Name: A aplicação de um In vitro DNA Assay Proteção ao Visualize Propriedades Mediação stress do Dps Protein (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Aprenda a purificar a proteína Dps de E. coli e avaliar seu efeito protetor contra danos oxidativos no DNA usando eletroforese. Este método permite visualizar a atividade antioxidante in vitro.

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Somos gratos a Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, e Kourosh Honarmand Ebrahimi para discussões úteis. Este trabalho foi apoiado por fundos start-up da Universidade Delft de Tecnologia.

1. Dps Expressão e purificação Obtenção de proteína de alta pureza é um primeiro passo essencial para o ensaio de protecção de ADN. A purificação da proteína pode ser realizada Dps em 4 a 5 dias. <ol><li> Transformar uma estirpe de protease deficiente de E. coli (tal como BL21 (DE3) pLysS), com um vector pET (por exemplo, pET17) na qual a sequência de codificação de proteína Dps foi clonado. </li><li> Streak as células transformadas para fora em Caldo (LB) ágar Luria contendo antibióticos apropriados (como ampicilina e cloranfenicol para os exemplos fornecidos em 1.1). Incubar as placas durante a noite a 37 ° C. </li><li> Inocule uma colónia isolada a partir da placa em 30 ml de meio LB contendo antibióticos apropriados. Incubar durante a noite a 37 ° C enquanto agitando a 200-250 rpm. </li><li> Inocular 2 x 1 L de meio LB contendo antibióticos adequados com 10 ml cada uma da cultura durante a noite. Crescer a 37 ° C, sob agitação, a DO600 </sub&gt; de aproximadamente 0,6. (Cultivo de células mais elevada aumenta o rendimento de proteína OD, sensivelmente sem comprometer a pureza do produto final.) Induzir a expressão de Dps pela adição de IPTG para uma concentração de 0,3 mM e incuba-se a 37 ° C durante 3-4 horas, com agitação. </li><li> Colheita de células por centrifugação a 6000 xg durante 15 min. Voltar a suspender as pelotas de células em 7,5 ml de DEAE tampão A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 0,1 mM) por L de cultura celular induzida. As amostras podem ser congeladas em azoto líquido e armazenadas a -80 ° C, se se desejar. O processo pode então ser continuada por descongelamento das amostras num banho de água a 4 ° C. </li><li> Adicionar uma mistura de inibidores de protease (tais como os inibidores da protease Calbiochem Conjunto III, em 0.167 mL por ml de suspensão de células) para a suspensão de células para evitar a degradação de Dps overexpressed. </li><li> Prepare extrato livre de células utilizando uma prensa francesa. Primeiro a imprensa francesa, com 20 ml DEAE tampão A (se estiver usando um modelo de fluxo contínuo), então disrupt a amostra duas vezes a 20 kpsi. Centrifuga-se o ligado a 30.000 x g durante 35 min a 4 ° C para clarificar as partículas insolúveis, e guardar o sobrenadante. O sobrenadante pode então ser congelados usando azoto líquido e armazenadas a -80 ° C, se se desejar. </li><li> Equilibrar a coluna de 30 ml de DEAE Sepharose CL-6B DEAE com Tampão A, utilizando um FPLC. Executar tampão através da coluna a 1-2 ml / min, com uma pressão máxima de 0,2 MPa ao longo do fundo. Carregar o extracto isento de células para a coluna, e começa a receber o fluxo através de uma vez que o sinal de OD 280 começa a subir acima da linha de base. Lava-se a coluna com DEAE Tampão A até que o valor de DO 280 retorna à linha de base, enquanto continuamente recolhendo o escoamento. O fluxo através deve conter a maior parte da proteína de Dps, isenta de ADN ligado. Lava-se a coluna com 100% de tampão B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 1 M, EDTA 0,1 mM). Este fluido contém complexos Dps-DNA, bem