Análise Quantitativa Multispectral Após transplante de tecido fluorescente para visualização das Origens celulares, Tipos e Interações

O objetivo do procedimento a seguir é usar a interrogação multiespectral de composições celulares multiplex ou mimetizar para determinar as contribuições de várias populações residentes na medula óssea para o desenvolvimento do estroma dos tumores. Isso é feito primeiro transplantando um camundongo receptor transgênico marcado com GFP com células-tronco da medula óssea que expressam RFP. Na segunda etapa, as células tumorais de interesse são injetadas no mesmo receptor e, após o enxerto, o tumor excisado é seccionado, embebido em parafina e marcado com anticorpos imunofluorescentes.

Em seguida, uma biblioteca espectral de todos os comprimentos de onda usados para adquirir imagens das seções do tumor é criada assim que a biblioteca espectral estiver completa. As lâminas são imageadas na etapa final, a análise dos dados é realizada para permitir a identificação e associação dos padrões de coloração dos marcadores celulares de interesse. Em última análise, novas entidades celulares ou fenótipos podem ser identificados com base na marcação multiplex de marcadores extracelulares e celulares para entender melhor a composição de tecidos complexos, como o microambiente tumoral.

A principal vantagem desta técnica sobre as técnicas de imunofluorescência padrão é que a análise multiespectral permite multiplexar sete ou mais fluoro fours na mesma lâmina, permitindo uma interrogação muito mais precisa e detalhada da composição celular do microambiente tumoral ou de um tecido regenerativo. Embora esse método possa fornecer informações sobre a origem e a composição do microambiente tumoral, ele pode ser aplicado a outros sistemas, como medicina regenerativa, biologia do desenvolvimento e biologia imunológica. Demonstrando este procedimento junto com o Dr.Spa está Chris Booth, um assistente de pesquisa em meu laboratório Devido à restrição de IU Cook nesta instituição, discutiremos, mas não mostraremos, nenhuma manipulação direta de camundongos em camundongos.

Esses procedimentos de medula óssea e nossas técnicas de enxerto de tumor podem ser encontrados em nosso trabalho anterior, como crianças e outras células-tronco. 2009 para começar após o isolamento das células da medula óssea dos membros posteriores espelhados, o resus suspende as células em 2 milhões de células por 100 microlitros de PBS por camundongo. Use uma lâmpada de calor para dilatar os vasos de um camundongo GFP receptor irradiado e coloque o camundongo em uma contenção de injeção na veia da cauda.

Usando uma agulha de calibre 29 com o lado chanfrado para cima, injete sistemicamente as suspensões celulares na cauda ou na veia retroorbital. Use gaze estéril para aplicar uma leve pressão na cauda após a injeção. Injete um camundongo com 100 microlitros de PBS apenas como controle de enxerto no dia da injeção.

Ressuspenda as células tumorais de interesse em PBS em 1 milhão de células por 100 microlitros. Depois de esterilizar o abdômen com 70% de etanol. Use uma mão para conter o mouse pela nuca e pela cauda e, com a outra mão, segure o lado chanfrado da agulha para cima e injete as células tumorais na cavidade interperitoneal do camundongo receptor.

Após 15 a 30 dias, eutanasiar os camundongos e extirpar o tumor de seu abdômen. Em seguida, fixe os tumores em formina a 10% por 24 horas. Em seguida, divida o tecido fixado em fatias de cinco a 10 micrômetros para procedimentos de coloração subsequentes.

Depois de fixar as seções de tecido em parafina, asse as amostras por uma hora a 56 graus Celsius. Em seguida, lave as lâminas de acordo com a seguinte sequência Após a última lavagem com etanol, lave as lâminas com água por dois minutos. Submergir lentamente e levantar o rack de coloração para dentro e para fora da água 10 vezes.

Em seguida, coloque o tampão de citrato de sódio no micro-ondas para aquecer. Depois de ferver as lâminas por 20 minutos em tampão citrato de sódio, deixe as amostras esfriarem no tampão por 30 minutos. Em seguida, lave com a água ionizada por mais cinco minutos.

Em seguida, retire a lâmina para deixar qualquer gota grande de água rolar, tome cuidado para não secar a seção de tecido. Use uma caneta de barreira hidrofóbica para marcar as seções ao redor das seções do tumor e, em seguida, coloque imediatamente um tampão de bloqueio na amostra para evitar que a seção do tecido seque. Após uma hora, incube as lâminas com o anticorpo primário de interesse em uma caixa de câmara de umidade em um agitador de rotação lenta a quatro graus durante a noite.

Na manhã seguinte, lave as lâminas duas vezes em PBST por 10 minutos de cada vez, agitando suavemente enquanto as seções estão sendo lavadas. Dilua os anticorpos secundários em uma proporção de um para 1000 anticorpos para tampão de bloqueio. Em seguida, incube as seções nos anticorpos secundários apropriados na caixa da câmara de umidade coberta com papel alumínio em um agitador de rotação lenta à temperatura ambiente Após duas horas.

