Introdução ao Espectrofotômetro
O espectrofotômetro é um instrumento rotineiramente utilizado em pesquisas científicas. Espectrofotometria é a medição quantitativa de quanto uma subs…
O espectrofotômetro é um instrumento onipresentemente utilizado em pesquisas biológicas, químicas, clínicas e ambientais.
Espectrofotometria é a medição quantitativa de quanto uma substância química absorve a luz passando um feixe de luz através da amostra usando um espectrofotômetro.
Medindo a intensidade da luz detectada, este método pode ser usado para determinar a concentração de soluto na amostra.
O feixe de luz irradiado em direção à amostra é composto de um fluxo de fótons.
Quando os fótons encontram moléculas na amostra, as moléculas podem absorver algumas delas, reduzindo o número de fótons no feixe de luz e diminuindo a intensidade do sinal detectado.
A transmissão é a fração de luz que passa pela amostra e é definida como a intensidade da luz que passa pela amostra sobre a intensidade da luz incidente. A absorvência é o logaritmo inverso da transmissão e é a quantidade que seu espectrofotômetro irá medir.
A partir da absorvância, a concentração da solução amostral pode ser determinada a partir da Lei Beer-Lambert, que afirma que há uma relação linear entre a absorvância e a concentração de uma amostra. De acordo com a Lei Beer-Lambert, a absorvência é o produto do coeficiente de extinção, uma medida de quão fortemente um soluto absorve a luz em um determinado comprimento de onda, o comprimento que a luz passa através da amostra, ou comprimento do caminho, e a concentração de soluto. Muitas vezes, o objetivo de tomar medidas de absorção é medir a concentração de uma amostra.
Cada espectrofotômetro inclui uma fonte de luz, um collimador, que é uma lente ou dispositivo de foco que transmite um intenso feixe de luz reta, um monocromador para separar o feixe de luz em seus comprimentos de onda componentes, e um seletor de comprimento de onda, ou fenda, para selecionar o comprimento de onda desejado. Os comprimentos de onda da luz usados em espectrômetros discutidos neste vídeo estão na faixa ultravioleta e visível. O espectrômetro também inclui algum tipo de porta-amostras, um detector fotoelétrico, que detecta a quantidade de fótons que são absorvidos, e uma tela para exibir a saída do detector.
Os espectrômetros mais novos são diretamente acoplados a um computador, onde os parâmetros do experimento podem ser controlados e os resultados são exibidos.
Ao realizar espectrofotometria, certifique-se de tomar as precauções apropriadas, como usar luvas, dependendo do tipo de soluções biológicas ou químicas com as quais você está trabalhando.
Antes de medir o espectro UV visível de uma amostra, ligue a máquina e permita que as lâmpadas e eletrônicos se aqueçam.
Preparar um branco da mesma solução, mas sem o analito, tendo o mesmo pH e força iônica semelhante; um passo necessário, pois a célula e o solvente podem espalhar alguma luz.
Os tradicionais porta-amostras de espectrofotômetros são projetados para conter cuvetas de plástico e quartzo. Prossiga para pipeta a solução em branco na cuvette.
Depois de limpar quaisquer impressões digitais e derramar do lado de fora da cuvette, insira corretamente o cuvette no porta-múda e feche a porta para o compartimento de cuvette.
Nunca se esqueça de fechar a porta, pois a radiação UV emitida a partir de um espectrofotômetro aberto pode danificar os olhos e a pele.
Defina o comprimento de onda desejado ou o comprimento de onda a ser transmitido na amostra, que depende do comprimento de onda ideal de luz que o analito absorve. Em seguida, zero o instrumento tirando uma leitura do branco, que irá subtrair o fundo do seu buffer amostral.
Dependendo do tipo de experimento espectrofotométrico que você está realizando, pode ser necessário gerar uma curva padrão antes da medição da amostra, a partir da qual a concentração de seu analito amostral pode eventualmente ser determinada.
Deixe que a amostra atinja a temperatura apropriada e misture-a suavemente, para que as bolhas não sejam introduzidas. A amostra pode ser adicionada diretamente ao cuvette, dentro do instrumento, e uma leitura tirada.
Após a realização da medição de absorvência em sua amostra, proceda ao cálculo adequado para o seu experimento; por exemplo, determinação de concentração ou taxa de atividade enzimática.
O espectótmetro é usado diariamente em muitos laboratórios de pesquisa biológica.
Uma aplicação comum do espectótmetro é a medição da densidade celular. A medição da densidade celular é útil na geração de curvas de crescimento logarítmico para bactérias, a partir das quais o tempo ideal para indução de proteína recombinante pode ser determinado.
O espectotómetro também pode ser usado para medir taxas de reação química. Neste exemplo, a absorvência é usada para monitorar uma reação enzimática pelo desaparecimento de uma reação intermediária a 452 nm ao longo do tempo. A taxa desta etapa enzimática pode ser calculada encaixando os dados na equação apropriada.
