Isolamento, processamento e análise de células gengivais murino

O objetivo geral deste procedimento é isolar e processar com precisão a gengiva murina para posterior análise por citometria de fluxo. Isso é realizado primeiramente isolando cirurgicamente a gengiva de maneira meticulosa. Em seguida, o tecido excisado é processado para gerar uma suspensão de células simples.

Em seguida, realiza-se a marcação extracelular e intracelular com anticorpos. Por fim, a amostra é analisada por citometria de fluxo. Em última instância, podem ser obtidos resultados que mostram diferentes populações celulares na gengiva e alterações celulares que ocorrem no tecido após exposição a um insulto imunológico, mediante análise por citometria de fluxo.

A principal vantagem desta técnica, em comparação com métodos como a química em OC ou a fluorescência única, é que se trata de um método rápido e simples para analisar um grande número de células, permitindo a análise simultânea de diversas variáveis, bem como a separação de vários tipos celulares para experimentações posteriores. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunologia, como a forma como microrganismos influenciam a homeostase gengival e como isso se relaciona com a perda óssea induzida por inflamação em um modelo experimental de periodontite. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando começamos a investigar o papel das células RI durante a periodontite. A demonstração visual deste método é essencial, pois a técnica de aceleração GVA é difícil de aprender devido ao pequeno tamanho e ao acesso relativamente inconveniente à MU one J gva.

Para começar, prepare as soluções de meio e os instrumentos cirúrgicos esterilizados de acordo com o protocolo descrito no texto. Após eutanasiar um camundongo, conforme os métodos aprovados pelo comitê de cuidado e uso de animais da sua instituição, use tesoura reta fina e romba para cortar ambos os lados da cavidade oral, incluindo as bochechas e o ramo da mandíbula, e puxe a mandíbula para baixo, orientando a tesoura padrão perpendicularmente ao plano do osso palatino. Corte os tecidos moles e duros ao longo de uma linha imaginária, um milímetro atrás dos terceiros molares.

Em seguida, faça uma incisão nos tecidos mole e duro, dois milímetros atrás dos incisivos. Depois, puxe para baixo a parte anterior da boca para expor a cavidade nasal com a tesoura paralela ao palato. Insira uma das pontas da tesoura na cavidade nasal e use a outra para fazer uma incisão no vestíbulo, cortando até a incisão posterior.

Repita a incisão no outro lado da maxila para destacá-la do crânio. Em seguida, corte-a ao meio e remova o tecido palatino de cada hemimaxila para expor o osso alveolar utilizando abs e pinças. Desprenda os tecidos gengivais da borda anterior e coloque-os em uma placa com PBS e 2% de soro bovino fetal ou FCS para processar a gengiva; transfira-o para uma placa de cultura com um mililitro de PBS contendo dois miligramas por mililitro de colagenase tipo dois e um miligrama por mililitro de DNAse.

Corte com uma lâmina cirúrgica estéril número 15. Pique bem o tecido antes de transferi-lo para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave as células teciduais remanescentes da placa com um mililitro de P-B-S-F-C-S e transfira para o tubo.

Incube o tecido em um incubador agitado pré-aquecido a 37 graus Celsius e 200 rpm por 20 minutos. Em seguida, adicione 20 microlitros de EDTA 0,5 molar e incube por mais 10 minutos. Depois, adicione P-B-S-F-C-S até 12 mililitros e centrifugue a amostra a quatro graus Celsius, 400 vezes G, por oito minutos.

Após remover o sobrenadante, ressuspenda as células em dois mililitros de P-B-S-F-C-S. Filtre a amostra através de um filtro celular de 70 mícrons após centrifugar o fluxo passante a quatro graus Celsius e 320 vezes G durante cinco minutos. Ressuspenda as células em 300 microlitros de P-B-S-F-C-S.

Por fim, conte as células trabalhando sob uma capela com temperatura fria e luzes apagadas em um volume total de 100 microlitros, adicione 0,2 a 0,5 microgramas de cada anticorpo selecionado por um vezes 10 à sexta células e vortex brevemente. Após incubação das amostras a quatro graus Celsius por 15 minutos no escuro, adicione dois mililitros de P-B-S-F-C-S e centrifugue a 320 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos. Para fixar as células, aspire o sobrenadante e, em seguida, enquanto vortexa, ressuspenda-as adicionando gota a gota 500 microlitros de BD cyto perms frio.

Incube os tubos a quatro graus Celsius no escuro por 40 minutos após o vórtex de incubação. Em seguida, adicione brevemente um mililitro do tampão BD Perm Wash e centrifugue a 800 × g a quatro graus Celsius por sete minutos. Após repetir a lavagem, aspire todo o volume, exceto 300 microlitros do tampão de lavagem.

Em seguida, para corar as células intracelularmente em um volume total de 100 microlitros, adicione um micrograma de cada anticorpo selecionado por um vezes 10 à sexta potência de células. Agite brevemente em vórtex e incube no escuro por 30 minutos. Após lavar as células duas vezes como antes e remover todo o sobrenadante, ressuspenda as células em 300 microlitros de tampão BD Perm/Wash fresco e frio.

Após uma breve agitação em vórtex, filtre a suspensão em tubos de fax. Mantenha os tubos no gelo ou na geladeira, no escuro, até o momento de realizar a análise de fax. Células gengivais reunidas de dois camundongos ingênuos.

Foram realizadas em um citômetro de fluxo LSR dois e analisadas usando o software FlowJo. Os gráficos de dispersão lateral e dispersão frontal mostrados aqui demonstram a distribuição das células. A estratégia de seleção para identificar linfócitos, monócitos, células dendríticas e granulócitos é indicada para fins comparativos.

Esta figura representa um gráfico de citometria de fluxo ilustrando células gengivais purificadas de camundongos infectados com P. gingivalis 21 dias após a gavagem oral, no contexto de periodontite experimental. Um aumento nas diversas populações de células imunes pode ser facilmente detectado nos camundongos infectados em comparação com os camundongos ingênuos mostrados aqui. As células imunes na gengiva processada são identificadas por seleção de células que expressam o marcador hematopoético CD45.

Essas células foram ainda segregadas em linfócitos T CD3 positivos, mostrados nesta figura. Os neutrófilos também foram identificados de acordo com a expressão das moléculas LY6G e CD11B. Por fim, as células de Langerhans e o subconjunto epitelial de células dendríticas foram identificados por meio do direcionamento em células positivas para MHC classe II e CD11C positivas e pela expressão de EPAM e RINCD207. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três horas e meia a cinco horas, se for feita corretamente, seguindo este procedimento.

Outros métodos, como PCR em tempo real, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a expressão gênica em célula única, após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de imunologia explorarem a resposta local na AVEG frente a qualquer agressão no campo da pesquisa periodontal. Esta técnica nos permitiu elucidar o papel das células imunes e não imunes da AVEG na patogênese da periodontite experimental.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e processar GVA urinária para obter uma suspensão de células únicas, que será posteriormente submetida a uma coloração viral extracelular e intracelular para análise por citometria de fluxo.