como outras proteínas e pode ser descartada. </li><li> Remover anúnciocional proteínas contaminantes através de precipitação com sulfato de amónio. Determinar o volume de fluxo através reunidas. Lentamente (durante um período de 10-20 minutos) adicionar sulfato de amónio de pequeno grão seco a 62% de saturação (390 mg por ml de solução), a 4 ° C, enquanto se agitava bem. Agita-se a mistura durante um adicional de 20-30 minutos após a adição da última porção de sulfato de amónio para assegurar o equilíbrio completo. Dps permanecerá solúvel, enquanto que as proteínas contaminantes irá precipitar para fora da solução. </li><li> Remover as proteínas precipitadas por centrifugação a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C e guardar o sobrenadante. </li><li> Lentamente, adicionar uma mg de sulfato de amónio adicional por 227 ml de sobrenadante para atingir 94% de saturação e agitar durante 20-30 minutos para garantir o equilíbrio completo. Dps precipita nesta concentração elevada de sal e pode ser recolhido por centrifugação a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Dps estará na pelete eo sobrenadante pode ser descartado. O sedimento pode ser armazenada a -80 ° C, se desired. </li><li> Ressuspender o DPS contendo sedimento em tampão de ressuspensão (50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 0,1 mM). Ajustar o volume da amostra de 2,5 ml. </li><li> Tampão de troca para remover o sulfato de amónio, utilizando uma coluna de filtração em gel PD-10. Equilibrar o leito de gel com 25 ml de tampão de ressuspensão. Aplique a 2,5 ml de amostra Dps para o topo da coluna PD-10 e deixe de molho dentro Descarte o flow-through. Recolhe Dps por eluição com 3,5 ml de tampão de ressuspensão. </li><li> Centrifuga-se o tampão permutado amostra a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C para remover todos os componentes insolúveis, e diluir com 6-10 ml de tampão de diluição (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, EDTA 0,1 mM), para assegurar que o concentração de sal é baixo o suficiente para Dps de se ligar à coluna Sepharose SP. Particularmente as amostras concentradas de Dps pode tornar-se menos solúvel por diluição para um tampão de menor sal, como evidenciado pela turvação do líquido, mas pode ser completamente ressolubilizado por meio da adição de uma pequena amount de solução de NaCl a 5 M (um adicional de 10-20 mM). </li><li> Equilibrar a coluna de fluxo de 30 ml de SP Sepharose Fast Food SP com tampão A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM). Executar tampão através da coluna a 1,5-2 ml / min, com um limite de pressão de 0,3 MPa ao longo do fundo. Carregar a amostra sobre a coluna. Lavar com SP tampão A até o OD 280 trace retorna à linha de base, e descartar o flow-through. Executar um gradiente linear de 150 ml de 0 a 100% de tampão B, enquanto recolhendo fracções de 2 ml. Dps vai eluir em um pico acentuado em torno de 50% B, embora a variação de 10% é possível. </li><li> Continuar as fracções de eluição em um gel SDS-PAGE 15%, e para verificar a contaminação de ADN medindo a razão OD 260 / OD 280 utilizando um espectrofotómetro. O gel só deve mostrar uma banda em torno de 19 kDa, eo OD 260 / OD 280 é normalmente em torno de 0,7. Reunir as frações mais puras PD. Usar uma unidade de filtro de centrífuga (tais como a unidade de ultrafiltração Amicon), com uma10K de peso molecular cut-off para concentrar as Dps e trocá-lo para um tampão de armazenamento (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 50 mM). Alíquota da Dps purificados e congelamento em nitrogênio líquido para armazenamento a -80 ° C. </li></ol> 2. Protection Assay ADN O ensaio envolve várias etapas sensíveis