Accelerated Diabetes Tipo 1 Indução em Ratos por transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 +

O objetivo geral deste procedimento é induzir rapidamente o diabetes tipo um em camundongos, transferindo células T diabetogênicos de camundongos transgênicos para camundongos, que não possuem células T e B endógenas. Comece colhendo os baços e gânglios linfáticos dos camundongos doadores e purificando as quatro células T positivas do CD. Em seguida, adotivamente, transfira as células T do doador purificadas para camundongos receptores não deslizantes.

Em seguida, monitore os camundongos receptores quanto ao desenvolvimento de diabetes tipo um. Em última análise, este protocolo pode ser usado para estudar a patogênese do diabetes e investigar intervenções terapêuticas em comparação com outros métodos. A principal vantagem desta técnica de transferência de BDC 2.5, CD quatro células T positivas para receptores não skid é o desenvolvimento rápido e reprodutível do diabetes tipo um.

Para doadores do CD diabetogênico, quatro células T positivas usam camundongos BDC 2,5 fêmeas pré-diabéticas de seis semanas de idade que foram determinados como livres de diabetes pela medição da glicose na urina. Para remover o baço e os gânglios linfáticos, molhe o pelo com etanol 70%, corte a pele, retraia a pele até que os músculos dos membros anteriores fiquem expostos. Perto da base dos membros anteriores, dois gânglios linfáticos de cada lado devem ser visíveis Segure cuidadosamente cada linfonodo com uma pequena pinça e remova-o aparando o tecido conjuntivo.

Em seguida, faça uma incisão de uma polegada no peritônio usando a tesoura pequena. Agora segure suavemente o baço no centro. Apare cuidadosamente o tecido conjuntivo e a gordura aderida.

Em seguida, remova o baço, renda, baço e gânglios linfáticos em 10 mililitros de DMEM no gelo. Com a ponta de um êmbolo de seringa estéril de 10 mililitros, pressione suavemente os órgãos linfóides através de um filtro de células de 70 micrômetros. Para obter uma suspensão de célula única.

Enxágue cada filtro com um mililitro de DMEM várias vezes para maximizar a recuperação das células. Em seguida, transferir as células recolhidas para um tubo cónico de 15 mililitros e centrifugar a 400 Gs durante sete minutos. À temperatura ambiente, suspenda novamente o pellet celular em três mililitros de um tampão CK.

Agora incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Para lixívia os glóbulos vermelhos, adicione agora 12 mililitros de DMEM e pelete as células por centrifugação. Lave o pellet celular uma vez em 10 mililitros de DMEM.

Em seguida, suspendemos as células em cinco mililitros de tampão de coloração de fato e usamos um microscópio de contraste de fase e hemocitômetro para contar o número de células viáveis. Agora remova cerca de uma vez 10 das seis células por controle de coloração. Também core as células com anticorpos monoclonais de camundongo para classificar as quatro células T positivas para CD transgênicas não ativadas.

Incube todas essas amostras a quatro graus Celsius no escuro por 30 minutos. Agora lave as células com três vezes o volume de coloração do tampão de fax e ressuspenda as células no tampão de fax uma a duas vezes 10 elevado a sete células por mililitro para classificar a amostra e 300 microlitros para controles de coloração única. Em seguida, passe a amostra de célula por um tubo de filtro de célula de 35 micrômetros.

Para remover aglomerados de células, processe as amostras para um classificador de células com um operador treinado Aguarde cerca de três horas, incluindo o tempo de configuração, para classificar cerca de 1,5 vezes 10 elevado ao oitavo total CD ingênuo transgênico quatro células T positivas. Você pode esperar cerca de 2,5 vezes 10 das seis células por camundongo e a taxa de classificação será de cerca de duas vezes 10 dos quartos eventos por segundo em um instrumento como o BD Fox Aria. Colete as células classificadas em três mililitros de DMEM.

Registar o número absoluto de células triadas e centrifugá-las durante sete minutos. A 400 Gs, suspendemos os grânulos celulares em solução salina tamponada com fosfato estéril para a transferência adotiva de células T. Usando uma seringa de um mililitro em uma agulha de calibre 18, ressuspenda suavemente as células T positivas do CD purificadas por fax.

Carregue a seringa de um mililitro e, em seguida, na preparação para a injeção, coloque uma agulha de calibre médio de 27 pontos na seringa. Contenha os camundongos receptores de derrapagem de nó e limpe sua cauda com etanol 70% para desinfetar o local da injeção. Em seguida, injete uma vez o décimo dos seis CD purificados quatro células T positivas por camundongo em qualquer uma das veias laterais da cauda.

Ao fazer as injeções na veia da cauda, certifique-se de não forçar o êmbolo. Se a agulha estiver realmente na veia, sua injeção deve ocorrer quase sem resistência Começando cinco dias após a transferência de células T. Monitore os camundongos receptores de skid nod diariamente para o desenvolvimento de diabetes tipo um.

Meça a glicose na urina usando tiras reagentes de acordo com os fabricantes e instruções. Observe que camundongos com duas leituras consecutivas de glicose na urina superiores a 250 miligramas por decilitro são considerados diabéticos. Em um experimento típico, cada camundongo doador BDC 2.5 produz cerca de duas vezes e meia 10 das seis células T transgênicas virgens de quatro células T positivas após a classificação de células após a transferência adotiva de células T diabetogênicos de quatro células T positivas, os camundongos foram monitorados quanto às concentrações de glicose na urina.

A transferência adotiva de um pequeno número de células de camundongos doadores BDC 2.5 induziu diabetes tipo um em todos os receptores antiderrapantes no dia 11. Quando feita corretamente, essa técnica pode ser feita em aproximadamente oito horas, desde a coleta do órgão até a transferência de células T.