Name: Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Aprenda a isolar ilhotas pancreáticas de camundongo para determinar níveis intracelulares de cAMP usando ensaio imunoenzimático. Este método permite avaliar a função das células β em pesquisas sobre diabetes.

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Gostaríamos de agradecer a Renee L. Pasker e Harpreet K. Brar para assistência técnica especializada sobre os protocolos descritos neste trabalho. Além disso, gostaríamos de reconhecer a orientação de Christopher B. Newgard na Duke University e Alan D. Attie na Universidade de Wisconsin-Madison, juntamente com o apoio de seus membros de laboratório, o que nos permitiu a tempo e apoio necessários para otimizar o protocolos descritos. Em particular, agradecemos Hans Hohmeier, Danhong Lu, e Helena Winfield no Laboratório Newgard e Maria Rabaglia no Laboratório Attie para discussões produtivas e conselhos. Este trabalho foi financiado pelo NIH DK080845 concessão e diabetes juvenil 594 Fundação de Pesquisa de concessão 17-2011-608 (a MEK)

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Autores têm nada a revelar.

Com a prevalência de diabetes projetados para afetar 7,7% da população do mundo, a exigência de novas técnicas de pesquisa é fundamental para entender e tratar a diabetes 18. O presente isolamento de ilhotas é um protocolo bem estabelecido utilizado para experimentação in vitro e tem sido apresentado anteriormente, com ligeiras modificações 11,14,16. Embora a secreção de insulina é uma aplicação comum para a jusante ilhotas isoladas, com foco em componentes a montante, tais como cAMP, pode...

A manutenção rigorosa de euglicemia é imperativo para evitar morbidades, tais como neuropatia, nefropatia e retinopatia, que são todas as características da patologia da descontrolada tipo 1 e 2 diabetes 1. Função das células-β e de massa em ambos tipo 1 e diabetes 2 perturbar as concentrações de glicose no sangue 2. Considerando tipo imune mediada por uma diabetes resulta de uma perda devastadora de células-β produtoras de insulina, a secreção de insulina das células β prejudicada e sinalização da insulina periférica na diabetes tipo 2 em conjunto promover hiperglicemia, dislipidemia e aumento da produção hepática de glicose, o que acaba por resultar em tanto a perda da capacidade de destruição de células β e secreção de insulina a partir de células individuais β-3. Compreender os mecanismos de células-β subjacentes a progressão da diabetes tipo 1 e 2, esperamos dar origem a novas terapias para prevenir e tratar estas doenças. In vitro timodelos de cultura ssue, tais como o INS-1 e MIN6 linhas de células imortalizadas β, podem ser ferramentas úteis para a compreensão da função das células β específicos. No entanto, as interações entre os diferentes tipos de células dentro da ilhota-se pode regular a função das células β. Por exemplo, a influência parácrina de glucagon (libertado a partir de células-α) e somatostatina (libertado a partir de células-δ) em aumentar e diminuir a secreção de insulina, respectivamente, demonstra a importância da proximidade de células de células na resposta endócrina 4. Além disso, junções entre as células-β potencializar a liberação de insulina 5. Além disso, embora tenham sido feitos progressos na geração de linhas de insulinoma que melhor replicados a resposta fisiológica de ilhéus isolados de glicose (por exemplo, o INS-1 derivado de 832/13 e 832/3 linhas de células), a sua capacidade de resposta de glucose ainda difere do normal de rato ilhotas 6,7. Além disso, a resposta destas linhas celulares de insulinoma clonaisa peptide-1 (GLP-1) agonistas de glucagon-like pode variar drasticamente de uma outra, bem como a partir de ilhéus normais 6. Portanto, as linhas de células imortalizadas podem não representar o melhor modelo para os agentes de ensaio que o impacto sobre a produção de cAMP. Em contraste com as linhas de células derivadas de insulinoma, estudar a função das células β exclusivamente em modelos animais completos oferece o seu próprio conjunto de complicações. Um dos maiores desafios no trabalho com tecido endócrino está medindo a concentração precisa de hormônio liberado. Especificamente, o fígado desempenha um papel importante metabolizar a insulina, e o fluxo de sangue pâncreas vai directamente para o fígado. Assim, uma medição de insulina no plasma podem não descrever com precisão a quantidade de insulina a ser segregadas a partir da própria pâncreas ou o impacto de diferentes tratamentos sobre a taxa de secreção de insulina 8. Além disso, o metabolismo renal do glucagon pode limitar a confiabilidade da produção de glucagon a partir de células dos ilhéus α-9. Portanto, isolar ilhotas principal do mouse para a experimentação in vitro proporciona uma compreensão mais precisa de como a ilhota está respondendo a estímulos específicos para complementar as medições feitas in vivo. O presente protocolo para o isolamento de ilhotas de rato é um protocolo bem estabelecido usado por um número de grupos (com pequenas modificações que podem ajudar a aumentar o sucesso) 10,11. Além disso, a determinação da produção de cAMP permite uma leitura directa da capacidade de resposta das células incretina-β. Em conjunção com a medição de cAMP, teor de proteína e a secreção de insulina pode também ser quantificada a partir da mesma preparação de amostras de cAMP, ajudando a determinar se um defeito na função das células-β reside proximal ou distal em AMPc 10. O conteúdo cAMP final e aplicação da secreção de insulina neste protocolo pode ser uma ferramenta muito poderosa para a compreensão da influência de componentes farmacêuticos e dietéticos, entre outross, em cAMP e secreção de insulina. Além disso a estimulação da glucose sozinha, outros compostos podem ser utilizados para medir as alterações do cAMP e secreção de insulina 10,11. Finalmente, embora a insulina é a hormona primária que ensaiar a partir de ilhotas isoladas, outras hormonas, como o glucagon e somatostatina, assim como citoquinas, e eicosanóides, o monofosfato cíclico de adenosina, pode também ser medida, quer por um ensaio de estimulação transitória ou por quantificação de os seus níveis no meio de cultura 12. Finalmente, embora fora do âmbito deste manuscrito, isolamento de ilhotas com o método de isolamento da colagenase descrita permite a preservação da ilhota de forma que muitas outras aplicações a jusante, pode ser exercida, tal como o transplante de ilhotas, para isolamento de RNA por PCR quantitativo em tempo real ou de microarray análises de proteínas isolamento por Western blot, dos ilhéus incorporação e imagiologia de imunofluorescência, e incorporação de [3H]-timidina como medida de repli antiilhotascação, alguns dos quais têm sido descritas em artigos anteriores JoVE 13-16. No geral, seguindo o procedimento de isolamento das ilhotas descritos no protocolo pode fornecer um pesquisador com informações importantes e úteis para o desenvolvimento de terapias e promover a descoberta de medicamentos destinado a melhorar a função das células β.