ao tempo e deve ser cronometrado para o segundo para obter resultados reprodutíveis. Muitos ingredientes e passos de pipetagem estão envolvidos para uma mesa de pipetagem (ver Tabela 1), é aconselhável manter o controle de etapas e volumes. O tempo total necessário para o ensaio é de não mais do que 3 horas. <ol><li> Medir 30 ml de água em um tubo vedado; descarregar a água, com N2 durante 10 min (utilizando duas agulhas de seringa, uma no líquido, um acima dela) para remover o oxigénio a partir da solução. Adicionar 0,0168 g de FeSO 4 • 7H 2 O para a água para obter uma solução de estoque de 2 mM. Selar o frasco e lave com nitrogênio por 5 min mais, em seguida, misture. A solução deve serclaro, se qualquer indício de amarelo é detectável, preparar uma nova solução de ferro. </li><li> Adicione uma solução 100 mM de H 2 O 2 (10,87 mL de 9.2MH 2 O 2 em 1 ml de água), manter em gelo e protegida da luz por envolvimento em folha de alumínio. Utilize apenas por cerca de 1-2 horas após a preparação devido à deterioração espontânea. O estoque de peróxido de hidrogénio está igualmente sujeita a desagregação, que pode ser parcialmente melhorada por armazenamento adequada (no escuro, a 4 ° C). Controlo regular da concentração acionário, medindo os 240 OD são recomendados. </li><li> Descongelar uma alíquota de Dps rapidamente purificada num banho de água à temperatura ambiente, e manter em gelo. Centrifugar por 10 segundos a 4.000 xg em um table top picocentrifuge aos agregados precipitar. Medir a concentração após a centrifugação utilizando um espectrofotómetro (OD 280 = 1,547 indica uma concentração de 100 uM de monómeros Dps). </li><li> Diluir DNA linear de estoque-alta concentração usando tampão de reação 12x (1M de MOPS-KOH pH 7,0, 1 M de NaCl) para uma concentração de 100 ng / mL. ADN linear é usada para tornar mais fácil quantificação, mas o DNA de plasmídeo pode ser utilizado também. </li><li> Pipetar 1 mL da mistura de ADN-tampão para um tubo de PCR. Adicionar água suficiente para a reacção de modo que o volume final da reacção (menos de SDS) será de 12 ul. Este valor deve ser calculado com antecedência usando a tabela pipetagem. Adicionar Dps a uma concentração de 3 uM dodecamer final. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente para permitir Dps para se ligar ao DNA. </li><li> Adicionar suficiente solução 2 mM de FeSO4 para atingir a concentração desejada. Uma experiência típica utiliza uma gama de concentrações de 0 a 1 mM de FeSO4. Concentrações mais elevadas irão causar mais extensa degradação de DNA, mas pode também levar à formação de férrico precipita na mistura de reacção. Rapidamente adicionar 1 mL da solução de 100 mM de H 2 O 2 (a uma concentração final de 10 mM), e incubar à temperatura ambiente durante 5 min para permitir que a FentonReação de degradação mediada por acontecer. </li><li> Adicionar 0,8 mL de 20% de SDS (dodecilsulfato de sódio). Misturar e incubar a 85 ° C durante 5 minutos para interromper os complexos de ADN-Dps. A SDS desestabiliza o complexo Dps-DNA e evita deslocamentos indesejados gel para o DNA, o que melhora a facilidade de quantificação. Um passo opcional é parar a reacção por cataliticamente degradar o peróxido de hidrogénio em produtos não-tóxicos. Para as condições descritas no presente protocolo, este passo não é necessária para obter uma ampla gama de degradação de ADN. </li><li> Incubar em gelo durante 1 min, adicionar corante de carga e carregar num gel de agarose. Executar o gel, e mancha de ADN, utilizando brometo de etídio. O gel deve ser coradas após electroforese, em vez de antes da electroforese, para evitar a SDS de interferir com a distribuição do brometo de etídio no gel. </li></ol>

