Name: Isolamento eficiente e rápida de embriões em início de carreira a partir de Arabidopsis thaliana Sementes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprenda a isolar embriões jovens de Arabidopsis thaliana de forma eficiente e rápida. Este método permite obter até 40 embriões em 1 a 4 horas para análises de RNA, DNA e estudos citológicos.

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Gostaríamos de agradecer Tal Nawy e Martin Bayer para os seus conselhos sobre o isolamento do embrião. MTR, VG, UG e CB inventou o equipamento de isolamento de embriões. MTR, VG e CB desenvolveu o protocolo de isolamento de embriões. MTR, VG e CB estabelecido o protocolo, isolado dos embriões, e embrião gerado cDNA, VG realizada a PCR, MTR a coloração GUS, JJ experimentos os peixes. MTR, VG, CG e UG escreveu o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Zurique, uma bolsa da Fundação Roche Research (a MTR), e doações da Fundação Nacional da Suíça (para UG e CB).

O procedimento está resumido no diagrama de fluxo mostrado na Figura 1. O microcapilares e a configuração instrumentais são apresentados na Figura 2 e Figura 3, e os passos típicos de isolamento de embriões são mostrados na Figura 4. 1. Material e Preparação de buffer 1,1 Silício revestimento de vidro microcapilares <ol><li> Coloque a microcapilares em um tubo Falcon de 15 ml com ~ 5 ml de Sigmacote (Sigma) e gire várias vezes. </li><li> Remover a solução, colocar um tubo Falcon contendo os capilares numa folha de alumínio e cozer durante 3 horas a 60 ° C. Guarde à temperatura ambiente. </li></ol> 1.2 Obter ~ 50-100 micrometros de diâmetro dicas microcapilares <ol><li> Puxe um milímetro de diâmetro capilares de vidro manualmente ao longo de um bico de Bunsen ou usando um extrator comercial (vertical puxador de filamento ou micropipeta extrator). </li><li> Use um diamantecaneta de ponta ou lâmina para cortar a extremidade do capilar puxado para criar a abertura desejada. Selecione a melhor forma de capilares sob um microscópio estéreo. A abertura deve ser de 50-100 mM (Figura 2). </li></ol> 1.3 Preparação da lâmina <ol><li> Siliconize lâminas limpas, cobrindo todos os poços com Sigmacote (~ 1 ml / lâmina), durante 5 minutos, remover. Asse 3 hr em papel alumínio. Guarde à temperatura ambiente. </li><li> Lavar os múltiplos poços lâminas microscópicas de vidro durante 10 min em SDS a 10%, 2 x 2 minutos em água livre de nuclease (autoclavado DEPC ddH2O), 2 min em etanol a 70%, 2 minutos em etanol a 100%, com ar- secar. Todas as etapas são feitas em frascos autoclavados Coplin. As lâminas podem ser reutilizados várias vezes proporcionando limpeza completa entre cada uso. </li><li> Pouco antes do isolamento propagação embrião ~ 0,5 l de 10 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA), com uma pipeta ao longo de toda a superfície de cada poço e ar seco. </li></ol> 1.4 Microscópio e configuração capilar &lt;ol&gt; <li> Use um microscópio invertido com uma objetiva de 20x e 10x. Otimizar o contraste de luz (embriões são bastante transparente). </li><li> Coloque um micromanipulador para segurar o capilar de vidro, ao lado do microscópio. O capilar de vidro, está ligado a um microinjector (Figura 3A) ou para um P-200 pipeta regularmente através de um tubo de borracha (Figura 3B, ver a discussão para uma descrição detalhada desta configuração). </li><li> Colocar o tubo capilar acima da lâmina de microscópio com um ângulo de ~ 70 ° (figura 3) e ajustar a posição de ter a abertura no campo de visão. </li><li> Pouco antes do isolamento do embrião tomar-se e libertar ~ 5-10 ul de BSA (1 mg / ml) para revestir o capilar. </li></ol> 1,5 Buffers A Tabela 1 lista os buffers de isolamento e de destino, dependendo das aplicações a jusante. <ol><li> Prepare ~ 1 ml de tampão de isolamento por amostra imediatamente antes da utilização e mantenha-o no gelo. </li><li> Prepare o buffer de destino em um ml tubo de baixa ligação 0,5 Eppendorf no gelo (aplicações moleculares) ou em uma lâmina de microscópio (aplicações citológicas) em uma câmara úmida. </li></ol> 2. Dissecção sementes e extração de embriões 2.1 Sincronização de desenvolvimento da semente <ol><li class="jove_content"> Emasculate flores e