Lave as lâminas duas vezes em PBST por cinco minutos com agitação suave e proteja-as da luz. Em seguida, pinte a lâmina dappy only e as lâminas de análise com DPI por um minuto, mantendo as lâminas cobertas durante a incubação. Colocando uma lamínula sobre cada amostra, sele as bordas de cada lamínula com endurecedor de unhas.

Agora, para realizar a imagem multiespectral, use uma objetiva de óleo para obter uma imagem inicial da lâmina de análise para obter os tempos de exposição adequados para cada uma das faixas espectrais na biblioteca espectral. Por exemplo, este esboço de tabela sugeriu protocolos de biblioteca espectral com base no número de andares quatro usados no experimento. Em seguida, crie uma imagem da lâmina não corada para a lâmina de fundo na biblioteca espectral para este experimento.

Próxima imagem, o slide não corado para obter a imagem de fundo para a biblioteca espectral. Agora a imagem de cada slide corado de controle de andar único quatro, salvando as imagens sob o nome do anticorpo secundário usado para cada slide. Quando a biblioteca suspeita estiver concluída, colete imagens das regiões de interesse no slide de análise para analisar imagens dos tecidos tumorais.

Primeiro, importe uma variedade representativa das imagens de nuances adquiridas usando o software informar. Em seguida, abra a biblioteca espectral segura conforme indicado pelo programa. Em seguida, identifique as regiões de interesse do tecido a serem analisadas.

Identifique células individuais com base na coloração DAPI. O citoplasma será identificado automaticamente com base na forma do núcleo. Agora escolha a leitura de intensidade fluorescente de escolha para cada parâmetro fluorescente e, em seguida, combine as imagens adquiridas, permitindo que o software processe os dados usando o algoritmo proposto.

Quando o processamento da imagem estiver concluído, mescle os arquivos resultantes. Em seguida, usando esta técnica de imagem multiespectral para analisar e representar graficamente os tumores neste modelo de camundongo transplante de medula óssea transgênico, os componentes do tumor estromal que são de origem da medula óssea foram discernidos por citometria de fluxo três semanas após o transplante de medula óssea. Então, seis semanas após a injeção inicial, as seções dos tumores ovarianos injetados não marcados foram analisadas após a criação de uma biblioteca espectral com lâminas de controle de cor única, imagens da seção do tumor ovariano corada com GFP DPI e dois outros marcadores foram analisados.

A adição de mais marcadores é possível. Por exemplo, aqui, a biblioteca espectral e a imagem que acompanha uma seção de tumor com seis marcadores mais uma coloração nuclear são mostradas usando o software informado. As regiões de tecido de interesse dentro da seção do tumor são classificáveis conforme mostrado nas imagens representativas mostradas aqui.

Por exemplo, esta imagem demonstra a classificação dos segmentos de tecido seguida da segmentação das células. Com base no dpi da mancha nuclear. A quantificação dos marcadores fluorescentes pode então ser medida no núcleo e no citoplasma de cada célula e exportada para análise posterior.

O algoritmo de segmentação de tecidos é capaz de identificar ainda mais os subtipos de tecidos com base na arquitetura do tecido e não apenas na identificação do fluorocromo, fornecendo uma ferramenta analítica mais robusta para classificar a coloração em regiões distintas do tecido. Nesta imagem, o computador foi treinado para identificar cinco sub-regiões com base nos padrões arquitetônicos dentro do tecido. O plano de fundo é definido por espaço em branco.

O tumor hemolítico é definido pela abundância de glóbulos vermelhos dentro do tecido. O tumor é definido pelas células densamente povoadas. A gordura é definida pelos grandes compartimentos celulares vazios simétricos e os músculos definidos por um padrão estriado.

Usando este método, uma população de células duplamente positivas pode ser analisada com base em um determinado limiar de intensidade fluorescente. Por exemplo, para células positivas de actina de músculo liso GFP positivo e alfa, conforme mostrado aqui para detecção espectral adicional além de quatro cores, consulte os documentos de dicas e truques vinculados para multiplexar cinco ou mais sondas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a qualidade das imagens depende muito dos slides de controle de cor única adequados usados.

Após este procedimento, outros métodos, como hibridização in situ de fluorescência, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como compartimentos celulares e tecido do microambiente tumoral. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de nossa técnica de mímica, a interrogação multiespectral de componentes multicelulares e, ao concluir isso, deve ter uma compreensão completa de como identificar vários alvos celulares em um slide. Como contabilizar Unix esses alvos celulares e ter uma boa compreensão da evolução do estroma tumoral ou tecido regenerativo, ou seu tecido de interesse.