Isolamento de microrganismos do solo nativas com potencial para romper as biodegradáveis ​​Palha filmes plásticos usados ​​na agricultura

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar fungos e bactérias do solo que colonizam e degradam filmes de cobertura morta biodegradáveis. Isso é conseguido primeiro incubando filmes de cobertura morta biodegradáveis em sacos de malha no solo por tempo suficiente para permitir uma colonização substancial por micróbios nativos do solo. Após a incubação, as coberturas mortas são extraídas e diluídas, o que produz colônias isoladas únicas de cada tipo cultivável de micróbio intimamente associado.

Em seguida, micróbios isolados são remendados em superfícies frescas, desinfestadas e biodegradáveis, bem como em placas de ágar com ou sem fonte de carbono. Para comparar o crescimento, os resultados são confirmados em meio líquido. Os resultados mostram colonização e/ou degradação por certos isolados com base em microscopia eletrônica de varredura e podem ser verificados por cromatografia de permeação em gel.

Não se esqueça de que trabalhar com isolados de fungos e bactérias não identificados pode ser perigoso, e precauções devem sempre ser tomadas ao realizar esse procedimento, como usar luvas, selar tubos e pratos de cultura e trabalhar em um gabinete de biossegurança. Depois de incubar pedaços de cobertura morta no solo e preparar meios e reagentes de acordo com o protocolo de texto, corte novos pedaços de cobertura morta em quadrados de 4,25 centímetros para descontaminar os pedaços de cobertura morta. Autoclave-os se não os alterar ou degradar para peças de cobertura morta não autoclaváveis, como as feitas de plástico.

Depois de preparar um gabinete de biossegurança de acordo com o protocolo de texto, coloque os pedaços de cobertura morta no exaustor descontaminado em fileiras e incube os pedaços de cobertura morta sob luz ultravioleta por duas horas, usando uma pinça esterilizada limpa e começando com a primeira fila e trabalhando para trás para evitar colocar as mãos e os braços sobre as superfícies recém-descontaminadas. Vire os pedaços de cobertura morta, colocando o lado desinfestado para baixo em uma área limpa, exposta à luz ultravioleta, mas não previamente em contato com a cobertura morta. Após duas horas de tratamento UV de cada lado, novamente, trabalhando da frente para trás.

Use uma pinça estéril para remover os pedaços de cobertura morta do gabinete de biossegurança e coloque-os em recipientes estéreis cobertos a seco, como copos cobertos com papel alumínio. Armazene-os em temperatura ambiente na escuridão sob uma capa de transferência estéril. Usando a técnica asséptica, coloque os pedaços de cobertura morta desinfestados de UV na superfície das placas de ágar, colocando um canto primeiro e suavemente, deixando o restante do quadrado rolar em contato com o ágar.

Para filmes não permeáveis à água, coloque quatro gotas de 10 microlitros de meio semi-sólido fundido e mínimo sobre os cantos dos pedaços de cobertura morta para fornecer uma fonte de água e nutrientes para a colonização inicial de plásticos hidrofóbicos. Não toque na superfície das peças de cobertura morta. Com a ponta da pipeta, as gotas endurecerão em contas.

Incube as placas cobertas na vertical durante a noite em temperatura ambiente para solidificar. Em seguida, armazene as placas com o lado do ágar voltado para cima no escuro a quatro graus Celsius. Todos os materiais necessários para os bioensaios estão agora preparados e você está pronto para iniciar o isolamento de potenciais fungos degradadores de cobertura morta de pedaços de cobertura morta que foram enterrados no solo.

Desenterre sacos de malha do solo e remova pedaços de cobertura morta dos sacos de malha. Use uma espátula estéril e uma pinça para remover suavemente o excesso de sujeira das coberturas mortas sem perturbar o solo que está agarrado à superfície. Corte o filme BDM em pedaços quadrados de um centímetro até que 0,5 gramas de material sejam recuperados.