mantê-los 2 dias em câmara de crescimento, evitando o contacto dos pistilos expostas com outras flores, então polinizar deles (por exemplo, 11). </li><li class="jove_content"> Teste o estágio de desenvolvimento em suas condições de crescimento por meio de investigação microscópica de sementes limpas. Com as nossas condições de crescimento (16 horas de luz a 21 ° C, 8 horas escuro, a 18 ° C e 70% de humidade), as sementes recolhidas 2,5 dias após a polinização (DAP) rendeu principalmente 2-4 embriões de células e as sementes colhidas 3,5-4 DAP rendeu globular embriões. </li></ol> 2.2 Dissecção de Sementes e Rupture <ol><li> Remover a sEEDS 10-15 siliques (~ 2,5 DAP) sob um microscópio estereoscópico com uma pinça e agulhas de insulina. </li><li> Mergulhar as sementes em 20 ul de tampão de isolamento, em 2 ml de um tubo de fundo redondo de Eppendorf colocada em gelo. </li><li> Suavemente esmagar as sementes com um pilão de plástico (pré-lavado com 10% de SDS, enxaguado com DEPC ddH2O e lavou-se com etanol a 70%) para libertar os embriões até o extracto de semente é turvo. A força a aplicar é determinada pelo utilizador, a cada ensaio. </li><li> Lavar o almofariz com 300 ul de tampão de isolamento para lavar o pilão e diluir a amostra. </li><li> Spin-se o extrato a 5.000 xg por 5 seg. Delicadamente ressuspender o extrato sedimentados por pipetagem cima e para baixo 2-3 vezes. </li><li> Filtrar o extracto com uma malha de nylon de 30 um (montado em adaptadores de tubos, por exemplo, a partir de PartecCelltricks). Lavar a malha com um tampão de isolamento adicional de 200 ul. </li></ol> 3. Isolamento embrião 3.1 Preparação da lâmina <ol> &lt;li&gt; Coloque um pano limpo, multi-slides bem BSA-revestido e siliconizada no palco do microscópio invertido, ressuspender o extrato de semente de filtrada com cuidado pipetando cima e para baixo e pipetar 2 gotas de extrato de semente de 40-50 mL em um ou dois poços . Screening apenas 1 ou 2 gotas de cada vez evita a evaporação da amostra. </li><li> Transferem-se 50 ul de tampão de isolamento fresco (1 gota de lavagem r) num poço de uma lâmina diferente preparada como antes. Manter este slide em uma coberta, câmara úmida para evitar a evaporação. </li></ol> 3.2 tela, limpar, recolher <ol><li> Tela de gotas de extrato de semente de embriões no estágio desejado com o objetivo de ampliação de 10x. Se necessário, confirmar o palco com a ampliação de 20x. Os embriões geralmente descem para o fundo do slide. </li><li> Remover manualmente os restos em torno do embrião com uma agulha de tungstênio, uma agulha de insulina ou equipamento similar. </li><li> Mover o vidro capilar próximo do embrião utilizando o micromanipulador, take-se o embrião com tão pouco quanto possível solução. </li><li> Colete vários embriões (por exemplo, todos uma gota) e liberá-los no gota de lavagem 1 º (aplicação molecular) ou no buffer de destino (aplicações citológicos). Cada rodada coleta deve ser mantido dentro de 5-10 min e embriões devem ser coletadas em um volume mínimo (o volume total de todas as rodadas de coleta deve ser &lt;5 mL). </li><li> Repita a triagem e recolha até a quantidade desejada de embriões é recolhida no r gota uma lavagem (centralmente, se possível, para facilitar a recordação). </li><li> Recordar todos os embriões de uma só vez a partir da queda de lavagem (se os restos são transportados, retire-os com uma agulha antes de recordação). </li><li> Solte os embriões em uma gota de lavagem 2 º de 50 l. Repita 3.2.6. </li><li> Solte os embriões no buffer de destino. A transferência deve envolver apenas um contato, e não de imersão, da ponta do capilar. </li><li> Substitua o microcapilLary para a próxima amostra. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Foi desenvolvido um protocolo de isolamento do embrião, que é rápida, eficaz, e pode ser facilmente transferido para outros laboratórios. O equipamento aqui descrito é composto por um microscópio invertido, um micromanipulador, vidro microcapilares, um puxador de filamento vertical e um microinjector (Figura 3A). A instalação é semelhante à descrita para o isolamento única célula animal para análises transcriptomics 17. Também trabalhou com sucesso com uma configu...

