permanece paralelo à superfície da mesa e é executado em dois caminhos paralelos lado a lado, como mostrado na Figura 1B. Centro das lentes de retransmissão segundo (F) nos seus respectivos percursos dos feixes emovê-los e para trás ao longo dos caminhos para levar as imagens para um foco em um cartão colocado foi o sensor CCD da câmera será. Se feito corretamente as duas imagens deve ser parfocal com as oculares de microscópio e portos outras câmaras. Finalmente coloque a câmera na posição e ajustar o alinhamento. </li><li> Alinhamento Sintonia fina óptica: Use a imagem dupla visto pela câmera CCD para afinar o alinhamento óptico. Usar uma imagem de alto contraste e iniciar com menor ampliação, a mudança para uma ampliação maior para o alinhamento final. Posicionar a imagem transmitida (ciano canal na Figura 1B), para cobrir uma metade do campo da câmara de vista movendo a câmara na posição X e Y. da imagem reflectida (canal amarelo na Figura 1B), para cobrir a outra metade da área de ver, ajustando os últimos dois espelhos (G), no seu caminho do feixe. Optimizar concentrar movendo a lente segundo relê para cada canal e para trás ao longo do percurso de feixe. Se esquerdoconfiguração do inalterado óptico deve ser estável e só requer ajuste sintonia rara multa. </li></ol> 2. Preparação de amostras e Aquisição de Dados. <ol><li> Adquirir animais que expressam um fluoróforo de cálcio no neurônio sensível de interesse do Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) ou de outras fontes. Animais transgénicos Alternativamente pode ser construído usando o padrão C. técnicas elegans. Expressão única célula não é necessária (e por vezes não é desejável se os neurónios são múltiplos a ser investigado, ver 12), desde que as imagens e as medições de várias células pode ser prontamente separados. Se o transgene fluoróforo não é integrado no genoma, uma variação significativa na expressão pode ocorrer de animal para animal. Neste caso, a pré-selecção de animais com níveis mais elevados de expressão, utilizando um microscópio de dissecação fluorescente aumenta a relação sinal-ruído e melhora as medições. Fluoróforo níveis de expressão need de ser suficiente para ser facilmente visualizado com a câmara sob os parâmetros de aquisição exigidos pela experiência. </li><li> Fazer as almofadas de agarose necessários para a técnica de imobilização desejado (ver 2.3), pressionando uma pequena gota de agarose fundida entre duas lâminas de vidro espaçadas por dois pedaços de fita de laboratório. Se necessário, as almofadas de agarose podem ser transferidas para uma lamela de vidro antes da montagem dos animais. Veja a Figura 2. </li><li> Imobilizar C. elegans para imagens utilizando uma das técnicas seguintes: <ol class="ualpha"><li> Paralisação Farmacológica: Adicionar Levamisole 0,05% a almofadas de agarose (2% de mistura-o na agarose fundida, antes de fazer as almofadas em 2.2). Escolha 5-10 animais para a almofada e cobrir com uma lamela. Aplicar pequenas quantidades de mistura de cera quente (cera de parafina a 50% e 50% de vaselina), para os cantos da lâmina de cobertura para mantê-lo em posição. Permitir 5-10 minutos para o Levamisol para ter efeito e os animais para become completamente imóvel. </li><li> Imobilização Agarose Stiff: C. elegans pode ser fisicamente imobilizado utilizando almofadas rígidas 10% de agarose e 0,05 uM nanopartículas de poliestireno diâmetro. Fazer almofadas de agarose a 10% (10% de agarose em tampão NGM em peso) como em 2.2. Adicionar ~ ul de solução de esferas 3 (1:10 microesferas de poliestireno em NGM por volume) para a parte superior da almofada. Rapidamente, escolha C. 5-10 elegans na piscina de solução de esferas na almofada e suavemente cubra com uma lamínula. Use cera fundida aplicada aos cantos da lâmina de cobertura para mantê-lo em posição. (Para detalhes adicionais sobre a técnica ver 7, bem como um artigo JoVE anterior 8) </li><li> Colagem: C. elegans pode ser colada no local usando pequenas quantidades de adesivo de grau veterinária aplicada a um lado do animal. </li><li> Dispositivos microfluídicos: Inúmeros dispositivos microfluídicos foram projetados para segurar fisicamente C. elegans no lugar para imagens. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Coloque o slide preparado no microscópio e focar no neurônio desejado. É muitas vezes mais fácil de encontrar o C. elegans utilizando iluminação de campo claro e baixa ampliação. Em seguida, mudar para alta ampliação e imagens de fluorescência para encontrar e focar no neurônio específico. </li><li> Estímulo: Se uma resposta neuronal a um estímulo específico for desejado (campo, luz eléctrica, sinais gustativos e olfactivos, temperatura, etc), o aparelho de estímulo devem ser concebidas para a instalação de microscópio, de tal forma que ele pode ser administrado aos animais no a preparação da amostra, enquanto imagens. </li><li> Aquisição de imagens utilizando o microscópio câmera CCD. Os tempos de exposição e nível de luz de excitação depende do sinal de referência e o nível de expressão do fluoróforo, com sinais mais fracos que requerem tempos de exposição mais longos com resolução de tempo concordante menos. Normalmente usamos ~ 300 vezes a exposição ms. </li><li> Adquirir imagens individualmente ou como um time-lapso filme. Porque C. neurônios elegans geralmente exibem dinâmica de ativação lenta (ou seja, eles não têm potencial de sódio base de ação), taxas de quadros relativamente lentos de ~ 1 seg são muitas vezes suficientes para medir neurônio dinâmica. Taxas de aquisição até ~ 90 quadros por segundo têm sido usados, embora estes possam ser limitado pelo tempo necessário para a integração de fluorescência fraca. Os filmes individuais de um único neurónio pode facilmente estender-se por alguns minutos (~ 5-10 min), ou mais se a preparação é