Para cada transferência de amostra replicada, 0,5 gramas de pedaços de cobertura morta e solo anexado em 25 mililitros. Tubos de cultura contendo 9,5 mililitros de PBS adicionam 0,5 gramas de solo apenas aos tubos de controle do solo ou a amostras onde a cobertura morta é completamente degradada para quebrar quaisquer biofilmes e separar as células dos pedaços de cobertura morta. Vortex os tubos por 30 segundos em alta velocidade, depois sonicá-los em banho-maria por 10 minutos e vorticá-los novamente.

Isso deve produzir uma suspensão homogênea de células microbianas associadas aos pedaços de cobertura morta. Para uma diluição em série de amostras. Prepare um tubo de cultura com 4,5 mililitros de PBS estéril e encha três poços de uma placa de poço profundo com 450 microlitros de PBS por amostra dos tubos originais de suspensão.

Transfira 0,5 mililitros para os 4,5 mililitros de PBS estéril para obter uma terceira diluição de 5,0 vezes 10 para a terceira diluição negativa após vórtice em alta velocidade por 30 segundos, adicione 50 microlitros para 450 microlitros de PBS na mistura de placas de 96 poços pipetando suavemente para cima e para baixo 10 vezes repita até que diluições de até 5,0 vezes 10 para os seis negativos estejam completas. Use hastes de vidro dobradas esterilizadas por chama para espalhar uniformemente 100 microlitros de cada uma das diluições na superfície do ágar das placas de PDA que contêm cloranfenicol para inibir o crescimento bacteriano. Guarde os pratos na vertical por 30 minutos para deixar o líquido penetrar.

Em seguida, sele as placas com paraforme para evitar que os esporos escapem de isolados não identificados. Incube placas invertidas a 20 graus Celsius na escuridão por cinco dias para permitir que fungos de crescimento rápido e lento formem colônias em um gabinete de biossegurança. Examinar as placas de diluição para colónias isoladas com um único palito esterilizado.

Toque suavemente uma colônia e, em seguida, toque o ágar de meio mínimo fúngico, meio mínimo fúngico mais plástico e placas de meio mínimo de glicose para inocular grânulos de ágar sobre filmes plásticos. Esfregue o palito suavemente na superfície do ponto de ágar e passe-o pelo filme plástico. Repita a inoculação da mesma colônia de origem até que haja quatro.

Replique as listras em cada placa depois de incubar as placas a 20 graus Celsius no escuro por cinco dias. Compare as placas para identificar os isolados que crescem em pedaços de cobertura morta melhor do que em meio mínimo sem adição de carbono além do ágar. Estes são potenciais degradadores de cobertura morta.

A placa GMM deve conter o maior crescimento, pois é uma placa de controle positivo na qual o meio contém glicose. Os isolados de solo podem não ser totalmente puros neste momento, então use um palito de dente estéril para raspar o inóculo do fungo, colonizando a cobertura morta e risque-a para isolamento em ágar dextrose de batata, depois sele a placa e incube por cinco dias. Após a incubação de cinco dias, colônias isoladas terão surgido.

Confirme se essas novas colônias purificadas mostram colonização de cobertura morta no bioensaio em placa semelhante àquela observada com os isolados potencialmente impuros originais. Uma vez que os potenciais degradadores de cobertura morta tenham sido identificados pelo bioensaio em placa, verifique usando um bioensaio líquido neste ensaio confirmatório final, até mesmo o ágar está faltando sob a cobertura morta. As peças são realmente a única fonte de carbono para o crescimento microbiano neste meio rigorosamente preparado para iniciar o ensaio em uma peça de cobertura morta desinfestada de superfície para um meio fúngico sem qualquer outro carbono adicionado para cada réplica de um isolado microbiano.

Prepare três tubos para inoculação. Um, um tubo experimental com cinco mililitros de meio mínimo aqui rotulado FMM contendo um pedaço de cobertura morta do tamanho predeterminado. Dois, um controle negativo com cinco mililitros de meio mínimo sem fonte de carbono.

E três, um controle positivo com cinco mililitros de líquido contendo glicose. Aqui rotulado GMM. Além disso, prepare um tubo replicado de meio mínimo contendo cada cobertura morta a ser testada, mas não a inocule.

