Name: Isolamento, processamento e análise de células gengivais murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a isolar e processar gengiva murina para análise por citometria de fluxo. Este método permite estudar populações celulares e respostas imunológicas em modelos de periodontite experimental.

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Esta pesquisa foi apoiada por doações da Fundação para a Ciência Israel (n º 1418/11) para AHH e (n º 1933/12) para AW, a Fundação israelense alemão para jovens investigadores (GIF jovem) para AHH, eo Dr. I . Fundo Cabakoff Research Endowment da Universidade Hadassah-Faculdade de Medicina Dentária de AHH e AW hebraico.

Prepare-se com antecedência: <ul><li> PBS + FCS a 2% </li><li> PBS + FCS a 2% com 2 mg / ml de colagenase de tipo II e de 1 mg / ml de ADNase tipo I (1 ml para cada amostra) </li><li> Instrumentos cirúrgicos esterilizados </li><li> Solução de EDTA 0,5 M </li></ul> 1. Superior Técnica Excisão Gengival <ol><li> Eutanásia ratos usando orientação IACUC aprovado. </li><li> Corte ambos os lados da cavidade oral, incluindo as bochechas e do ramo da mandíbula com uma acentuada / blunt tesoura reta. </li><li> Puxe para baixo a mandíbula. </li><li> Cortar os tecidos moles e duros por uma linha imaginária que 1 milímetro atrás dos molares terços padrão com uma tesoura. Dirigir a tesoura perpendiculares ao plano do osso palatino (Figura 2A, linha azul). </li><li> Inciso os tecidos duros e moles 2 milímetros por trás dos incisivos (Figura 2A, linha azul). </li><li> Puxe para baixo a parte anterior da boca. A cavidade nasal é observável após esta etapa. </li><li> Coloque a tesouraparalelo ao paladar, colocar uma lâmina para dentro da cavidade nasal, a outra lâmina deve incisão no vestíbulo. Corte até a incisão posterior (Figura 2A, as linhas verdes). Repetir esta etapa em ambos os lados do maxilar. No final da maxila é separada do resto do crânio (Figura 2B). </li><li> Retire a maxila, cortá-lo no meio de sutura (Figura 2, linha tracejada preta) e cortar o tecido palatal de cada hemi-maxila até atingir o osso alveolar. </li><li> Descasque os tecidos gengivais (ambos hemi-maxilas) a partir de sua borda anterior com Adson fórceps (sem dentes). </li><li> Coloque a gengiva excisada numa placa com PBS + 2% de FCS. </li></ol> 2. Gengival Processamento <ol><li> Coloque a gengiva excisadas num prato de cultura de tecido (35 x 10 mm) com 1 ml de PBS + FCS a 2%, 2 mg / mL de colagenase tipo II e 1 mg / ml de ADNase tipo I. </li><li> Picar bem o tecido com um N ° 15 lâmina cirúrgica estéril. </li><li> Transfer o tecido da placa para um tubo de ensaio de 15 mL cónico. </li><li> Lave as células de tecido / remanescentes na placa com 1 ml de PBS + FCS a 2% e de transferência para o mesmo tubo de ensaio. </li><li> Incubar numa incubadora num agitador durante 20 min a 37 ° C, 200 rpm (recomendação: pré-aquecimento da incubadora). </li><li> Adicionar 20 ul de EDTA 0,5 M e incubar durante mais 10 min a 37 ° C, 200 rpm. </li><li> Encher o tubo de ensaio até 12 ml com PBS + FCS a 2% e centrifugação a 4 ° C, a 400 xg, durante 8 min (recomendação: pré-frio a centrífuga). </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 2 ml de PBS + FCS a 2%. </li><li> Filtrar a amostra com 70 mM de células-filtro e salvar fluir. </li><li> Centrifugar a 4 ° C, 320 xg durante 5 min. </li><li> Remover as células sobrenadante e ressuspender com 300 mL PBS + 2% FCS. </li><li> Contar as células (5 x 10 células de aproximadamente 5-10 são esperados a partir de uma única maxila). </li></ol> 3. Anticorpo extracelular e intracelularColoração por citometria de fluxo Recomenda-se a trabalhar dentro de uma capa, com as luzes apagadas. É crítico para manter as células em ambiente frio constante, bem como todos os materiais necessários. <ol><li> Stain células contra moléculas extracelulares adicionando 0,2-0,5 ug de cada anticorpo seleccionado por 1 x 10 6 células, num volume total de 100 ul. </li><li> Vortex brevemente. </li><li> Incubar os tubos durante 15 min no escuro a 4 ° C. </li><li> Lavar as células com 2 ml de PBS + FCS a 2%. </li><li> Centrifugar a 4 ° C, 320 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar células sobrenadante e ressuspender adicionando, gota a gota, 500 mL frio BD Cytoperm / Cytofix enquanto vortex. </li><li> Incubar os tubos durante 40 minutos a 4 ° C no escuro. </li><li> Vortex brevemente. </li><li> Lave as células duas vezes com 1 ml de frio BD Perm / Wash tampão e centrifugação a 800 xg durante 7 minutos a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante exceto para 300 ml. </li><li> Mancha células intracelular poradição de 1 ug de cada anticorpo seleccionado por 1 x 10 6 células, num volume total de 100 ul. </li><li> Vortex brevemente. </li><li> Incubar durante 30 min no escuro a 4 ° C. </li><li> Lave as células duas vezes com 1 ml de frio BD Perm / Wash tampão e centrifugação a 800 xg durante 7 minutos a 4 ° C. </li><li> Aspirar células sobrenadante e ressuspender adicionando 300 ml BD Perm / Wash Buffer frio. </li><li> Vortex brevemente. </li><li> Transferir a suspensão enquanto a filtragem para tubos FACS. </li><li> Manter os tubos em um ambiente escuro e frio até à análise. </li></ol>