estável e imobilização a taxa de quadros relativamente lenta. </li></ol> 3. Análise de Dados <ol><li> Há uma série de diferentes pacotes de imagens fluorescentes de software disponíveis com as capacidades de análise dinâmica e raciométrica incluindo ImageJ e NIS-Elements. Nós usamos um simples costume programa MATLAB, que mede a média do sinal fluorescente sobre uma região de interesse selecionada. </li><li> Para imagens individuais (ou time-lapse filmes que permanecemperfeitamente imóvel) selecionar uma região de interesse (ROI) dentro do neurônio com imagens e uma região separada próxima para a medição de fundo. Para imagens raciométrica seleccionar ROI semelhante e as regiões de fundo para cada uma das imagens duplas. </li><li> Ligeiro movimento do neurônio com imagens dentro de um filme de lapso de tempo requer uma análise adicional para selecionar automaticamente o ROI em cada quadro, o que pode ser feito usando esquemas de rastreamento inúmeros objetos. Nosso programa exibe uma imagem compactada de todas as imagens do filme a partir do qual um limite bruto (abrangendo o objeto de interesses em todos os quadros) é manualmente selecionados e uma região de fundo independente selecionada. Para o primeiro quadro, um ROI é manualmente selecionadas dentro da região de fronteira. Para cada quadro subsequente, o programa selecciona os pixels mais brilhantes de dentro da região de fronteira para gerar um ROI de tamanho correcto (isto é, o mesmo número de pixels, como o ROI armação manual do primeiro). Para imagens onde o object de interesses é suficientemente brilhante, então o fundo em torno na região de fronteira este protocolo seleciona um ROI razoável para cada quadro. </li><li> O sinal de fluorescência, F, de cada quadro é calculado como a média de intensidade de pixel do ROI, menos a intensidade média da região do fundo. Os valores de medida proporcional são calculadas como a razão entre os dois sinais (YFP-YFP fundo) / (CFP-PCP fundo) -0,65. O factor de 0,65 compensa purga através do canal para o canal PCP YFP, que será dependente dos fluoróforos, bem como o conjunto de filtros particular usado (este valor é tipicamente ~ 0.6 para configurações cameleon). </li><li> O nível de cálcio em relação a cada quadro é calculada como a percentagem de alteração na intensidade normalizada para um valor de linha de base inicial medido a partir do primeiro quadro (ou uma série de quadros): Af / F = (F (t)-F o) / F o, em que F (t) é a fluorescência no tempo t e o Fé o valor de referência inicial. </li><li> A selecção do organismo ROI célula gera os sinais mais fortes mais robustas, mas também é possível seleccionar e medir os sinais a partir de uma ROI ao longo dos processos nervosos. </li></ol> 4. Resolução de Problemas <ol><li> Branqueamento: A exposição a luz de excitação pode causar descoloração do fluoróforo e é marcada por uma diminuição constante no sinal que é dependente do nível de exposição. Medições raciométrica ajudar a compensar esta situação. No entanto seletiva de branqueamento de um comprimento de onda ainda pode ocorrer (normalmente alvejantes PCP mais rápido, então YFP). Se ocorre branqueamento reduzir o nível de exposição à luz, reduzindo o tempo de exposição e / ou de intensidade de excitação (com filtros de densidade neutra na via de iluminação). Se necessário, pode-se compensar de branqueamento, executando testes simulados (com a mesma exposição excitação mas nenhum estímulo neuronal) e quantificando a constante de tempo de decaimento do sinal. </li><li>C.. elegans responder à exposição à luz e estímulos experimentais, tornando-os mais susceptíveis de se mover, no momento da gravação. Ligeiro movimento pode introduzir ruído significativo na medição especialmente quando se mede a partir de processos de axônios. Análise raciométrica ajuda a minimizar estes efeitos, em certa medida e de medições a partir do corpo das células são mais robustas. Execução cuidadosa e refinamento dos procedimentos de imobilização irá resultar em animais completamente imóvel. </li><li> Escolha do Fundo: A seleção cuidadosa de uma região de fundo é necessário para a análise de imagem de sucesso. Regiões fundo deve ser razoavelmente uniforme e mais escura, então o neurônio imagens. Deve ser suficientemente removidos para evitar a luz difusa (e, portanto, um captador de sinal) do neurónio imagens. Nós encontramos uma região uniforme 20-50 uM do ROI funciona bem na maior parte dos casos. </li><li> Óptica raciométrica: O alinhamento correto da ótica de imagem é fundamental para a geração de uma imagem clara dupla. Anexos microscópio comerciais para imagiologia raciométrica estão disponíveis. Uma técnica alternativa é empregar imagiologia sequencial rápida utilizando uma roda de filtro rápido para rapidamente alternar entre comprimentos de onda de emissão durante a gravação de imagens separadas para cada um. </li><li> Análise raciométrica: A análise aqui descrito é uma técnica relativamente simples que gera sinais robustos em virtude de uma média de mais de um ROI. Ele requer um objeto reconhecidamente brilhante para selecionar o ROI. Uma análise mais sofisticada raciométrica é possível alinhar com precisão e mapeamento das imagens duplas tais que a razão de fluorescência podem ser calculados pixel a pixel. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Indicadores de cálcio geneticamente codificados têm sido amplamente utilizados em C. elegans neurobiologia. Numerosos grupos têm utilizado as técnicas para estudar a resposta de neurónios sensoriais primários a estímulos externos, como aqui demonstrado com a resposta ASJ a um campo eléctrico. Exemplos proeminentes incluem sensação de toque mecânico, produtos químicos específicos, temperatura e um campo elétrico 12, 16-19. Actividade de células do músculo interneurônio e também foram monitorizadas tan...

