Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

O objetivo geral deste procedimento é isolar ilhotas saudáveis para medir as diferenças na produção de AMP cíclico em resposta a diversos tratamentos experimentais. Isso é realizado primeiramente inflando e, em seguida, removendo o pâncreas na segunda etapa. As ilhotas saudáveis são isoladas por meio de uma série de centrifugações e lavagens.

Em seguida, os ilhotas viáveis são transferidos para meio de cultura fresco e mantidos em incubação durante a noite. Na etapa final, os ilhotas são expostos aos tratamentos experimentais desejados e é realizado um ensaio de AMP cíclico. Por fim, um ensaio imunoenzimático é utilizado para medir as alterações na produção de AMP cíclico em resposta aos diferentes tratamentos aplicados aos ilhotas.

Em geral, as pessoas novas nesse método terão dificuldades, pois é necessário muito treinamento para obter uma inflação pancreática completa. Primeiro, pré-carregue uma seringa e cânula com cinco mililitros de solução de colagenase. Adapte uma agulha romba de calibre 30 à cânula e coloque a seringa com cânula sobre gelo.

Após mover o intestino delgado para o lado direito do camundongo, localize o esfíncter de Oddi, que está localizado na extremidade do ducto biliar comum e se alastra sobre o intestino delgado, formando um triângulo branco. Uma vez localizado o esfíncter, pegue um par de pinças Dumont número cinco e deslize a ponta por baixo do ducto biliar comum o mais próximo possível do intestino delgado, tomando cuidado para não perfurar o ducto.

Após perfurar o intestino delgado e o tecido conjuntivo, use a ponta da pinça de Dumont para segurar o fio cirúrgico e puxá-lo sob o ducto biliar comum. Amarre o ducto biliar comum o mais próximo possível do esfíncter de OD, certificando-se de que o nó esteja firme para evitar vazamentos. Em seguida, segure ambas as extremidades do fio cirúrgico e puxe-o em direção à cauda para aplicar certa tensão sobre o ducto biliar comum.

Em seguida, usando a mão livre, faça uma pequena incisão com uma pinça de microcirurgia no ducto biliar comum logo acima da última bifurcação para o fígado, mantendo as duas extremidades do fio com o ducto biliar comum esticado. Remova a seringa e a cânula do balde de gelo. Apoie a seringa e insira a agulha romba de calibre 30 preparada na incisão.

Colédoco. Tendo cuidado para não perfurar a parede do ducto. Obter uma inflação completa do pâncreas é a parte mais difícil.

Utilizamos uma agulha que proporciona um bom selamento. Se a primeira agulha não proporcionar um bom selamento, utilize uma agulha maior, como uma agulha de 27 graus. Agora, pressione lentamente o êmbolo da seringa, aliviando a pressão de forma pulsátil até que a primeira parte do pâncreas se infle.

Em seguida, aplique pressão constante e suave até que o pâncreas não se inflar mais. Uma inflação bem-sucedida apresentará uma distribuição uniforme do tecido exócrino, e a parte do pâncreas localizada sobre o estômago estará inflada. Para remover o pâncreas, use uma pinça com uma das mãos para segurar o intestino delgado no esfíncter de od.

Com a outra mão, insira a ponta fechada de uma tesoura curva para separar parte do pâncreas do intestino delgado. Desloque a ponta ao longo do intestino delgado até o tecido conjuntivo cor-de-rosa. Em seguida, segure o intestino delgado próximo ao ponto onde se liga ao estômago e corte o pâncreas, separando-o do restante do intestino delgado.

Segure o máximo possível do pâncreas e levante-o suavemente. Com a tesoura curva, corte as conexões restantes entre o pâncreas e a cavidade torácica.

Para remover completamente o pâncreas, armazene cada pâncreas removido em cerca de 2,5 mililitros de solução de colagenase. Use um tubo cônico individual de 50 mililitros em gelo para lavar os pâncreas. Primeiro, transfira cada pâncreas para um novo tubo cônico de 50 mililitros contendo 25 mililitros de colagenase.

Em seguida, coloque o pâncreas em tubos cónicos de 50 mililitros. Posicione-os verticalmente em um banho-maria agitado a 37 graus Celsius, capaz de oscilar entre 220 e 250 RPM, com o agitador desligado. Agora, borbulhe em cada tubo cónico de 50 mililitros uma mistura de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono durante cinco minutos.

Com uma pipeta de pasteur, tampe bem cada tubo e coloque-os na posição horizontal no banho-maria agitado, abaixo da superfície da água. A partir do sexto minuto, agite os tubos a 220 a 250 rpm por 20 segundos a cada dois minutos, durante até 16 minutos. Após a agitação, centrifugue os tubos a 400 a 500 Gs em temperatura ambiente, desligando imediatamente a centrífuga assim que atingir a velocidade máxima.