<ol><li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cells+down-regulate+inflammation-driven+alveolar+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Listgarten, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).</li>
<li>Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causation+and+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol%22%5BJournal%5D)">Causation and pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontol. 25, 8-20 (2000).</li>
<li>Jotwani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+dendritic+cells+infiltrate+the+T+cell-rich+region+of+oral+mucosa+in+chronic+periodontitis%3A+in+situ%2C+in+vivo%2C+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies.</a> J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).</li>
<li>Graves, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+antagonists+inhibit+the+progression+of+inflammatory+cell+infiltration+toward+alveolar+bone+in+experimental+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis.</a> J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).</li>
<li>Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+chemokine+%28MCP-1%2C+MIP-1alpha%2C+MIP-1beta%2C+IP-10%2C+RANTES%29-positive+cells+and+chemokine+receptor+%28CCR5%2C+CXCR3%29-positive+cells+in+inflamed+human+gingival+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues.</a> Cytokine. 20, 70-77 (2002).</li>
<li>Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+dynamics+in+human+gingiva+during+experimentally+induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Buccale%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation.</a> J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).</li>
<li>Cochran, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+bone+loss+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and bone loss in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).</li>
<li>Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response%3A+the+key+to+bone+resorption+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).</li>
<li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Tecidos gengivais Maxilla obtidos a partir de um único rato são suficientes para análise de sub-populações de linfócitos T e B, bem como a sua capacidade para expressar moléculas extracelulares e intracelulares, como previamente descrito 1. No entanto, se as populações de células raras são de interesse (por exemplo, DCs), recomenda-se a tecidos de piscina 2-3 ratinhos. De nota, se preferível, é possível descascar ambos os tecidos gengivais e palatal e, depois, para extirpar a gengiva (uma modificação do passo...