Aqui apresentamos métodos práticos para em imagens de cálcio vivo em C. neurônios elegans. O desenvolvimento de codificados geneticamente cálcio sensíveis fluoróforos com relação sinal-para-ruído de alto torna C. elegans um sistema relativamente simples e de baixo custo para a medição da neurofisiologia e da atividade. Nossa imagem é feita com um microscópio composto padrão, utilizando de campo amplo imagens de fluorescência de fluoróforos disponíveis correntemente. Nós apresentamos várias técnicas que empregam vários fluoróforos e preparações diferentes de amostra, discutir os pontos fortes e fracos de cada um. Os dados são então apresentados a partir de duas experiências de exemplo. Um excelente recurso adicional sobre as técnicas descritas aqui podem ser encontrados em WormBook, &quot;Imaging a actividade dos neurónios e músculos&quot; por R. Kerr, ( <a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a> ) 3. Duas grandes classes de geneticacamente codificados repórteres cálcio fluorescentes são comumente usados ​​em C. elegans: GCaMP único canal e FRET baseada cameleon. Vamos descrever métodos e mostrar exemplos de dados gerados por cada um. GCaMP baseia-se numa modificação Green Fluorescent Protein (GFP) que é sensível à concentração de cálcio circundante. Isto é realizado através da fusão de GFP e a alta afinidade da proteína de cálcio calmodulina, de tal modo que a ligação do cálcio por calmodulina traz a molécula GFP em uma confirmação eficiente fluorescente 2. Os avanços recentes no tamanho destes fluoróforos gerar sinal excepcional com aumento até 500% na intensidade de fluorescência ao longo de um intervalo fisiológico dos níveis de cálcio e de cinética razoavelmente rápidos de ~ 95 ms de tempo de subida e o tempo de decaimento ~ 650 mseg 4. Ao longo de períodos de tempo relativamente curtos (min), estes sinais grandes podem permitir a imagiologia de resolução mais baixa (inferior a ampliação) e, dado um bem comportado o initaferição ial, negar a necessidade de linha de base contínua ou medições comparativas. Cameleon tem a vantagem de ser um fluoróforo com base em FRET, que gera uma medição raciométrica comparando dois canais independentes ou comprimentos de onda 1. É constituída por dois fluoróforos separadas (ciano e amarelo emissores de proteínas fluorescentes, PCP e YFP) ligadas por uma proteína calmodulina. O complexo é iluminado com luz azul (440 nm) que excita o PCP. A ligação de cálcio traz os fluoróforos mais juntos, o aumento de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), a partir da PCP (dador) para o YFP (aceitador) e provocando a emissão de PCP (480 nm) para diminuir a emissão e YFP (535 nm) para aumentar . Os níveis de cálcio são medidos em relação como a razão entre a intensidade de YFP / PCP. Cinética Cameleon são mais lentos do que a de GCaMP, medido in vivo para ter um tempo de subida de uma sec ~ e um tempo de decaimento de ~ 3 seg 5. No entanto,a razão entre os sinais que se deslocam em oposição aumenta o tamanho do sinal e compensa para um certo número de possíveis artefactos devido a alterações na concentração de fluoróforo de movimento, ou o desvio de focagem e de branqueamento. Codificados geneticamente repórteres fluorescentes anular grande parte da preparação da amostra necessária com sondas exogenamente administrado e C. elegans pequeno corpo transparente permite imagens dentro do animal intacto utilizando fluorescência de campo simples de largura. O principal desafio técnico na preparação da amostra é, portanto, de forma segura para imobilizar os animais. Há um número de diferentes técnicas usadas cada uma com vantagens e desvantagens. Usando um agente farmacológico para paralisar os animais é fácil de implementar e permite que a montagem de vários animais em uma preparação (Levamisole, um agonista colinérgico que provoca o tecido do músculo para aproveitar é tipicamente usado 6). C. elegans pode também ser fisicamente imobilizado por montá-losna dura de agarose a 10% 7, 8. Isto minimiza o impacto sobre a fisiologia do animal, permite que a longo prazo de imagens (horas) e recuperação de vários animais, mas é mais difícil tecnicamente. Ambas as técnicas de restringir o acesso físico para os animais (que se encontram sob uma lâmina de cobertura) e podem, portanto, ser utilizados apenas com certos estímulos experimentais (tais como a luz, a temperatura do campo eléctrico ou danos no laser). Para estímulos onde o acesso físico é necessário, como o toque ou a administração de produtos químicos, muitos estudos com sucesso colado C. elegans em vigor (usando cola grau veterinária) 9. Isso é tecnicamente mais desafiador, é uma preparação único animal e não permitir a recuperação dos animais. Por fim, vários dispositivos têm sido utilizados microfluidicos que fisicamente conter C. elegans, preservando a fisiologia animal, permitindo que a exposição à maioria dos tipos de estímulos (dependendo da concepção do dispositivo) e pode permitir a troca rápida e recuperação dos animais <sup&gt; 10, 11. Porém a microfluídica exigem habilidades técnicas adicionais e capacidades em fabricação, design e implementação. Em imobilizada actividade dos animais e de resposta a estímulos podem ser geralmente medidos em sensorial e interneurónios. Atividade dos neurônios motores requer técnicas mais sofisticadas para geração de imagens de animais em movimento. Aqui iremos apresentar métodos detalhados empregando as duas técnicas mais simples de paralisação e imobilização farmacológica com agarose dura. Os métodos aqui apresentados podem ser usados ​​para medir a actividade neuronal e da fisiologia celular em C. elegans. Nós dar um exemplo de cada um: usando GCaMP para medir a resposta do neurônio sensorial ASJ a um campo elétrico externo, e usando cameleon para medir a resposta fisiológica de cálcio a danos de laser de um neurônio. Estes exemplos demonstram as vantagens e desvantagens dos dois tipos de fluoróforos e ilustram o que é possível com o sistema.