O embrião de plantas floridas está rodeado pelo endosperma, um tecido nutritivo derivado de um segundo evento de fertilização. Ambos embrião e endosperma está cercado por várias camadas de células do tegumento. Colectivamente estes tecidos formar uma semente, que se desenvolvem no interior do fruto. Assim, tecidos e análises específicas de células de embriões de Arabidopsis são fortemente prejudicada devido a sua inacessibilidade. No entanto, os embriões nas fases de fim de globulares ou mais tarde, são relativamente bem passível de dissecção manual utilizando agulhas finas de tungstênio sob o microscópio estereoscópico, ou com uma ligeira pressão sobre a semente, usando uma pinça para extraí-los. Tais técnicas foram utilizadas com sucesso para transcriptoma ou análises de perfis epigenoma como hibridização microarray, sequenciamento bissulfito, ou RNA seqüência (por exemplo, 1-3). Em contraste, os estudos de embriões no zigoto até a fase globular cedo permanecem tecnicamente desafiador. Até o momento, poucos estudos têm repanálises de transcriptoma orted sobre jovens embriões usando tanto microdissection de captura a laser (LCM) de tecidos embrionários de sementes seções fixas quatro ou extração manual dos embriões individuais a partir de sementes, utilizando ferramentas finas 5. No entanto, o equipamento GCV não é vulgarmente disponíveis e extracção manual do embrião em fases iniciais é demorado e que exige excelentes capacidades de dissecação que não são facilmente transferíveis. Em adição à análise de todo o genoma, em análises de expressão de genes in situ também são difíceis de executar em jovens, conjunto de montagem em embriões de Arabidopsis. Em certa medida, os embriões jovens pode ser libertado em lâminas de microscópio por uma suave pressão sobre as sementes e utilizada para os ensaios de gene repórter ou de detecção de proteínas por coloração imunológica (por exemplo, ver 6,7). Esta técnica, no entanto, não permitir o isolamento de embriões de alto rendimento, impedindo assim as análises quantitativas. Por isso, desenvolvemos um protocolo eficiente e rápidapara o isolamento de embrião a partir de sementes de Arabidopsis que é simples de configurar, facilmente transferíveis, e apropriado para uma variedade de aplicações a jusante. O princípio básico consiste em triturar suavemente sementes - dissecada jovens siliques em um tubo Eppendorf utilizando um pilão de plástico num tampão de isolamento adequado. O extracto de semente é colocada em gotas sobre uma lâmina de multi-poços e é pesquisado quanto à presença de embriões libertados na fase desejada usando um microscópio invertido. Os embriões são coletados por meio de um vidro microcapilar ligado a um microinjetor ou uma pipeta de laboratório padrão. Para aplicações moleculares, os embriões são lavados duas vezes por libertação repetida em gotas de novo tampão de isolamento antes de transferi-los para o buffer de destino num volume mínimo. Para aplicações citológicos (ensaios repórter, positividade, peixe), as etapas de lavagem pode ser omitido. O método oferece várias vantagens: (i) produz 25-40 embriões em ~ 45 min para aplicação citológicocações ou em 3-4 hr para aplicações moleculares (incluindo as etapas de lavagem), (ii) que permite o isolamento de estágios embrionários específicas, (iii) é facilmente transferível para outras pessoas e laboratórios, devido à sua configuração simples, (iv) requer equipamento acessível para a configuração básica, que é passível de upgrades, e (v) foi usado com sucesso por várias aplicações a jusante, como RNA seqüenciamento 8, a análise de DNA-metilação-específica gene 9, ensaios repórter (10 e Raissig et al., em prep.) e FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inédito, ver Figura 5).