Gengiva é o tecido macio em torno da porção cervical dos dentes e cobre o processo alveolar (Figura 1). A gengiva é um tipo de mucosa mastigatória que podem ser ainda separadas no epitélio da mucosa e do tecido conjuntivo (também conhecido como submucosa ou lâmina). A estrutura anatômica da gengiva e dentes adjacentes permite que as bactérias para residir e desenvolver placa (biofilme) que desafia constantemente o sistema imunológico local. Como resultado, a resposta inflamatória desenvolve na gengiva, o que, em determinadas circunstâncias torna-se destrutiva - uma situação designada por doenças periodontais 2. Basicamente, patologias periodontais placa induzidos podem ser divididos em gengivite e periodontite. Gengivite representa uma condição reversível da resposta inflamatória local que está confinada ao gengiva. A periodontite, por outro lado, é um processo de destruição irreversível em que o aparelho de fixação (osso alveolar, periodontalligamento, cemento e gengiva) é destruído 3. A gengiva foi proposto para servir tanto locais como efectoras e indutivo durante quatro doenças periodontais. Estudos em humanos têm sugerido que, em resposta a placa dental, células efetoras imunes e as moléculas se infiltrado ou partida da gengiva 5-7 dinamicamente. Esta actividade foi demonstrado desempenhar um papel importante na destruição periodontal 8,9. Considerando que os dados gerados por esses estudos forneceram informações valiosas sobre esse processo patológico, trabalhando com os tecidos humanos possuem grandes limitações éticas, técnicas e experimental. O desenvolvimento de modelos experimentais permitiram experimentações de causa-efeito via empregando camundongos transgênicos e intervenções vivo 10. Como resultado, o nosso conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na doença periodontal aumentaram consideravelmente durante as últimas duas décadas. Ainda assim, devido à complexidade da doença periodontal, não existeum debate em curso sobre a natureza da resposta imune local facilitando a destruição dos tecidos. Há também uma falta de compreensão sobre a função das células imunitárias centrais na gengiva durante as doenças periodontais. É, portanto, essencial para estudar eventos inflamatórios patológicos que ocorrem no tecido alvo da doença da gengiva.

<table><tbody><tr><td>Colagenase Tipo II</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>CLS-2</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E6758-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino </td><td>Biological Industries</td><td>04-121-1</td><td>Filtro Inativado a Vácuo por Calor</td></tr><tr><td>Jet</td><td>Biofil</td><td>FPE-204-500</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Poliestireno Fundo Redondo Tubo</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 &mu; m</td><td>SPL Lifesciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos 35&#215; 10 mm</td><td>NUNC</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-camundongo CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117305</td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-camundongo CD45.2</td><td>Biolegend</td><td>109819</td><td>Clone 104</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-camundongo CD4</td><td>Biolegend</td><td>100413</td><td>Clone GK1.5</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-camundongo CD8a</td><td>Biolegend</td><td>100733</td><td>Clone 53-6.7</td></tr><tr><td>Anticorpo CD3 anti-rato</td><td>Biolegend</td><td>100214</td><td>Clone 17A2</td></tr><tr><td>Anti-rato CD326 (Ep-CAM) Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>118219</td><td>Clone G8.8</td></tr><tr><td>Anti-rato CD207 (Langerina) Anti-rato</td><td></td><td>DDX0362D</td><td>Clone 929F3.01</td></tr><tr><td>Anti-rato I-Ad (MHC-II) antocorpo</td><td>Biolegend</td><td>115010</td><td>Clone 39-10-8</td></tr><tr><td>LSR II Citômetro de Fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v 7.6.5</td><td>Tree Star</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, processamento e análise de células gengivais murino

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Desenvolvemos uma técnica para isolar e processar o tecido gengival murino por citometria de fluxo, os estudos moleculares e com precisão. A gengiva é um tecido único e importante para estudar os mecanismos imunitários, porque está envolvido na resposta imune do hospedeiro contra o biofilme oral, que podem provocar doenças periodontais. Além disso, a proximidade da gengiva para o tecido do osso alveolar também permite estudar a remodelação óssea em condições inflamatórias. Nosso método produz grande quantidade de células do sistema imunológico que permite a análise de até populações raras células, tais como células de Langerhans e células T reguladoras como demonstramos anteriormente 1. Empregando ratinhos para estudar as respostas imunitárias locais envolvidos na perda de osso alveolar durante as doenças periodontais, é vantajoso, devido à disponibilidade de várias ferramentas imunológicas e experimental. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho e ao acesso relativamente inconveniente para a gengiva murino, muitos estudos evitada exame de this tecidos críticos. O método descrito neste trabalho podem facilitar a análise de gengiva, que poderá aumentar a atenuante no sistema imunitário por via oral e o seu papel durante as doenças periodontais.