<table><tbody><tr><td>Microscópio invertido Eclipse Ti-U</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intensilight HG Iluminador</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>Fonte de luz fluorescente</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo VC 60X Óleo</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa óptica ou placa de ensaio de grau óptico 3'X3'</td><td>Thor Labs</td><td></td><td>Se uma mesa óptica não for usada, uma placa de ensaio de grau óptico em uma bancada de laboratório sólida deve ser suficiente.</td></tr><tr><td>Câmera Interline Clara</td><td>Andor Technology</td><td></td><td>Câmera CCD de alta sensibilidade</td></tr><tr><td>wtGFP Longpass Emission</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>41015</td><td>Conjunto de filtros GFP para imagens GCaMP</td></tr><tr><td>Filtro 440 +/- 10 nm</td><td>Chroma</td><td>D440/20x EX</td><td>filtro de excitação para cameleon</td></tr><tr><td>Espelho dicróico > 455 nm longpass</td><td>Chroma</td><td>455DCLP BS</td><td>microscópio dicróico para imagem cameleon </td></tr><tr><td>Espelho dicróico > 515 nm longpass</td><td>Chroma</td><td>515DCLP BS</td><td>espelho dicróico para cameleon Filtro de imagem</td></tr><tr><td>535 +/- 15 nm</td><td>Chroma</td><td>D535/30m EM</td><td>YFP filtro de emissão</td></tr><tr><td>480 +/- 20 nm</td><td>Chroma</td><td>D485/40m EM</td><td>CFP filtro de emissão</td></tr><tr><td>Lente, 200 mm, Achromat</td><td>Thor Labs</td><td>AC508-200-A1</td><td>Lente de relé para óptica FRET (3)</td></tr><tr><td>Espelho de banda larga prateado</td><td>Thor Labs</td><td>ME2S-P01</td><td>Óptica FRET (2)</td></tr><tr><td>Amortecedor</td><td></td><td></td> NGM<td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08691-10, nanopartículas de poliestireno de 2,5% by volume, 50 nm de diâmetro</td><td>para C. elegans imobilização Cepa</td></tr><tr><td>transgênica, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) </td><td>Sternberg Lab</td><td>Cepa PS6388</td><td></td></tr><tr><td>Cepa transgênica, mec- 4::YC3.60</td><td>Gabel Lab</td><td>Cepa CG1B</td><td></td></tr></tbody></table>

