Projeto de um biorreator Carregando Mecânica Biaxial para Engenharia de Tecidos

O objetivo geral do experimento a seguir é fabricar bio compósitos tridimensionais funcionais de tecidos projetados para transplante. Isso é alcançado mediante a aplicação de uma tensão mecânica precisa uniaxial ou biaxial para fornecer estímulos biofísicos às células em compósitos de biomateriais tridimensionais. Como segundo passo, o biorreator é equipado com uma célula de carga, que fornece realimentação de força e realização de testes mecânicos dos bio compósitos durante o carregamento.

Em seguida, os biocompósitos são cultivados por um período de semanas para induzir alterações em escala macroscópica na composição bioquímica e na resistência da estrutura; os resultados obtidos demonstram o efeito de diferentes tipos de carga com base nas diferenças significativas no conteúdo de glicosaminoglicanos e colágeno, no andamio, na espessura e no módulo de equilíbrio. Embora este método possa fornecer informações sobre os efeitos da carga biaxial em tecidos de cartilagem engenheirados, ele também pode ser aplicado a outros tecidos de baixa carga, como osso e tendão, demonstrando que o procedimento será realizado por Amy May e Rob Stefani do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, monte um biorreator biaxial conforme mostrado aqui.

A base do biorreator é composta por uma placa de alumínio com medidas de 25 centímetros por 30 centímetros por 12,5 milímetros. As opções variáveis de posicionamento permitem a montagem flexível de placas de cultura de tecidos de diferentes formas e tamanhos. Em seguida, certifique-se de que os estágios estejam montados na base de modo que o estágio horizontal proporcione cisalhamento dinâmico ao oscilar apenas ao longo do eixo x.

E o estágio vertical fornece compressão dinâmica ao oscilar apenas ao longo do eixo Z. O próximo passo é fabricar uma placa de carga personalizada de polissulfona. O material de polissulfona é ideal devido à sua biocompatibilidade, facilidade de usinagem e facilidade de esterilização.

Acople a placa à plataforma móvel biaxial por meio de um suporte em ângulo reto usinado com precisão. As paradas cinemáticas fixadas na placa de base possuem parafusos de ajuste fino que permitem o alinhamento preciso das placas de cultura, algo impossível de alcançar manualmente. Em seguida, conecte o atuador do motor de passo a cada plataforma, o qual fornecerá realimentação de posição ao software.

Os atuadores de motor de passo mostrados aqui possuem repetibilidade bidirecional de 0,1 micrômetro e resolução de 20 nanômetros, o que se traduz em uma precisão inferior a três micrômetros ao longo de 50 milímetros de curso. Controle os movimentos das plataformas utilizando o software de tecnologia avançada de posicionamento da Thor Labs. O software controla o motor de passo para ajustar independentemente e simultaneamente os parâmetros de carga de frequência e amplitude, tanto de cisalhamento quanto de compressão. Em seguida, posicione uma célula de carga miniatura de cinco libras entre o platô de carga e a plataforma móvel para fornecer o feedback de força necessário para detectar o contato entre o platina e os constructos, bem como para avaliar as respostas à carga.

Certifique-se de que a célula de carga tenha alta precisão de 0,15% a 0,25% da escala total e de que a unidade de exibição da célula de carga possua uma porta RS 232 para permitir a coleta de dados em um computador. Para imobilizar as amostras nos poços de uma placa de 24 poços, prepare um molde para um gel de agarose com 1,5 milímetro de espessura utilizando um sistema de moldagem de gel com espaçadores de 1,5 milímetro. Após a montagem, despeje uma solução de 4% de agarose entre as duas placas de vidro e deixe a mistura esfriar.

Em seguida, remova a placa superior e retire um disco de diâmetro de 16 milímetros do bloco de ágar. Para cada poço da amostra em cada disco, faça um orifício para colocar a amostra. Coloque os discos prontos nos poços de uma placa de 24 poços.

Em seguida, pressione construtos teciduais de 2,25 milímetros de espessura e 5 milímetros de diâmetro em cada suporte de gel. A amostra deve protruir da parte superior de cada suporte de aerossol. A seguir, adicione 1,5 mililitro de meio de cultura a cada poço e substitua a tampa.

Em seguida, coloque a placa novamente no incubador até o momento do carregamento das amostras. Para iniciar o carregamento mecânico dos constructos teciduais, fixe a placa de alumínio à célula de carga e prenda um conjunto de platina estéril ao estágio vertical em todos os momentos. O incubador deve funcionar em condições de baixa umidade para evitar falhas no instrumento.

Em seguida, ligue o controlador do motor de passo e o computador. Abra o programa do usuário da tecnologia de posicionamento avançado e vá até a guia de controle gráfico em ambas as telas. Pressione o botão de zero referência para enviar ambos os motores de passo para a posição zero, definida como a posição mais alta e mais à direita.

Prepare as amostras para o carregamento removendo parte do meio de cada poço para evitar transbordamento durante o carregamento mecânico. Em seguida, coloque a placa de 24 poços no biorreator e alinhe cuidadosamente a placa com o platina utilizando quatro localizadores cinemáticos ajustáveis, certificando-se de alinhar corretamente a placa. Alinhe com a frente da base do biorreator na guia de controle gráfico.

Ajuste manualmente com precisão. Ajuste o alinhamento clicando na caixa de posição para movê-la horizontalmente. Quando a placa estiver alinhada com os poços da placa, comece a baixar a placa até que entre em contato pela primeira vez com as amostras.

Uma vez alcançada a posição inicial, vá até a guia do sequenciador de movimentos e carregue a sequência de movimentos desejada pressionando carregar ou crie seu próprio programa conforme descrito no protocolo textual que acompanha este vídeo. Em seguida, pressione executar para iniciar o programa. O software orientará os motores a aplicar o regime de condicionamento desejado às amostras.

Quando o programa terminar, levante manualmente a placa para que ela ultrapasse o topo da placa de cultura de tecidos. Em seguida, remova a placa de 24 rodas do biorreator e substitua o meio. Por fim, remova cuidadosamente a platina do sensor de carga e desligue os instrumentos.

O uso do biorreator biaxial descrito neste vídeo teve um efeito significativo na quantidade de glicosaminoglicanos e colágeno secretados por células dentro de construtos de engenharia tecidual. O condicionamento ocorreu cinco dias por semana, durante três horas por dia, com uma deformação de compressão de 10% e uma deformação de cisalhamento de 5% a um hertz. Após 30 dias em cultura, a quantidade de glicosaminoglicanos e colágeno secretados por condrocitos expostos à carga foi significativamente maior do que nas amostras controle. A carga uniaxial aumentou significativamente apenas a quantidade de glicosaminoglicanos.

Além disso, a carga biaxial gerou construtos mais espessos, mas não mostrou efeito sobre a elasticidade dos construtos. Utilizando este protocolo de dosagem, após 30 dias de condicionamento e cultivo, seções transversais dos construtos teciduais foram coradas com marcadores típicos da cartilagem, incluindo azul de safranina O e colágeno tipo II. Os três grupos diferentes incluem ausência de condicionamento, carga uniaxial e carga biaxial.

Embora todos os grupos apresentem coloração positiva para Alcian Blue e Safranina O, as amostras com carga biaxial mostram quantidades aumentadas de colágeno tipo II em comparação com as amostras sem carga e com carga uniaxial. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aplicar cargas uniaxiais ou biaxiais em construtos teciduais em desenvolvimento.