1.10: Introdução ao Espectrofotômetro

O espectrofotômetro é um instrumento usado em pesquisas biológicas, químicas, clínicas e ambientais.

A espectrofotometria é a medida quantitativa de quanto uma substância química absorve luz ao passar um feixe de luz através da amostra usando um espectrofotômetro.

Medindo a intensidade da luz detectada, este método pode ser usado para determinar a concentração de soluto na amostra.

O feixe de luz que é irradiado em direção à amostra é composto de um fluxo de fótons.

Quando os fótons encontram moléculas na amostra, as moléculas podem absorver algumas delas, reduzindo o número de fótons no feixe de luz e diminuindo a intensidade do sinal detectado.

A transmitância é a fração de luz que passa pela amostra e é definida como a intensidade da luz que passa pela amostra sobre a intensidade da luz incidente. A absorbância é o logaritmo inverso da transmitância e é a quantidade que seu espectrofotômetro medirá.

A partir da absorbância, a concentração da solução da amostra pode ser determinada a partir da Lei de Beer-Lambert, que afirma que existe uma relação linear entre a absorbância e a concentração de uma amostra. De acordo com a Lei de Beer-Lambert, a absorbância é o produto do coeficiente de extinção, uma medida de quão fortemente um soluto absorve luz em um determinado comprimento de onda, o comprimento que a luz passa pela amostra ou comprimento do caminho e a concentração de soluto. Muitas vezes, o objetivo de fazer medições de absorbância é medir a concentração de uma amostra.

Cada espectrofotômetro inclui uma fonte de luz, um colimador, que é uma lente ou dispositivo de foco que transmite um feixe de luz reto intenso, um monocromador para separar o feixe de luz em seus comprimentos de onda componentes e um seletor de comprimento de onda, ou fenda, para selecionar o comprimento de onda desejado. Os comprimentos de onda da luz usados nos espectrofotômetros discutidos neste vídeo estão na faixa ultravioleta e visível. O espectrofotômetro também inclui algum tipo de suporte de amostra, um detector fotoelétrico, que detecta a quantidade de fótons que são absorvidos, e uma tela para exibir a saída do detector.

Os espectrofotômetros mais novos são acoplados diretamente a um computador, onde os parâmetros do experimento podem ser controlados e os resultados são exibidos.

Ao realizar a espectrofotometria, certifique-se de tomar as devidas precauções, como usar luvas, dependendo do tipo de soluções biológicas ou químicas com as quais você está trabalhando.

Antes de medir o espectro UV-visível de uma amostra, ligue a máquina e deixe as lâmpadas e os componentes eletrônicos aquecerem.

Preparar um ensaio em branco da mesma solução, mas sem a substância a analisar, com o mesmo pH e a mesma força iónica; um passo necessário, pois a célula e o solvente podem espalhar um pouco de luz.

Os suportes de amostra de espectrofotômetro tradicionais são projetados para conter cubetas de plástico e quartzo. Proceder à pipeta da solução em branco para a cubeta.

Depois de limpar quaisquer impressões digitais e respingos da parte externa da cubeta, insira corretamente a cubeta no porta-amostras e feche a porta do compartimento da cubeta.

Nunca se esqueça de fechar a porta, pois a radiação UV emitida por um espectrofotômetro aberto pode danificar os olhos e a pele.

Defina o comprimento de onda desejado ou a faixa de comprimento de onda a ser transmitida na amostra, que depende do comprimento de onda ideal da luz que o analito absorve. Em seguida, zere o instrumento fazendo uma leitura do branco, o que subtrairá o fundo do buffer de amostra.

Dependendo do tipo de experimento espectrofotométrico que você está realizando, pode ser necessário gerar uma curva padrão antes da medição da amostra, a partir da qual a concentração do analito da amostra pode ser determinada.

Deixe a amostra atingir a temperatura adequada e misture suavemente, para que não sejam introduzidas bolhas. A amostra pode ser adicionada diretamente à cubeta, dentro do instrumento, e uma leitura feita.

Depois de realizar a medição de absorbância em sua amostra, prossiga para o cálculo apropriado para seu experimento; por exemplo, determinação da concentração ou da taxa de atividade enzimática.

O espectrofotômetro é usado diariamente em muitos laboratórios de pesquisa biológica.

Uma aplicação comum do espectrofotômetro é a medição da densidade celular. A medição da densidade celular é útil na geração de curvas de crescimento logarítmico para bactérias, a partir das quais o tempo ideal para a indução da proteína recombinante pode ser determinado.

O espectrofotômetro também pode ser usado para medir as taxas de reação química. Neste exemplo, a absorbância é usada para monitorar uma reação enzimática pelo desaparecimento de um intermediário de reação a 452 nm ao longo do tempo. A taxa dessa etapa enzimática pode ser calculada ajustando os dados à equação apropriada.

Recentemente, a introdução de espectrofotômetros de microvolume eliminou a necessidade de porta-amostras. Esses espectrofotômetros usam tensão superficial para segurar a amostra.

Os espectrofômetros de microvolume são ideais para medir a qualidade e a concentração de amostras caras de volume limitado, como biomoléculas, incluindo proteínas e ácidos nucléicos.

A absorbância de uma proteína a 280 nm depende do conteúdo de cadeias laterais aromáticas encontradas no triptofano, tirosina e fenilalanina, bem como da existência de ligações dissulfeto cisteína-cisteína.

A concentração de proteína pode ser determinada a partir de sua absorbância a 280 nm e seu coeficiente de extinção, que é baseado na composição de aminoácidos.

Tanto o DNA quanto o RNA têm uma absorbância máxima de 260 nm a partir da qual sua concentração pode ser determinada. A pureza do ácido nucléico também pode ser avaliada a partir da proporção de leituras de absorbância em comprimentos de onda específicos.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE ao espectrofotômetro.

Neste vídeo, revisamos alguns princípios básicos, incluindo conceitos de espectrofotometria e componentes do espectrofotômetro. Também demonstramos a operação passo a passo do espectrofotômetro e discutimos seu uso em pesquisas biológicas. Obrigado por assistir.