na imagem cálcio vivo neuronal em c. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

O verme nemátodo C. elegans é um organismo modelo ideal para imagens relativamente simples, de baixo custo neuronal in vivo. O corpo transparente e simples pequeno, bem caracterizado, sistema nervoso permite a identificação e imagens de fluorescência de qualquer neurónio dentro do animal intacto. Técnicas de imobilização simples, com um impacto mínimo sobre a fisiologia do animal permitir imagens com lapso de tempo prolongado. O desenvolvimento de fluoróforos geneticamente codificados de cálcio sensíveis como cameleon 1 e 2 permitem GCaMP imagem in vivo de cálcio neuronal relacionada a fisiologia celular e da atividade neuronal. Foram identificadas numerosas estirpes transgénicas que expressam estas fluoróforos em neurónios específicos estão prontamente disponíveis ou podem ser construídos usando técnicas bem estabelecidas. Aqui, descrevemos os procedimentos detalhados para medir a dinâmica do cálcio dentro de um único neurônio in vivo utilizando tanto GCaMP e cameleon. Discutimos vantagens e disadvantidades de ambos, assim como vários métodos de preparação da amostra (imobilização de animais) e análise de imagem. Por fim, apresentamos os resultados de dois experimentos: 1) utilizando GCaMP para medir a resposta sensorial de um neurônio específico para um campo elétrico externo e 2) Usando cameleon para medir a resposta fisiológica de cálcio de um neurônio a danos de laser traumático. Técnicas de cálcio de imagem, como estes são usados ​​extensivamente em C. elegans e foram estendidos para medições em animais livremente móveis, neurônios múltiplas simultaneamente e comparação entre fundos genéticos. C. elegans apresenta um sistema robusto e flexível para a imagiologia neuronal in vivo com vantagens sobre outros sistemas de modelos em simplicidade técnica e custos.

Aqui apresentamos os resultados de dois experimentos distintos. O primeiro utiliza GCaMP para medir a resposta de um neurónio sensorial específica a um estímulo externo definido, que dá um bom exemplo de como repórteres fluorescentes de cálcio pode ser utilizado para monitorizar a actividade neuronal opticamente em C. intacto elegans. O segundo emprega cameleon para medir a concentração de cálcio intracelular transiente provocado dentro de um neurónio, em resposta ao dano do laser específico, ilustrand...

Com o seu pequeno corpo transparente, neuroanatomia bem documentado e uma série de técnicas genéticas passíveis e reagentes,<em&gt; C. elegans</em&gt; Faz um organismo modelo ideal para<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem neuronal relativamente simples, usando técnicas de baixo custo. Aqui descrevemos imagem único neurônio dentro de animais adultos intactos usando codificados geneticamente indicadores de cálcio fluorescentes.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