São apresentados exemplos de análise de citometria de fluxo em células gengivais. Células gengivais agrupados a partir de dois ratos foram executados em um citômetro de fluxo LSR II e analisados ​​usando o software FlowJo. Figura 3A demonstrou a distribuição de células gengivais de camundongos ingênuos em uma dispersão lateral (SSC) em relação ao gráfico de dispersão (FSC). Gating estratégia para identificar (i) os linfócitos (ii) os monócitos / células dendríticas e (iii) os granulócitos é indicado. Pa...

Este estudo descreve uma técnica eficiente para isolar e processar tecido gengival da cavidade oral do rato de modo a produzir uma cultura de uma única célula. As células resultantes podem ser ainda utilizado para a análise de citometria de fluxo e os estudos moleculares.

Isolamento, processamento e análise de células gengivais murino

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e processar com precisão a gengiva murina para posterior análise por citometria de fluxo. Isso é realizado primeiramente isolando cirurgicamente a gengiva de maneira meticulosa. Em seguida, o tecido excisado é processado para gerar uma suspensão de células simples.Em seguida, realiza-se a marcação extracelular e intracelular com anticorpos. Por fim, a amostra é analisada por citometria de fluxo. Em última instância, podem ser obtidos resultados que mostram diferentes populações celulares na gengiva e alterações celulares que ocorrem no tecido após exposição a um insulto imunológico, mediante análise por citometria de fluxo.A principal vantagem desta técnica, em comparação com métodos como a química em OC ou a fluorescência única, é que se trata de um método rápido e simples para analisar um grande número de células, permitindo a análise simultânea de diversas variáveis, bem como a separação de vários tipos celulares para experimentações posteriores. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunologia, como a forma como microrganismos influenciam a homeostase gengival e como isso se relaciona com a perda óssea

isolation-processing-and-analysis-of-murine-gingival-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um protocolo otimizado para o isolamento de células-tronco a partir da glândula salivar do mouse é descrito. O método emprega digestão enzimática e mecânica, e permite o isolamento de salispheres contendo células com características de células-tronco.

Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

Fonte: Choi, Y. S., et al. Detecção in situ de bactérias em tecidos embutidos em parafina usando uma sonda de DNA marcada com digoxina direcionada ao rRNA 16S. J. Vis. Exp. (2015).Este vídeo demonstra a detecção in situ de bactérias em seções de tecido gengival de camundongos usando sondas de DNA marcadas com digoxinas direcionadas ao DNA bacteriano. A seção é incubada com a sonda. Anticorpos conjugados com fosfatase alcalina específicos da digoxina são adicionados. Fosfatases endógenas são...

Detecção In Situ de Bactérias em Seções de Tecido Gengival de Camundongos

Este vídeo demonstra o procedimento de isolamento da rede de células imunes gengivais de um modelo de camundongo. A digestão enzimática libera o tecido gengival dos dentes e ossos aderidos, que é digerido mecanicamente, liberando células imunes da gengiva. As células isoladas estão prontas para experimentos imunológicos.

Isolamento da Rede de Células Imunes Gengivais de Blocos de Dentes Murinos

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

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Isolamento, caracterização e exploração funcional da célula de rede gengival Imune

Esforços para entender a função microglial no detalhe tem sido prejudicados pela falta de modelos de cultura microglial que recapitular as propriedades de micróglia maduro na vivo . Este protocolo descreve uma abordagem de isolamento e cultura projetada para manter a sobrevivência robusta de rato maduro altamente ramificados microglia sob condições definidas e médias.

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A glândula lacrimal (LG) tem dois tipos de células expressando α-actínio do músculo liso (αSMA): células mioepiteliais (MECs) e pericytes. Os MECS são de origem ectodérmica, encontrados em muitos tecidos glandulares, enquanto os pericitos são células musculares lisas vasculares de origem endodérmica. Este protocolo isola MECS e pericitos de LGS murino.

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O protocolo atual apresenta um método rápido, eficiente e suave para isolar células únicas adequadas para análise de RNA-seq unicelular a partir de um incisivo de rato em crescimento contínuo, molar de rato e dentes humanos.

Isolamento rápido de células únicas de dentes humanos e de camundongos

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