Recentemente, a introdução de espectrofotômetros de micro volume eliminou a necessidade de portadores de amostras. Tais espectrofotômetros usam tensão superficial para segurar a amostra.
Os espectróficos de micro volume são ideais para medir a qualidade e concentração de amostras caras de volume limitado, como biomoléculas, incluindo proteínas e ácidos nucleicos.
A absorção de uma proteína a 280 nm depende do conteúdo de cadeias laterais aromáticas encontradas em triptofano, tyrosina e fenilalanina, bem como a existência de ligações de dissulfeto cisteína-cisteína.
A concentração proteica pode ser determinada a partir de sua absorção a 280 nm e seu coeficiente de extinção, que é baseado na composição do aminoácido.
Tanto o DNA quanto o RNA têm um máximo de absorção a 260 nm a partir do qual sua concentração pode ser determinada. A pureza do ácido nucleico também pode ser avaliada a partir da razão de leituras de absorvência em comprimentos de onda específicos.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE ao espectrômetro.
Neste vídeo, revisamos alguns princípios básicos, incluindo conceitos de espectrofotometria e componentes espectrotômetros. Também demonstramos o passo a passo do espectótmetro e discutimos seu uso em pesquisas biológicas. Obrigado por assistir.
O espectrofotômetro é um instrumento onipresentemente utilizado em pesquisas biológicas, químicas, clínicas e ambientais.
Espectrofotometria é a medição quantitativa de quanto uma substância química absorve a luz passando um feixe de luz através da amostra usando um espectrofotômetro.
Medindo a intensidade da luz detectada, este método pode ser usado para determinar a concentração de soluto na amostra.
O feixe de luz irradiado em direção à amostra é composto de um fluxo de fótons.
Quando os fótons encontram moléculas na amostra, as moléculas podem absorver algumas delas, reduzindo o número de fótons no feixe de luz e diminuindo a intensidade do sinal detectado.
A transmissão é a fração de luz que passa pela amostra e é definida como a intensidade da luz que passa pela amostra sobre a intensidade da luz incidente. A absorvência é o logaritmo inverso da transmissão e é a quantidade que seu espectrofotômetro irá medir.
A partir da absorvância, a concentração da solução amostral pode ser determinada a partir da Lei Beer-Lambert, que afirma que há uma relação linear entre a absorvância e a concentração de uma amostra. De acordo com a Lei Beer-Lambert, a absorvência é o produto do coeficiente de extinção, uma medida de quão fortemente um soluto absorve a luz em um determinado comprimento de onda, o comprimento que a luz passa através da amostra, ou comprimento do caminho, e a concentração de soluto. Muitas vezes, o objetivo de tomar medidas de absorção é medir a concentração de uma amostra.
Cada espectrofotômetro inclui uma fonte de luz, um collimador, que é uma lente ou dispositivo de foco que transmite um intenso feixe de luz reta, um monocromador para separar o feixe de luz em seus comprimentos de onda componentes, e um seletor de comprimento de onda, ou fenda, para selecionar o comprimento de onda desejado. Os comprimentos de onda da luz usados em espectrômetros discutidos neste vídeo estão na faixa ultravioleta e visível. O espectrômetro também inclui algum tipo de porta-amostras, um detector fotoelétrico, que detecta a quantidade de fótons que são absorvidos, e uma tela para exibir a saída do detector.
Os espectrômetros mais novos são diretamente acoplados a um computador, onde os parâmetros do experimento podem ser controlados e os resultados são exibidos.
Ao realizar espectrofotometria, certifique-se de tomar as precauções apropriadas, como usar luvas, dependendo do tipo de soluções biológicas ou químicas com as quais você está trabalhando.
Antes de medir o espectro UV visível de uma amostra, ligue a máquina e permita que as lâmpadas e eletrônicos se aqueçam.
Preparar um branco da mesma solução, mas sem o analito, tendo o mesmo pH e força iônica semelhante; um passo necessário, pois a célula e o solvente podem espalhar alguma luz.
Os tradicionais porta-amostras de espectrofotômetros são projetados para conter cuvetas de plástico e quartzo. Prossiga para pipeta a solução em branco na cuvette.
Depois de limpar quaisquer impressões digitais e derramar do lado de fora da cuvette, insira corretamente o cuvette no porta-múda e feche a porta para o compartimento de cuvette.
Nunca se esqueça de fechar a porta, pois a radiação UV emitida a partir de um espectrofotômetro aberto pode danificar os olhos e a pele.
Defina o comprimento de onda desejado ou o comprimento de onda a ser transmitido na amostra, que depende do comprimento de onda ideal de luz que o analito absorve. Em seguida, zero o instrumento tirando uma leitura do branco, que irá subtrair o fundo do seu buffer amostral.
Dependendo do tipo de experimento espectrofotométrico que você está realizando, pode ser necessário gerar uma curva padrão antes da medição da amostra, a partir da qual a concentração de seu analito amostral pode eventualmente ser determinada.
Deixe que a amostra atinja a temperatura apropriada e misture-a suavemente, para que as bolhas não sejam introduzidas. A amostra pode ser adicionada diretamente ao cuvette, dentro do instrumento, e uma leitura tirada.