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>SIGMA</td><td>SL2-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>First- strand buffer</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>18064-022</td><td>contido no pacote Superscript II</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>18064-022</td><td>contido na embalagem Superscript II</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA) 100x = 10 mg / ml </td><td>New England Biolabs Inc.</td><td></td><td>Diferentes fornecedores também trabalharão </td></tr><tr><td>Capilares de parede fina 1,0 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind tubo 0,5 ml</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>0030108.035</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics&#916; 30 &#956; m</td><td>PARTEC</td><td>04-0042-2316</td><td></td></tr><tr><td>5 poços 10 mm de diâmetro lâminas</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>63421-10</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slide</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&#228; ser</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Fluka</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>Micro Pilão</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de insulina microfina</td><td>BD</td><td>U-100</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps N5</td><td>Dumont</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalisador Pico Chip Agilent</td><td>Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Nikon TMS (Japão),</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Micromanipulador</td><td>Leitz</td><td></td><td>Leica</td></tr><tr><td>Micomanipulator Sonda pós-montagem LH1</td><td>Leica microsystems</td><td>39430101</td><td>Marca diferente também fará o trabalho</td></tr><tr><td>Extrator de filamento vertical</td><td>Instrumento Sutter</td><td>modelo P-20</td><td>Outro modelo também é adequado </td></tr><tr><td>Cell Tram vario</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>5176.000.033</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Invitrogen (tecnologias</td><td></td><td></td> de vida</tr></tbody></table>

isolamento eficiente e rápida de embriões em início de carreira a partir de<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; sementes

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Em plantas com flores, o embrião se desenvolve dentro de um tecido nutritivo - o endosperma - cercado pelos tegumentos de sementes maternas (ou tegumento). Como consequência, o isolamento de embriões de plantas em fases iniciais (1 célula para a fase globular) é tecnicamente difícil devido à sua relativa inacessibilidade. Dissecção Manual eficiente em fases iniciais é fortemente prejudicada devido ao pequeno tamanho dos jovens de sementes de Arabidopsis e a adesividade do embrião para os tecidos circundantes. Aqui, nós descrevemos um método que permite o isolamento eficiente de embriões jovens de Arabidopsis, originando até 40 embriões em 1 hora e 4 horas, dependendo da aplicação a jusante. Os embriões são libertados no tampão de isolamento por esmagamento ligeiramente 250-750 sementes com um pilão de plástico num tubo Eppendorf. Um copo microcapilar ligado a qualquer uma pipeta padrão de laboratório (através de um tubo de borracha) ou de um microinjetor controlada hidraulicamente é usado para coletar embriões de lugar gotículasd numa lâmina de multi-poços em um microscópio óptico invertido. As competências técnicas necessárias são simples e facilmente transferível, ea configuração básica não requer equipamento caro. Os embriões recolhidos são apropriados para uma variedade de aplicações a jusante, tais como RT-PCR, o RNA de sequenciação, análise de metilação de ADN, hibridação in situ fluorescente (FISH), a imunocoloração, e ensaios de gene repórter.