<table><tbody><tr><td>Colagenase de Clostridium histolyticum adequada para isolar ilhotas ativas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Solução salina balanceada 10X</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (pó)</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7888</td><td></td></tr><tr><td>3/0 Fio de Sutura de Seda</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinça</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de 0,8 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Curvada</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; bingen Tesoura de Mola - Reta/Afiada/8,5 cm/5 mm Ponta</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecção</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14002-14</td><td></td></tr> 5 <tr><td>ml BD Seringa Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Seringa BD de 1 ml</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30 G BD Agulha 1/2" Comprimento</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>27 G BD Agulha 1/2" Comprimento</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Pedra de Afiar</td><td>Ferramentas de Belas Costuras</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2-tribromoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>2-metil-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio (NaCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monopotássico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (NaCHO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&#183; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal Inativado por Calor (H.I. FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03HI</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5879-100MG</td><td></td></tr></tbody></table>

um método para mouse ilhotas pancreáticas isolamento e intracelular camp determinação

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Glicemia descontrolada é uma característica da diabetes mellitus e promove morbidades como neuropatia, nefropatia e retinopatia. Com o aumento da prevalência de diabetes, tanto imunomediada tipo 1 e ligado à obesidade do tipo 2, estudos que visam delinear fisiopatologia diabetes e mecanismos terapêuticos são de importância crítica. As células-β dos ilhéus pancreáticos de Langerhans são responsáveis ​​pela apropriadamente secretoras de insulina, em resposta a concentrações elevadas de glicose no sangue. Em adição à glucose e outros nutrientes, as células-β também são estimulados por hormonas específicas, denominado incretinas, que são secretadas a partir do intestino em resposta a uma refeição e agem em receptores de células β que aumentam a produção intracelular de monofosfato de adenosina cíclico ( cAMP). Diminuição da função das células-β, massa e capacidade de resposta incretina são bem compreendidos a contribuir para a fisiopatologia do diabetes tipo 2, e também estão sendo cada vez mais ligada wiª diabetes tipo 1. O presente rato isolamento ilhéu e protocolo determinação cAMP pode ser uma ferramenta para ajudar a delinear os mecanismos que promovem a progressão da doença e intervenções terapêuticas, particularmente aquelas que são mediadas pelos receptores de incretinas ou receptores que atuam através da modulação da produção de cAMP intracelular relacionados. Embora apenas as medições de cAMP será descrito, o protocolo de isolamento de ilhotas descrito cria uma preparação limpa, que permite também a muitas outras aplicações a jusante, incluindo a glicose estimulou a secreção de insulina, [3 H]-timidina, a abundância de proteínas, e a expressão do mRNA.

Para garantir um alto rendimento ilhota durante o isolamento, as técnicas cirúrgicas descritas no protocolo deve ser seguido de perto. Embora as técnicas apresentadas aqui vai ser adaptado para cada laboratório, existem alguns passos críticos que levarão a um isolamento bem sucedido. A fim de tornar o canal biliar comum de fácil acesso, recomenda-se que os órgãos de ser deslocado para o lado direito do rato (Figura 1). Além disso, isto irá permitir que o pâncreas são accionados com uma quantidade menor ...