O objetivo geral do experimento a seguir é empregar fluoro fours geneticamente codificados para medir a dinâmica do cálcio de neurônios individuais dentro do verme nematóide. Veja elegância, isso é obtido primeiro montando e desmobilizando a elegância C intacta que expressa um fluoróforo sensível ao cálcio nos neurônios de interesse em uma lâmina de microscópio padrão. Em seguida, os neurônios individuais são fotografados in vivo usando microscopia de vídeo e técnicas padrão de imagem epifluorescente.Em seguida, o vídeo é analisado para medir a intensidade da fluorescência em locais específicos do neurônio para dois campos G de quatro fluor comumente usados, que fornecem um sinal robusto de canal único de grande amplitude e camaleão baseado em traste, que gera uma proporção de canal duplo. Os resultados da medição métrica são obtidos a atividade neuronal mostrada em resposta a um estímulo sensorial específico, bem como a fisiologia do cálcio celular em resposta a danos celulares, ambos baseados na medição óptica dos níveis relativos de cálcio dentro do neurônio imageado. As principais vantagens desta técnica sobre métodos semelhantes em sistemas de vertebrados ou eletrofisiologia convencional é que o CL elgan representa um sistema robusto, flexível e geneticamente tratável para imagens neuronais in vivo que é tecnicamente simples e econômico.Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em uma ampla gama de biologia de neurônios baseada em campo, permitindo medições de atividade e seno com neurônios individuais in vivo. Comece com um microscópio composto padrão com recursos de imagem de fluorescência epi para obter a melhor qualidade de imagem e sinal. Use uma câmera CCD refrigerada de alta ampliação, alta abertura numérica e alta sensibilidade para maximizar a resolução e a sensibilidade da imagem, minimizando o ruído de fundo para quatro de flora de cor única.Use o conjunto de filtros de fluorescência de microscópio padrão projetado para o comprimento de onda específico do campo Fluor four for G. Use um conjunto de filtros GFP padrão otimizado para excitação em 488 nanômetros e emissão em 525 nanômetros, quatro geometrias métricas de flora quatro, como camaleão, use um sistema de imagem duplo, de modo que as imagens idênticas possam ser capturadas simultaneamente em dois comprimentos de onda separados. Isso pode ser feito usando um sistema disponível comercialmente ou construído em casa que projeta imagens duplas lado a lado na câmera da seguinte maneira.Um conjunto de filtros de microscópio com um filtro de excitação de 440 mais ou menos 20 nanômetros e um espelho iic de passagem longa de 455 nanômetros, uma máscara de imagem colocada no plano de imagem inicial imediatamente fora da porta de imagem do microscópio, onde o sensor CCD da câmera normalmente colocaria o primeiro conjunto de lentes de relé, a uma distância focal do plano de imagem inicial, de modo que ele agrupe a luz, um espelho dicróico que divide a luz em dois comprimentos de onda ou canais de imagem separados, refletindo uma cor enquanto transmite os outros filtros de emissão. Restringindo ainda mais a luz transmitida aos comprimentos de onda específicos da imagem. As lentes do segundo relé, uma para cada canal, colocadas nos caminhos do feixe, de modo que reorientem a luz para um segundo plano de imagem na câmera CCD.Um par de espelhos e um segundo espelho dicróico direcionam os caminhos do feixe de forma que as duas imagens se recombinem e sejam projetadas lado a lado na câmera. Sensor CCD. Aqui está um exemplo da imagem resultante.Uma vez configuradas, as imagens podem ser ajustadas e ajustadas da seguinte maneira: mova a posição da câmera de forma que a imagem transmitida cubra metade do campo de visão da câmera. Mova a imagem refletida para cobrir a outra metade do campo de visão ajustando os dois últimos espelhos em seu caminho de feixe e otimize o foco movendo a segunda lente de relé para cada canal para frente e para trás ao longo do caminho do feixe. Adquira animais que expressem um fluoróforo sensível ao cálcio no neurônio de interesse do centro genético Citis ou de outras fontes.Alternativamente, construa animais transgênicos usando técnicas padrão de elgan de foca. Em seguida, use uma das seguintes técnicas para imobilizar a elegância do selo para paralisia farmacológica a 0,05% leal a 2% aros e faça almofadas de aros para imagens pressionando uma gota de aros derretido entre duas lâminas de vidro que têm dois pedaços de fita adesiva como espaçadores. Depois de remover a lâmina superior, escolha de cinco a 10 animais e transfira-os para a almofada.Cubra a almofada com uma lamínula e aplique pequenas quantidades de uma mistura quente de cera de parafina e vaselina nos cantos para mantê-la na posição. Aguarde de cinco a 10 minutos para que o lemisol faça efeito e os animais fiquem completamente imóveis. Para imobilizar animais usando um método aros rígido, faça almofadas de 10% aros.Adicione cerca de três microlitros de uma a 10 soluções de microesferas de poliestireno à superfície das almofadas e escolha rapidamente de cinco a 10 elegância do mar limpo na piscina de solução de beterraba. Cubra suavemente com uma lamínula e aplique cera derretida nos cantos. Experimentos típicos requerem a administração de um estímulo ou condição específica ao animal enquanto gravam em vídeo a resposta de um único neurônio.Para aquisição de vídeo. Freqüentemente, visualizamos a cerca de um quadro por segundo com cerca de 300 milissegundos de exposição. O vídeo deve ser analisado para medir a intensidade de fluorescência para cada quadro dentro da região de interesse ou ROI do neurônio imageado em relação a uma região