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</ol>

Não temos nada a divulgar.

O processo de purificação de Dps, conforme descrito neste artigo é muito robusto. Pureza tem sido consistentemente alta (&gt; 99%), não aparecem outras proteínas em gel de SDS-PAGE como bandas visíveis. Apesar disso, alguns lotes de Dps purificados parecem ter actividade de nuclease, tal como evidenciado pela degradação parcial de ADN quando incubadas com concentrações muito elevadas de Dps. Isto pode indicar a presença de ADNases altamente activos em baixa concentração que não fomos capazes de remover por meio de purif...

Os organismos aeróbios deve constantemente competir com as espécies de oxigénio reactivas que podem danificar o DNA, bem como outras macromoléculas biológicas importantes. Uma ferramenta potente para neutralizar os efeitos tóxicos do dano oxidativo é a proteína de ligação de ADN a partir de células de privação (SAD). Desde a sua descoberta, em 1992, a partir de fome E. coli, uma cultura, Dps foi identificado em mais de 300 espécies de bactérias e 2 arqueobactérias. Regulação positiva maciça de Dps durante a fase estacionária torna a proteína nucleoid associada mais alta expressão de E. coli em condições de fome 3, 4. Além disso, tem sido mostrado Dps para preservar tanto a viabilidade bacteriana e da integridade do ADN durante muitos várias tensões, incluindo a fome, a elevada concentração de ferro, a exposição à luz UV, choque térmico, e do stress oxidativo 5, 6. Estruturalmente, Dps de auto-associados em um complexo estável homo-oligoméricas de 12 monômeros, which montar em uma concha vazia esférica. A ~ 4,5 nm de largura cavidade interna é acessível ao solvente através dos poros, que permitem a passagem de moléculas pequenas 7 o exterior, e que pode sequestrar metais, tais como ferro mineralizados 8. O efeito protetor do Dps deriva das suas diversas atividades bioquímicas, que incluem DNA não específico de ligação 1, atividade ferroxidase e armazenamento de ferro 8. Estudo detalhado das atividades bioquímicas benéficas Dps requer primeiro a sua purificação. Dps purificação é um procedimento elaborado, como PD devem ser separadas não apenas a partir de outras proteínas, mas também a partir de qualquer DNA ligado 7. O nosso processo de purificação optimizado utiliza várias técnicas comuns, que consiste em duas colunas de permuta iónica e um passo de precipitação com sulfato de amónio. Várias trocas de buffer são necessários, como Dps altamente concentrado pode precipitar para fora da solução em condições de pouca sal. Uma vez que a proteína foi purificada Dps, Pode ser aplicada a ensaios que medem directamente a sua actividade ferroxidase 8, estequiometria de ligação de ADN 9, e os mecanismos de ligação do ferro 10. Purificados Dps também tem outras aplicações potenciais. A estrutura esférica oca estável de Dps tem sido utilizado como andaime para armazenar partículas hidrofóbicas da proteína dentro da cavidade 11 e mesmo como uma câmara de reacção para sintetizar novas nanopartículas magnéticas 12. A capacidade de proteção de Dps para mediar danos devido a espécies reativas de oxigênio pode ser clara e diretamente demonstrado usando o ensaio de proteção DNA 13, 14. Neste procedimento in vitro, as espécies de radicais são produzidos quando o ferro catalisa H 2 O 2 a degradação química de Fenton. Estes radicais danificar directamente o ADN presente na reacção e pode degradar completamente em concentrações elevadas. Duas atividades principais Dps pode tanto contrariar diretamente os efeitos da Fenta produção do radical a-mediada. Dps reduz a concentração de ferro catalítico da mineralização, o consumo do peróxido de hidrogénio disponível no processo. Além disso, a ligação ao DNA Dps potencialmente pode protegê-lo fisicamente dos danos dos radicais e condensa-lo em um volume menor com menos área de superfície reativa. A combinação destas duas propriedades faz com que o ensaio de protecção de DNA adequado para a finalidade de medir a actividade protectora Dps. O ensaio de protecção de ADN é bastante versátil e pode ser usado para uma variedade de aplicações para além Dps caracterização. Os danos dos radicais é uma forma comum de estresse em células, e muitas proteínas e substâncias químicas diferentes são usados ​​para combatê-la. O princípio geral do ensaio, utilizando-se a integridade do DNA como um marcador para os danos dos radicais, pode ser usado em combinação com quase qualquer reacção de produção de radicais livres ou agente de neutralização. Entre outros, o ensaio tem sido usado com sucesso para determinar as propriedades anti-oxidantesde K. extrato paniculata para uso na indústria de alimentos 15, para caracterizar os efeitos do ácido úrico em hidroxila mediação dano 16, e para ganhar novos insights sobre a função da pele proteínas reguladoras da transcrição 17. Apesar dos inúmeros usos do ensaio nos trabalhos publicados, descobrimos que muitos optimização e foram necessários passos de resolução, o que torna a criação de ensaio pela primeira vez um processo desnecessariamente trabalhoso para muitos investigadores. O protocolo que apresentamos neste artigo tem como objetivo eliminar essa barreira para a entrada.

