Análise Quantitativa Multispectral Após transplante de tecido fluorescente para visualização das Origens celulares, Tipos e Interações

O objetivo do seguinte procedimento é utilizar a interrogação multiespectral de composições celulares multiplexas ou seus modelos para determinar as contribuições de diversas populações residentes na medula óssea para o desenvolvimento do estroma tumoral. Isso é realizado primeiramente transplantando um camundongo receptor transgênico marcado com GFP com células-tronco da medula óssea que expressam RFP. Na segunda etapa, as células tumorais de interesse são injetadas no mesmo receptor e, após a enxertia, o tumor ressecado é seccionado, embutido em parafina e marcado com anticorpos de imunofluorescência.

Em seguida, uma biblioteca espectral de todos os comprimentos de onda utilizados para adquirir imagens das seções tumorais é criada assim que a biblioteca espectral estiver completa. As lâminas são imagiadas na etapa final, sendo realizada a análise de dados para permitir a identificação e associação dos padrões de marcação dos marcadores celulares de interesse. Por fim, entidades celulares ou fenótipos novos podem ser identificados com base na marcação múltipla de marcadores extracelulares e celulares, a fim de compreender melhor a composição de tecidos complexos, como o microambiente tumoral.

A principal vantagem dessa técnica em relação às técnicas padrão de imunofluorescência é que a análise multiespectral permite a multiplexação de sete ou mais fluoróforos no mesmo lâmina, possibilitando uma investigação muito mais precisa e detalhada da composição celular do microambiente tumoral ou de um tecido regenerativo. Embora este método possa fornecer informações sobre a origem e a composição do microambiente tumoral, ele pode ser aplicado a outros sistemas, como medicina regenerativa, biologia do desenvolvimento e biologia imunológica. Demonstrando este procedimento juntamente com o Dr. Spa está Chris Booth, assistente de pesquisa no meu laboratório. Devido às restrições da IU Cook nesta instituição, discutiremos, mas não mostraremos, manipulações diretas em camundongos.

Esses procedimentos de medula óssea e nossas técnicas de enxerto de tumor podem ser encontrados em nossos trabalhos anteriores, como células-tronco de kid e outros. 2009 Para iniciar, após o isolamento das células da medula óssea dos membros traseiros correspondentes, ressuspenda as células em 2 milhões de células por 100 microlitros de PBS por camundongo. Utilize uma lâmpada de calor para dilatar os vasos de um camundongo receptor GFP irradiado e posicione o camundongo em um suporte para injeção na veia da cauda.

Usando uma agulha de 29 gauge com o bisel voltado para cima, injete sistematicamente as suspensões celulares na veia da cauda ou na veia retroorbital. Utilize gaze estéril para aplicar leve pressão sobre a cauda após a injeção. Injete um camundongo com apenas 100 microlitros de PBS como controle de enxertia no dia da injeção.

Re-suspenda as células tumorais de interesse em PBS a 1 milhão de células por 100 microlitros. Após esterilizar o abdômen com etanol 70%. Use uma mão para imobilizar o camundongo pela pele do pescoço e pela cauda, e então, com a outra mão, segure a agulha com o bisel voltado para cima e injete as células tumorais na cavidade intraperitoneal do camundongo receptor.

Após 15 a 30 dias, eutanizar os camundongos e remover o tumor do abdômen. Em seguida, fixar os tumores em formalina a 10% por 24 horas. Depois, seccionar o tecido fixado em cortes de cinco a 10 micrômetros para procedimentos subsequentes de coloração.

Após fixar os cortes de tecido em parafina, aqueça as amostras por uma hora a 56 graus Celsius. Em seguida, lave as lâminas de acordo com a seguinte sequência: após a última lavagem com etanol, enxágue as lâminas em água por dois minutos, submergindo e retirando lentamente a grade de coloração da água 10 vezes.

Em seguida, coloque o tampão de citrato de sódio no micro-ondas para aquecer. Após ferver as lâminas por 20 minutos no tampão de citrato de sódio, deixe as amostras esfriarem no tampão por 30 minutos. Em seguida, lave com água ionizada por mais cinco minutos.

Em seguida, bata levemente na lâmina para permitir que grandes gotas de água escorram, tomando cuidado para não secar o corte tecidual. Use uma caneta de barreira hidrofóbica para delimitar as áreas ao redor dos cortes tumorais e, imediatamente, adicione o tampão de bloqueio sobre a amostra para evitar que o corte tecidual seque. Após uma hora, incube as lâminas com o anticorpo primário de interesse em uma câmara úmida, em caixa sobre um agitador rotativo lento a quatro graus durante a noite.

Na manhã seguinte, lave as lâminas duas vezes em PBST durante 10 minutos cada vez, com agitação suave enquanto as seções estão sendo lavadas. Dilua os anticorpos secundários na proporção de um para 1000, anticorpo para tampão bloqueador. Em seguida, incube as seções nos anticorpos secundários apropriados na caixa de câmara úmida coberta com folha de alumínio, em agitador rotativo lento, à temperatura ambiente, por duas horas.