Ensaiando in vitro a função das células β usando o mouse ilhotas isoladas de Langerhans é um componente importante no estudo da fisiopatologia do diabetes e terapêutica. Embora muitas aplicações a jusante estão disponíveis, este protocolo descreve especificamente a medida da intracelular monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) como um parâmetro essencial para definir a função das células β.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar ilhotas saudáveis para medir as diferenças na produção de AMP cíclico em resposta a diversos tratamentos experimentais. Isso é realizado primeiramente inflando e, em seguida, removendo o pâncreas na segunda etapa. As ilhotas saudáveis são isoladas por meio de uma série de centrifugações e lavagens.Em seguida, os ilhotas viáveis são transferidos para meio de cultura fresco e mantidos em incubação durante a noite. Na etapa final, os ilhotas são expostos aos tratamentos experimentais desejados e é realizado um ensaio de AMP cíclico. Por fim, um ensaio imunoenzimático é utilizado para medir as alterações na produção de AMP cíclico em resposta aos diferentes tratamentos aplicados aos ilhotas.Em geral, as pessoas novas nesse método terão dificuldades, pois é necessário muito treinamento para obter uma inflação pancreática completa. Primeiro, pré-carregue uma seringa e cânula com cinco mililitros de solução de colagenase. Adapte uma agulha romba de calibre 30 à cânula e coloque a seringa com cânula sobre gelo.Após mover o intestino delgado para o lado direito do camundongo, localize o esfíncter de Oddi, que está localizado na extremidade do duc

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O protocolo a seguir descreve o processo de dissecção pancreática para imagens fatia virtual, e posterior quantificação de todos os GFP-tagged células beta no pâncreas inteiro.

Quantificação em situ da Missa das células beta pancreáticas em camundongos

Uma descrição detalhada de isolamento de ilhotas do rato está descrito por meio da técnica de canulação na pancreático ductal in situ e a perfusão de uma combinação de colagenase purificados e protease neutra.

Rato Ilhéu de Langerhans isolamento usando uma combinação de colagenase purificada e Protease Neutra

As ilhotas pancreáticas, também chamadas de ilhotas de Langerhans, são um aglomerado de células endócrinas que produzem hormônios para a regulação da glicose e outras funções biológicas importantes. Este protocolo explica um método para isolar ilhotas pancreáticas pela primeira vez perfundindo colagenase via ampola de Vater para digerir o tecido pancreático exócrino e uma centrifugação simplificada com gradiente de densidade para purificar as ilhotas de camundongos.

Isolamento de ilhotas pancreáticas por meio de perfusão de colagenase: um método enzimático para isolar células de ilhotas pancreáticas

Apresentamos aqui um protocolo para o isolamento de ilhotas do modelo de camundongo com diabetes tipo 2, Leprdb e detalhes de um ensaio de células vivas para medição da secreção de insulina de ilhotas intactas que utiliza microscopia de 2 fótons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar células de ilhotas pancreáticas do mouse para as induções ROS de triagem pelos xenobióticos para identificar os potenciais químicos xenobióticos de diabetogenic.

Um rastreio de baseada em célula de murino ilhotas pancreáticas para produtos químicos ambientais Diabetogenic

Nós descrevemos um método para o isolamento de células endócrinas de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal, seguidos por sequenciação do ARN de célula única. Esse método permite que as análises do desenvolvimento de linhagem endócrina do pâncreas, heterogeneidade e transcriptomic dinâmica de células.

Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens e quantificar a dinâmica do cálcio em populações heterogêneas de células, como células de ilhotas pancreáticas. Os repórteres fluorescentes são entregues na camada periférica de células dentro da ilhota, que é então imobilizada e imagemda, e a análise por célula da dinâmica da intensidade da fluorescência é realizada.

Dinâmica de cálcio de imagem em subpopulações de células de ilhotas pancreáticas do rato

Este protocolo descreve o isolamento de células endoteliais de camundongos de todo o pâncreas.

Isolamento de células endoteliais pancreáticas de camundongo

Este estudo utiliza marcadores de morte celular e apoptose baseados em fluorescência multicoloração combinados com microscopia confocal para avaliar a apoptose induzida por citocinas e a morte específica de β células em ilhotas pancreáticas. Revela mudanças espaciais e temporais na morte celular e apoptose em resposta a estímulos extracelulares.

Tratamento de ilhotas pancreáticas isoladas e medição de apoptose

Este estudo desenvolveu um método simplificado para extrair eficientemente ilhéus primários funcionais e células acinares do pâncreas do camundongo, oferecendo uma ferramenta valiosa para estudar a comunicação intercelular na patogênese do Diabetes Induzido por Pancreatite Aguda.

Um método simples e rápido para isolamento simultâneo de ilhotas primárias e células acinares pancreáticas primárias de camundongos

Aprenda a isolar ilhotas pancreáticas de camundongo para determinar níveis intracelulares de cAMP usando ensaio imunoenzimático. Este método permite avaliar a função das células β em pesquisas sobre diabetes.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

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