de fundo próxima.Nosso programa de análise exibe uma imagem compactada de todas as imagens no filme, a partir da qual um limite aproximado que abrange o objeto de interesse em todos os quadros é selecionado manualmente e uma região de fundo independente é selecionada. Para o primeiro, um ROI é selecionado manualmente de dentro da região de limite. Para cada quadro subsequente, o programa seleciona os pixels mais brilhantes de dentro da região de limite para gerar um ROI do tamanho correto para imagens métricas de proporção geradas com camaleão, selecione um ROI aproximado e uma região de fundo semelhantes para cada uma das imagens ou canais duplos e, em seguida, o ROI de uma imagem no primeiro quadro, o sinal fluorescente F para cada quadro é calculado como a intensidade média de pixels no ROI menos a intensidade média na região de fundo.O nível relativo de cálcio para cada quadro é calculado como a variação percentual na intensidade normalizada para um valor inicial de linha de base medido a partir do primeiro quadro ou série de quadros. Os valores da métrica de proporção são calculados como a proporção dos dois canais. Uma ROI selecionada dentro do corpo celular gera os sinais mais fortes e robustos, mas também é possível selecionar e medir sinais de uma ROI ao longo dos processos nervosos.A exposição à luz de excitação pode causar branqueamento da flora quatro e é marcada por uma diminuição constante no sinal que depende dos níveis de exposição se ocorrer branqueamento. Reduza os tempos de exposição e/ou a intensidade de excitação com filtros de densidade neutra para minimizar o ruído criado pelo movimento da elegância do mar durante a gravação. Em resposta à exposição à luz e estímulos experimentais, execute cuidadosamente os procedimentos de imobilização usando preparações limpas.Para uma análise de imagem bem-sucedida, escolha regiões de fundo que sejam razoavelmente uniformes, mais escuras do que a imagem para o neurônio e suficientemente distantes para evitar a luz espalhada. Aqui é mostrado um único neurônio C elegance, A SJ expressando o acampamento G respondendo a um campo elétrico externo de três volts por centímetro por três tentativas separadas, cada uma com duração de 10 segundos. O animal foi imobilizado usando lemisol, mas o vídeo mostra pequenas falhas de movimento e foco.A intensidade de fluorescência de deriva foi medida no corpo celular. O sinal é robusto, apesar das falhas de vídeo mostrarem um grande aumento de cerca de 250% na fluorescência em resposta ao primeiro e ao terceiro estímulos. O resultado do segundo estímulo é substancialmente reduzido.A demonstração de variabilidade no branqueamento da resposta neuronal é mínima, como evidenciado pelo retorno a um nível basal consistente. A lesão celular traumática desencadeia um grande transiente de cálcio dentro de um neurônio que desempenha um papel essencial na resposta fisiológica da célula. Este vídeo mostra a resposta induzida por danos à ex-a laser de um único neurônio.Óptica de imagem dupla foi empregada para registrar sinais dos canais de fluorescência CFP e YFP do repórter camaleão. Esta figura mostra o sinal de traste resultante medido no corpo celular ao longo do experimento de cirurgia a laser. Em resposta ao dano do laser e um aumento no cálcio citoplasmático em T é igual a zero segundos.O CFP diminui rapidamente e o YFP aumenta, resultando em um aumento imediato de cerca de 200% no sinal métrico da proporção, que é sustentado por cerca de 90 segundos antes de voltar aos níveis próximos da linha de base. O branqueamento é mínimo, como fica evidente na linha de base consistente. Esta figura mostra o sinal de traste resultante medido no segmento do axônio próximo ao ponto de corte aqui.A quantidade local de flúor quatro varia ao longo do experimento. Para complicar o sinal, a cirurgia a laser corta o axônio e rompe brevemente a membrana, permitindo que a flora escape e reduzindo temporariamente sua concentração citoplasmática local. Isso é evidente a partir de uma diminuição inicial no traço YFP em pontos posteriores.A extremidade cortada incha como parte de sua recuperação contínua, resultando em mais flúor quatro localizado e um aumento na intensidade. Isso é mais evidente no traço CFP que aumenta lentamente, no entanto, essas variações afetam ambos os canais igualmente e a taxa de traste compensa efetivamente o fornecimento de um sinal robusto. A medição resultante mostra uma resposta semelhante ao corpo celular com um aumento imediato de cerca de 150% no sinal, uma recuperação dramática para perto da linha de base em cerca de 90 segundos e, em seguida, uma resposta secundária menor adicional em cerca de 150 segundos.Acessórios de microscópio comercial para imagens métricas de proporção estão disponíveis, assim como softwares de análise de imagem mais sofisticados que geram medições métricas de proporção pixel a pixel Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser feitas com relativa facilidade e sem as complicadas técnicas de dissecção de tecido ou imagem de preparação de amostras exigidas por outros sistemas ou métodos de modelo. Experimentos inteiros podem ser executados em questão de uma ou duas horas, se realizados corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como imobilizar a elegância para imagens, realizar uma cópia máxima de vídeo em neurônios individuais in vivo e analisar o vídeo resultante para medir os níveis relativos de cálcio com base no neurônio.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo apresenta os conceitos por trás da imagem de cálcio e inclui um protocolo de exemplo para imagem de lapso de tempo de vermes contidos em poços de agarose moldados.