O processo de isolamento do embrião (Figura 1) permite o isolamento de até 40 embriões em 4 horas, se as lavagens são realizadas, por exemplo, para aplicações moleculares, ou em menos de uma hora, se as lavagens são omitidos, por exemplo, para aplicações citológicos. Figura 2 exibe alta e baixa dicas microcapilares qualidade e A Figura 3 mostra a configuração da máquina de isolamento do embrião. Figura 4 mostra o processo de isolamento...

Nós relatamos um método eficiente e simples para isolar os embriões em estágios iniciais de desenvolvimento de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sementes. Até 40 embriões podem ser isolados em 1 hora a 4 horas, dependendo da aplicação a jusante. O procedimento é adequado para transcriptoma, a metilação do DNA, a expressão do gene repórter, imunomarcação e fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Análises de hibridização.

Isolamento eficiente e rápida de embriões em início de carreira a partir de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sementes

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar embriões de plantas jovens. Isso é feito dissecando primeiro as sementes. O segundo passo é esmagar suavemente as sementes em um tampão de isolamento.Em seguida, os embriões são rastreados e coletados por microaspiração em microscópio invertido. A etapa final é coletar todos os embriões em um volume mínimo após a lavagem e transferi-los para o tampão de destino. Em última análise, os embriões podem ser usados para extração de RNA ou DNA para analisar o transcriptoma ou epigenoma, ou usados para análises citológicas, como ensaios de repórter de genes ou hibridização in situ fluorescente.A principal vantagem desta técnica é poder isolar embriões de plantas em massa e em estágios específicos de desenvolvimento. Geralmente, os indivíduos novos neste método não terão problemas para aplicá-lo de forma rápida e eficiente. Para começar, selecione os capilares com melhor formato sob um microscópio estéreo que foram previamente siliconizados, puxados e cortados.Conforme descrito no protocolo de texto, a abertura deve ser lisa e em torno de 50 a 100 mícrons. Em seguida, lave as lâminas de microscópio de vidro multipoços siliconizadas em frascos de coplin por 10 minutos em 10% SDS após a lavagem com detergente. Lave as lâminas duas vezes por dois minutos.Em água livre de nuclease por dois minutos em etanol a 70% por dois minutos em etanol a 100% e depois ao ar seco. Em seguida, espalhe cerca de 0,5 microlitros de 10 miligramas por mililitro, albumina de soro bovino ou BSA com uma pipeta sobre toda a superfície de cada poço e seque ao ar. Em seguida, prepare o microscópio de isolamento de embriões.Use um microscópio invertido com uma objetiva de ampliação de 10 x e 20 x. Conecte o capilar de vidro a um microinjetor para revestir o microcapilar. Pegue cerca de seis microlitros de BSA e solte-o.Colete sleeks no estágio desejado de desenvolvimento, seguindo cruzamentos ou solas de autofecundação. 2,5 dias após a polinização são usados aqui e contêm de dois a quatro embriões celulares. Remova as sementes de 10 a 15 LICs sob um microscópio estéreo com pinça e insulina. Agulhas.Mergulhe as sementes em 20 microlitros de tampão de isolamento em um tubo de fundo redondo de dois mililitros colocado no gelo. Esmague suavemente as sementes com um pilão de plástico pré-limpo, conforme descrito no protocolo de texto, para liberar os embriões até que o extrato da semente fique turvo. A força a ser aplicada deve ser determinada por cada usuário no julgamento.Enxágue o pilão com 300 microlitros de tampão de isolamento para lavar o pilão e diluir a amostra. Centrifugar o extracto a 5 000 chi durante cinco segundos após a centrifugação. Ressuspenda suavemente o extrato peletizado pipetando para cima e para baixo duas a três vezes.Filtre o extrato com uma malha de náilon de 30 mícrons montada em adaptadores de tubo e balance o tubo. Enxágue a malha com mais 200 microlitros de isolamento, tampão e balanço. Outra vez. Para preparar lâminas para isolamento de embriões, coloque uma lâmina limpa de vários poços revestida com BSA e siliconizada no palco do microscópio invertido.Coloque o capilar acima da corrediça e ajuste a posição para ter a abertura no campo de visão. Após Resus, suspendendo o extrato