<table><tbody><tr><td>BL21 (DE3) pLysS células competentes</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>pET-17b DNA</td><td>EMD-Millipore</td><td>69663-3</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo em pó</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Sal de ampicilina sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Merck</td><td>105033</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>VWR</td><td>443824T</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de coquetel inibidor de protease III</td><td>EMD-Millipore</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DFF100</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Colunas de dessalinização</td><td>GE Healthcare LS</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>SP-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1799</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centr. Filtro (10K MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato Ferroso heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8048</td><td></td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Calbiochem</td><td>Solução 475898</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora estática</td><td>Hettich</td><td>INE500</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Incubator </td><td>New Brunswick Sc.</td><td>Inova 44</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Disruptor de células</td><td>Constant Systems Ltd.</td><td>TS2 / 40 / AA / AA</td><td></td></tr><tr><td>Purificador FPLC</td><td>General Electric</td><td>AKTA</td><td></td></tr><tr><td>Frascos herméticos</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-08918-85</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de seringa</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

a aplicação de um<em&gt; in vitro</em&gt; dna assay proteção ao visualize propriedades mediação stress do dps protein

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

O estresse oxidativo é um subproduto inevitável da vida aeróbica. Oxigênio molecular é essencial para o metabolismo terrestre, mas também participa em muitas reações prejudiciais dentro de organismos vivos. A combinação do metabolismo aeróbio e de ferro, que é outro composto vital para a vida, é suficiente para produzir radicais com a química de Fenton e degradar os componentes celulares. Degradação do DNA é sem dúvida o processo mais prejudicial envolvendo radicais intracelulares, como reparo de DNA está longe de ser trivial. O ensaio apresentado neste artigo oferece uma técnica quantitativa para medir e visualizar o efeito de as moléculas e enzimas sobre os danos de DNA mediada por radicais. O ensaio de proteção DNA é uma ferramenta simples, rápido e robusto para a caracterização in vitro das propriedades protetoras das proteínas ou produtos químicos. Isto envolve a exposição do ADN a uma reacção de oxidação prejudicial e adicionando várias concentrações do composto de interesse. A redução ou o aumento de danos no ADN, como uma função da concentração do composto é então visualizada utilizando electroforese em gel. Neste artigo, demonstrar a técnica do ensaio de protecção de DNA medindo as propriedades de protecção da proteína de ligação de ADN a partir de células de privação (SAD). Dps é uma mini-ferritina, que é utilizado por mais de 300 espécies bacterianas para combater poderosamente agressões ambientais. Aqui apresentamos o protocolo de purificação Dps e as condições de ensaio optimizado para avaliar a proteção do DNA por Dps.

O processo de purificação para Dps descritos aqui é muito reprodutível. Dps de purificação de acordo com o protocolo descrito, utilizando-se 2 L de E. cultura coli como um ponto de partida, normalmente produzir 2,5 ml de proteína contendo Dps 12 em concentrações entre 5 e 12 mM. Tempos de indução mais longas (4 horas) parecem reduzir essa variabilidade. Pureza da proteína é consistentemente superior a 99%, como evidenciado por SDS-PAGE, os géis (Figura 1). O nível de contami...

A proteína de ligação ao DNA de células famintas (SAD) desempenha um papel crucial no combate ao stress bacteriana. Este artigo discute a purificação da<em&gt; E. coli</em&gt; Dps eo protocolo para um<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio demonstrando proteção Dps mediada por DNA da degradação pelas espécies reativas de oxigênio.