Lave as lâminas duas vezes em PBST durante cinco minutos com agitação suave e proteja-as da luz. Em seguida, contra-estaine a lâmina dappy apenas e as lâminas de análise com DPI durante um minuto, mantendo as lâminas cobertas durante a incubação. Colocando uma lamínula sobre cada amostra, selar as bordas de cada lamínula com endurecedor de unha.

Agora, para realizar a imagem multiespectral, utilize uma objetiva de imersão em óleo para obter uma imagem inicial do lâmina de análise e definir os tempos de exposição adequados para cada uma das faixas espectrais na biblioteca espectral. Por exemplo, esta tabela descreve protocolos sugeridos de biblioteca espectral com base no número de andares utilizados no experimento. Em seguida, obtenha a imagem do lâmina não corado para o lâmina de fundo na biblioteca espectral para este experimento.

Próxima imagem, a lâmina não corada para obter a imagem de fundo para a biblioteca espectral. Agora, capture uma imagem de cada lâmina de controle individualmente corada com quatro marcadores, salvando as imagens com o nome do anticorpo secundário utilizado em cada lâmina. Uma vez que a biblioteca espectral esteja completa, colete imagens das regiões de interesse na lâmina de análise para analisar as imagens dos tecidos tumorais.

Primeiro, importe uma seleção representativa das imagens de nuance adquiridas utilizando o software inform. Em seguida, abra a biblioteca espectral segura conforme orientado pelo programa. Depois, identifique as regiões de tecido de interesse a serem analisadas.

Identifique células individuais com base na coloração com DAPI. O citoplasma será identificado automaticamente com base na forma do núcleo. Agora, escolha a leitura de intensidade fluorescente desejada para cada parâmetro fluorescente e, em seguida, combine as imagens adquiridas, permitindo que o software processe os dados usando o algoritmo proposto.

Quando o processamento de imagem for concluído, una os arquivos resultantes. Em seguida, utilizando esta técnica de imagem multiespectral para analisar e representar graficamente tumores neste modelo de camundongo transgênico com transplante de medula óssea, componentes estromais tumorais de origem medular foram identificados por citometria de fluxo três semanas após o transplante de medula óssea. Depois, seis semanas após a injeção inicial, seções dos tumores ovarianos injetados não marcados foram analisadas após a criação de uma biblioteca espectral com lâminas-controle de cor única; imagens da seção do tumor ovariano corada com GFP DPI e dois outros marcadores foram analisadas.

A adição de mais marcadores é possível. Por exemplo, aqui, a biblioteca espectral e a imagem correspondente de uma seção de tumor com seis marcadores mais uma coloração nuclear são mostradas utilizando o software indicado. As regiões do tecido de interesse dentro da seção de tumor podem ser classificadas conforme mostrado nas imagens representativas apresentadas aqui.

Por exemplo, esta imagem demonstra a classificação de segmentos de tecido seguida pela segmentação das células. Com base na dpi da coloração nuclear. A quantificação das marcas fluorescentes pode então ser medida no núcleo e citoplasma de cada célula e exportada para análises adicionais.

O algoritmo de segmentação de tecidos é capaz de identificar ainda mais subtipos de tecidos com base na arquitetura tecidual e não apenas na identificação de fluorocromos, fornecendo uma ferramenta analítica mais robusta para classificar a coloração em regiões teciduais distintas. Nesta imagem, o computador foi treinado para identificar cinco sub-regiões com base nos padrões arquiteturais dentro do tecido. O fundo é definido pelo espaço em branco.

O tumor hemorrágico é definido pela abundância de glóbulos vermelhos no tecido. O tumor é definido pelas células densamente populadas. A gordura é definida por grandes compartimentos celulares vazios e simétricos, e os músculos, por um padrão estriado.

Utilizando este método, uma população de células duplamente positivas pode ser analisada com base em um limiar determinado de intensidade fluorescente. Por exemplo, para células positivas para GFP e para actina alfa de músculo liso, conforme mostrado aqui para detecção espectral adicional além de quatro cores, consulte os documentos vinculados de dicas e truques para multiplexação de cinco ou mais sondas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a qualidade das imagens depende fortemente dos controles monocromáticos adequados utilizados.

Após este procedimento, outros métodos como hibridização fluorescente in situ podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como sobre compartimentos celulares e o microambiente tecidual tumoral. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão da nossa técnica de simulação, da interrogatória multiespectral de componentes multicelulares e, ao concluir este processo, deverá possuir um entendimento completo de como identificar múltiplos alvos celulares em um único lâmina. Como quantificar esses alvos celulares e ter uma boa compreensão da evolução do estroma tumoral ou do tecido regenerativo, ou do seu tecido de interesse.