Após a realização da medição de absorvência em sua amostra, proceda ao cálculo adequado para o seu experimento; por exemplo, determinação de concentração ou taxa de atividade enzimática.
O espectótmetro é usado diariamente em muitos laboratórios de pesquisa biológica.
Uma aplicação comum do espectótmetro é a medição da densidade celular. A medição da densidade celular é útil na geração de curvas de crescimento logarítmico para bactérias, a partir das quais o tempo ideal para indução de proteína recombinante pode ser determinado.
O espectotómetro também pode ser usado para medir taxas de reação química. Neste exemplo, a absorvência é usada para monitorar uma reação enzimática pelo desaparecimento de uma reação intermediária a 452 nm ao longo do tempo. A taxa desta etapa enzimática pode ser calculada encaixando os dados na equação apropriada.
Recentemente, a introdução de espectrofotômetros de micro volume eliminou a necessidade de portadores de amostras. Tais espectrofotômetros usam tensão superficial para segurar a amostra.
Os espectróficos de micro volume são ideais para medir a qualidade e concentração de amostras caras de volume limitado, como biomoléculas, incluindo proteínas e ácidos nucleicos.
A absorção de uma proteína a 280 nm depende do conteúdo de cadeias laterais aromáticas encontradas em triptofano, tyrosina e fenilalanina, bem como a existência de ligações de dissulfeto cisteína-cisteína.
A concentração proteica pode ser determinada a partir de sua absorção a 280 nm e seu coeficiente de extinção, que é baseado na composição do aminoácido.
Tanto o DNA quanto o RNA têm um máximo de absorção a 260 nm a partir do qual sua concentração pode ser determinada. A pureza do ácido nucleico também pode ser avaliada a partir da razão de leituras de absorvência em comprimentos de onda específicos.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE ao espectrômetro.
Neste vídeo, revisamos alguns princípios básicos, incluindo conceitos de espectrofotometria e componentes espectrotômetros. Também demonstramos o passo a passo do espectótmetro e discutimos seu uso em pesquisas biológicas. Obrigado por assistir.
Q1: How does a spectrophotometer measure the concentration of a solute in a solution?
A spectrophotometer measures concentration by quantifying how much light a sample absorbs. When a beam of light passes through the sample, molecules absorb photons, reducing light intensity. The instrument measures absorbance, which relates directly to solute concentration through the Beer-Lambert Law. This linear relationship between absorbance and concentration allows researchers to determine unknown concentrations from measured absorbance values.
Q2: What is the difference between transmittance and absorbance in spectrophotometry?
Transmittance is the fraction of light that passes through a sample, calculated as the intensity of transmitted light divided by incident light intensity. Absorbance is the inverse logarithm of transmittance and represents how much light the sample absorbs. Spectrophotometers directly measure absorbance, which is the more useful parameter for determining solute concentration using the Beer-Lambert Law.
Q3: What are the main components of a spectrophotometer and what does each do?
A spectrophotometer contains a light source, collimator that focuses light into a straight beam, monochromator that separates light into component wavelengths, and a wavelength selector or slit for choosing the desired wavelength. It also includes a sample holder for cuvettes, a photoelectric detector that measures absorbed photons, and a display screen. Newer models connect directly to computers for experiment control and data display.
Q4: Why is it important to prepare a blank solution before measuring a sample?
A blank solution contains the same solvent and buffer as the sample but without the analyte. The cell and solvent can scatter light, creating background absorbance. By zeroing the instrument with the blank, this background is subtracted from your sample measurement, ensuring accurate absorbance readings. The blank must have the same pH and similar ionic strength as your sample for proper calibration.
Q5: How can spectrophotometry be used to monitor enzyme activity in real time?
Spectrophotometry monitors enzyme activity by tracking changes in absorbance over time. For example, if an enzymatic reaction produces or consumes a compound with a specific absorbance maximum, researchers can measure absorbance at that wavelength repeatedly. The rate of absorbance change reflects the reaction rate, allowing calculation of enzyme kinetics. This method is particularly useful for monitoring disappearance of reaction intermediates at specific wavelengths like 452 nanometers.
Q6: What are the advantages of microvolume spectrophotometers for measuring biomolecules?
Microvolume spectrophotometers use surface tension to hold samples, eliminating the need for traditional cuvette holders. They are optimal for measuring expensive, limited-volume samples such as proteins and nucleic acids. These instruments can determine protein concentration from absorbance at 280 nanometers based on aromatic amino acid content, and assess nucleic acid concentration and purity from absorbance readings at 260 nanometers.
Q7: What precautions should be taken when operating a spectrophotometer?
Always wear appropriate gloves when handling biological or chemical solutions. Allow the instrument to warm up before use. Never leave the cuvette compartment door open, as UV radiation can damage eyes and skin. Before inserting the cuvette, wipe away fingerprints and spills from the outside. Allow samples to reach the appropriate temperature and mix gently to avoid introducing bubbles that could affect measurements.