de semente filtrado pipetando suavemente para cima e para baixo pipeta duas gotículas de 40 a 50 microlitros de extrato de semente em um ou dois poços. Peneirar apenas uma ou duas gotas de cada vez, evita a evaporação da amostra coloque 50 microlitros de tampão de isolamento fresco em um poço de uma lâmina diferente preparada como antes.Para servir como a primeira gota de lavagem. Mantenha esta lâmina em uma câmara úmida coberta para evitar a evaporação. Examine as gotículas de extrato de semente para embriões no estágio desejado com a objetiva de ampliação de 10x, se necessário.Confirme o estágio com a ampliação de 20x. Os embriões geralmente afundam no fundo da lâmina. O aspecto mais importante deste procedimento é coletar embriões com o mínimo de detritos.Isso pode ser conseguido limpando com uma agulha de tungstênio, controlando cuidadosamente a gota de lavagem para possíveis detritos de transporte e repetindo wass, se necessário. Remova manualmente os detritos ao redor do embrião com uma agulha de tungstênio, uma agulha de insulina ou equipamento semelhante. Mova o capilar de vidro para perto do embrião usando o micromanipulador e pegue o embrião com o mínimo de solução possível.Colete vários embriões e solte-os na primeira lavagem. Deixar cair. Para aplicações moleculares para aplicações citológicas, os embriões podem ir diretamente para o tampão de destino. Cada rodada de coleta deve ser mantida dentro de cinco a 10 minutos, e os embriões devem ser coletados em um volume mínimo.Repita a triagem e a coleta até que a quantidade desejada de embriões seja coletada na primeira gota de lavagem. Se os detritos forem transportados para a gota de lavagem, remova-os com uma agulha antes de coletar todos os embriões de uma vez da gota. Solte os embriões em uma segunda gota de lavagem de 50 microlitros e repita a lembrança.Finalmente, libere os embriões no tampão de destino. A transferência deve envolver apenas um contato e não a imersão da ponta capilar mostrada. Aqui estão vários embriões na última gota após as lavagens.Os embriões de plantas isoladas agora podem ser usados para várias aplicações a jusante para controlar o CD NA embrionário. Bibliotecas antes do sequenciamento. Os transcritos específicos do embrião foram amplificados mostrados. Aqui estão os resultados da amplificação por PCR no CD NA. Bibliotecas de dois a quatro embriões celulares lavados uma vez, e no DNA genômico o isolamento de embriões provou ser muito útil em ensaios de genes repórteres com baixa expressão embrionária e onde o tegumento materno confunde a detecção mostrada aqui é um embrião expressando um gene repórter GUS sob o controle do promotor Madea.Finalmente, a hibridização fluorescente em C dois foi aplicada para estudar a arquitetura nuclear em embriões isolados embebidos em almofadas de acrilamida em lâminas. Um exemplo usando sondas contra as repetições do centrômero e as regiões nucleares de organização inferior é mostrado aqui. Uma vez dominada, esta técnica permite o isolamento de 30 embriões em menos de uma hora para aplicações citológicas, e em menos de três horas para aplicações moleculares, incluindo todas as etapas de lavagem.Na verdade, essa técnica permitirá que a comunidade de pesquisa de plantas explore mecanismos genéticos e epigenéticos na embriogênese.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo mostra um procedimento para isolar protoplastos intactos a partir de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis. Dado que o protoplastos isolados permanecem intactos por pelo menos 96h e são isoladas de mudas, em vez de um mês de idade plantas maduras, esse procedimento agiliza ensaios exigindo protoplastos intactos.

Isolamento de Protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis thaliana</em

Imprinting é um fenômeno em plantas e da reprodução de mamíferos. Metilação do DNA desempenha um papel importante nos mecanismos de imprinting. Isolando endosperma e determinação do estatuto de metilação de genes imprinted...

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A Brasão Cama Ensaio de Sementes para explorar Geneticamente<em&gt; In Vitro</em&gt; Como a germinação Controles do endosperma das sementes em<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

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