Em seguida, sem perturbar o pellet, utilize um aspirador com trampa a vácuo para remover cerca de 22,5 mililitros da solução de colagenase de cada tubo. Em seguida, re-suspenda os pellets em 12,5 mililitros de HBSS e vortexe suavemente os tubos para desagregar os pellets. Após a lavagem e vortexação das células com mais HBSS, transfira cada suspensão celular através de uma malha de 1000 mícrons para novos tubos cónicos individuais de 50 mililitros.

Em seguida, após centrifugar novamente as suspensões celulares, use um aspirador com trampa de vácuo para remover cuidadosamente todo o HBSS sem perturbar o pellet. Uma vez removido todo o HBSS, adicione 4,8 mililitros de solução de F call 25% a cada tubo. Após homogeneizar em vórtex para desagregar o pellet, distribua cuidadosamente 2,4 mililitros da solução de 23%20,5% e 11%fial ao longo da parede do tubo, girando o tubo cônico de 50 mililitros.

Para garantir uma camada uniforme após a centrifugação da solução de FI call, despeje toda a FI call em um novo tubo cônico de 50 mililitros, tomando cuidado para deixar para trás o pellet de tecido exócrino. Adicione HBSS gelado ao novo tubo até a marca de 50 mililitros. Em seguida, tampe e inverta o tubo de quatro a seis vezes.

Para misturar a chamada FI e o HBSS. Use a armadilha a vácuo para aspirar cuidadosamente a maior parte da mistura de FI e HBSS sem perturbar o pellet solto. Em seguida, transfira o pellet para um novo tubo.

Use uma pipeta de pasteur para transferir os anéis para uma placa de Petri contendo o cultivo de anéis. Mídia tomando cuidado para evitar a transferência de detritos de tecido de arte ASIN. Coloque a placa de Petri sobre um microscópio estereoscópico com retroiluminação.

Os olhinhos saudáveis terão formato esférico e centro marrom-dourado a marrom-escuro. Quaisquer olhinhos conectados ao ASIN ou tecido, que apresentarão aparência opaca e acinzentada, não devem ser utilizados e devem ser descartados. Além disso, olhinhos maiores que desenvolvem um centro escuro necrótico após uma incubação noturna devem ser descartados, pois não funcionam adequadamente.

Se o preparo dos anéis contiver uma grande quantidade de detritos, selecione manualmente os anéis duas vezes em meio fresco e adicione DNA ao tampão de digestão para ajudar a limitar a aglomeração dos anéis. Inicie este passo agitando suavemente os anéis para o centro da placa de Petri. Usando uma pipeta P20, transfira os anéis para uma nova placa de Petri de poliestireno de 15 milímetros por 60 milímetros contendo cinco mililitros da solução de pré-incubação, a fim de lavar o meio de cultura contendo glicose dos anéis.

Em seguida, utilize a pipeta P 20 para transferir pelo menos 13 anéis para tubos microfuge individuais contendo um mililitro de solução tampão de Krebs-Ringer bicarbonato recentemente gaseificada, mantendo a consistência do tamanho dos anéis entre os tubos. Após incubar as amostras a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ por 45 minutos, vorteie rapidamente e centrifugue os tubos em uma centrífuga de bancada à temperatura ambiente, entre 7.000 e 7.500 G. Se insulina ou outro metabólito for uma aplicação desejada em etapas posteriores, utilize uma pipeta P 1000 para coletar uma alíquota do meio em um tubo microfuge. Se o meio de estimulação não estiver sendo coletado, ele pode ser descartado.

Utilize uma pipeta P 1000 para remover a maior parte do Krebs em cada tubo microfúg, deixando aproximadamente 10 a 15 microlitros de Krebs no pellet do olhete. Em seguida, utilize uma pipeta P 20 para remover a porção mais próxima ao pellet. Por fim, quando restar menos de 10 a 15 microlitros de Krebs sobre o olhete, congele rapidamente os pellets do olhete em nitrogênio líquido.

Em seguida, armazene os pellets congelados rapidamente a menos 80 graus Celsius até a medição do AMP cíclico. Normalmente, o impacto de um agente sobre a produção de AMP cíclico correlaciona-se diretamente com seu impacto na secreção de insulina. Neste experimento, ilhotas isoladas de camundongos selvagens ou com inativação gênica foram estimuladas com glicose 11,1 milimolar e AMP cíclico intracelular.

A produção de AMP cíclico foi medida e normalizada em relação à proteína celular total. A insulina secretada foi medida utilizando um ensaio padrão de insulina ELISA e também normalizada em relação à proteína celular total. Como esperado, a alteração na produção de AMP cíclico correlacionou-se diretamente com o aumento na secreção de insulina estimulada por glicose Petrol.

Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de isolar, cultivar e medir os níveis de a e p cíclicos em olhos saudáveis de camundongos.