Imagem de cálcio: um método para visualizar a atividade neural em C. elegans vivos

Este vídeo demonstra uma técnica para imagens de cálcio em neurônios individuais de Caenorhabditis elegans em comportamento usando proteínas repórteres fluorescentes geneticamente codificadas. Ele descreve as etapas envolvidas na imagem do movimento do verme e na medição das taxas de fluorescência repórter dos neurônios para correlacionar os níveis de cálcio intracelular com a atividade neuronal e as mudanças comportamentais durante a postura dos ovos.

Imagem de cálcio em neurônios individuais que regulam o comportamento de postura de ovos em Caenorhabditis elegans

Fonte: Doser, R., et al. Imagem subcelular do manuseio de cálcio neuronal in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Este vídeo demonstra imagens in vivo do fluxo de cálcio subcelular nos neurônios do cordão nervoso ventral de cepas transgênicas de Caenorhabditis elegans. Dois indicadores distintos de cálcio são empregados: um indicador citoplasmático em uma cepa e um indicador mitocondrial em outra. Os neurônios são observados sob um microscópio de fluorescência para monitorar mudanças em tempo real na...

Imagem da dinâmica do cálcio subcelular em neurônios de Caenorhabditis elegans

Comportamento de imagem e atividade neural em longas escalas de tempo sem imobilização do animal é um pré-requisito para entender o comportamento. A imagem das câmaras microfluídicas de agarose (IAM) pode ser usada para obter imagens da atividade neural e do comportamento de todos os estágios da vida de Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Este protocolo descreve o uso de geneticamente codificado Ca2 + repórteres para alterações de registro da atividade neural em se comportando vermes Caenorhabditis elegans .

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

Este método fornece uma maneira de acoplar optogenetics e de sensores genetically codificados do cálcio aos níveis citosónicos da imagem basal do cálcio e às mudanças em transientes evocados do cálcio nos músculos da parede do corpo do modelo C. elegansdo organismo.

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

Relatado aqui é um sistema de imagem de cálcio em se comportar livremente Caenorhabditis elegans com vibração bem controlada e não localizada. Este sistema permite que os pesquisadores evoquem vibrações não localizadas com propriedades bem controladas no deslocamento em nanoescala e quantifiquem as correntes de cálcio durante as respostas de C. elegans às vibrações.

Imagem de cálcio em caenorhabditis livremente comportada elegans com vibração bem controlada e não localizada

As espinhas dendríticas são características celulares importantes do sistema nervoso. Aqui são descritos métodos de imagem vivos para avaliar a estrutura e a função dos espinhos dendríticos em C. elegans. Essas abordagens apoiam o desenvolvimento de telas mutantes para genes que definem a forma ou a função da coluna dendrítica.

Imagem de espinhas dendríticas em Caenorhabditis elegans

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Aqui, apresentamos protocolos e ferramentas para visualizar o cálcio durante a fertilização e embriogênese inicial usando um repórter de cálcio geneticamente codificado expresso na linha germinativa do nematóide modelo C. elegans.

Visualização in vivo de transientes de cálcio durante a fertilização e desenvolvimento inicial em C. elegans

Aprenda a medir dinâmicas de cálcio em neurônios individuais de C. elegans usando indicadores fluorescentes geneticamente codificados. Esta técnica de imagem in vivo permite analisar respostas neuronais a estímulos sensoriais e danos celulares de forma simples e econômica.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

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