Este tubo de controle revelará qualquer crescimento microbiano resultante da contaminação após o crescimento e coleta de esporos frescos. De acordo com o protocolo de texto, em uma capa de transferência estéril, inocule os tubos de cultura previamente preparados com um milhão de esporos ou células de levedura, sele as tampas e incube no escuro sem tremer a 20 graus Celsius. Observe as amostras semanalmente para crescimento.

O crescimento micelial de fungos em pedaços de cobertura morta pode ser visível na primeira semana após a inoculação, especialmente nas bordas dos pedaços de cobertura morta para o crescimento de levedura planctônica monitorar o crescimento por leituras de densidade óptica a 600 nanômetros porque os fungos filamentosos provavelmente se ligam diretamente aos pedaços de cobertura morta. Avaliar o crescimento a olho nu e confirmar por microscopia de luz e/ou microscopia eletrónica de varrimento apenas em meios mínimos. Procure por minúsculos flex brancos que são muito pequenos para registrar uma mudança na densidade óptica.

Usando métodos espectrofotométricos. Use uma pipeta paster para aspirar o flex e observe-os usando interferência diferencial. Microscopia de contraste após isolar três potenciais isolados degradadores de cobertura morta no bioensaio de placa de uma cobertura celulósica chamada proteção contra ervas daninhas plus, que foi nosso controle positivo, e uma cobertura plástica à base de amido chamada Biore.

Eles foram incubados no bioensaio líquido por 68 dias e colhidos antes de serem submetidos à microscopia eletrônica de varredura. Como esperado. A hifia fúngica foi observada em todas as amostras, exceto XX e YY, onde células em forma de bastonete foram observadas para os isolados em nossa cobertura morta de controle de celulose.

Nenhum crescimento foi observado nos controles apenas do FMM, como mostrado aqui nos controles inoculados da ONU para o protetor de ervas daninhas mais cobertura morta elementos residuais da traqueia das fibras derivadas de plantas foram detectáveis apenas como uma leve marcação de pock vista em fileiras em algumas das fibras, embora hifia fúngica tenha sido observada em todas as três amostras inoculadas de nossa cobertura morta de controle de celulose. Os elementos da traqueia eram claramente visíveis apenas nas amostras de SS, sugerindo que a digestão do material celulósico revelou que os elementos lignificados da traqueia abaixo do isolado SS foram provisoriamente identificados usando 18 s ribossômico, DNA como um refrigerante mye dentro da ordem de refrigerantes para a cobertura plástica à base de amido. Isolados nenhum crescimento significativo foi observado no meio mínimo apenas controla manchas brancas únicas visíveis ao girar nos tubos de cultura dos isolados, VV e ZZ foram observados usando microscopia de contraste de interferência diferencial para o isolado vv.

A especificação era uma massa de esporos, presumivelmente residual da inoculação inicial. Para isolar zz. A massa era composta de malha solta de hifi, com aproximadamente 0,2 milímetros de diâmetro, sugerindo que o inóculo original do esporo havia germinado, mas não havia crescido além da massa retratada aqui.

Como visto aqui nos controles inoculados da ONU para a cobertura plástica à base de amido, uma textura irregular é observada. A identidade das feições brancas é desconhecida, mas elas estão ausentes em um filme colonizado pelo isolado VV mostrado aqui. Tanto as partículas brancas quanto as saliências desapareceram em um filme colonizado pelo isolado zz.

Além disso, a última amostra mostrou a ocorrência uniforme de fissuras nos isolados da superfície do BDM. VV e ZZ foram provisoriamente identificados usando o DNA ribossômico como Penicillium e ACE dentro da ordem de hipo, respectivamente. Embora esse método possa fornecer informações sobre a biodegradação de coberturas plásticas para a indústria agrícola, ele também pode ser aplicado a qualquer outro plástico cuja biodegradação no meio ambiente esteja em questão.

Por exemplo, plásticos que podem acabar no ambiente marinho. São usados para a indústria alimentícia? Eu.