A aplicação de um<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Assay Proteção ao Visualize Propriedades Mediação stress do Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar in vitro o efeito protetor da proteína DPS por meio da visualização da redução do dano ao DNA mediado por radicais, resultante da atividade da DPS. Isso é alcançado primeiramente pela purificação da DPS a partir de células de e coli, utilizando várias colunas de troca iônica e precipitação com sulfato de amônio. Como segundo passo, a DPS purificada é adicionada ao DNA, permitindo a formação de um complexo A-D-P-S-D-N-A devido às propriedades de ligação não específica ao DNA da proteína. Em seguida, soluções de ferro férrico e peróxido de hidrogênio são adicionadas à reação para gerar radicais hidroxila por meio da química de Fenton e, assim, danificar o DNA.Os resultados obtidos mostram uma redução nos danos ao DNA devido à presença da DPS, com base na quantificação das bandas de DNA não danificado em géis de agarose após eletroforese. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades com o preparo dos reagentes. Isso induz reações indesejadas, como a formação de precipitados de ferro férrico ou a degradação espontânea do peróxido de hidrogênio.Embora este método forneça informações sobre a atividade protetora da DPS contra o estresse oxidativo, ele também pode ser aplicado para quantificar os efeitos de outras proteínas e substâncias químicas na degradação do DNA. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da química oxidativa, como a determinação das propriedades antioxidantes de extratos celulares para uso na indústria alimentícia. Um passo essencial inicial para o ensaio de proteção do DNA é obter a proteína DPS com alta pureza.Para iniciar o procedimento de expressão e purificação da DPS, transforme uma linhagem de E. coli deficiente em protease com um vetor pet no qual a sequência codificadora da proteína DPS foi clonada. Inocule dois frascos de meio LB de um litro contendo antibióticos apropriados com 10 mililitros cada de um cultivo noturno obtido a partir de uma única colônia de células transformadas, cultivadas a 37 graus Celsius sob agitação até uma OD 600 de aproximadamente 0,6.Quando as células atingirem a OD desejada, induza a expressão da DPS adicionando IPTG até uma concentração de 0,3 milimolar, incube a 37 graus Celsius por três a quatro horas sob agitação e recolha as células por centrifugação a 6.000 ×g por 15 minutos. Suspenderemos os pellets celulares em 7,5 mililitros de tampão DEAE, por litro de cultura celular induzida, e adicionaremos uma mistura de inibidores de protease à suspensão celular combinada. Para prevenir a degradação da TPS superexpressa, prepare o extrato livre de células usando um prensa francesa.A prensa francesa com 20 mililitros de tampão DEAE A e, em seguida, rompa a amostra duas vezes a 20 KPSI e centrifugue o lisado a 30.000 ×g por 35 minutos a quatro graus Celsius. Para clarificar partículas insolúveis, guarde o sobrenadante e carregue o extrato livre de células em uma coluna DEAE SRO SEAL seis B de 30 mililitros que tenha sido equilibrada com tampão DEAE A, começando a coletar o fluxo que passa. Assim que o sinal de OD280 começar a aumentar acima da linha de base, lave a coluna com tampão DEAE A até que o valor de OD280 retorne à linha de base, coletando continuamente o fluxo que passa.O fluxo que passa deve conter a maior parte da proteína DPS livre de DNA ligado; lave a coluna com 100% do tampão B. Este eluato contém complexos D-P-S-D-N-A, bem como outras proteínas, e pode ser descartado. O próximo passo é remover proteínas contaminantes adicionais por meio de precipitação com sulfato de amônio, o que geralmente é realizado na câmara fria.Após determinar o volume do fluxo combinado, adicione lentamente sulfato de amônio em grânulos finos até 62% de saturação ao longo de um período de 10 a 20 minutos a quatro graus Celsius, sob agitação. Remova completamente as proteínas precipitadas por centrifugação a 20.000 ×g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Guarde o sobrenadante com cuidado.Adicione mais 227 miligramas de sulfato de amônio por mililitro de sobrenadante para atingir 94% de saturação e agite por 20 a 30 minutos. Para garantir a equilibração completa dos precipitados de TPS nesta alta concentração de sal, colete o DPS por centrifugação a 20.000 ×g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Re-suspenda o pellet contendo DPS em Tampão de Suspensão Resus e ajuste o volume da amostra para 2,5 mililitros.Remova o sulfato de amônio por troca de tampão utilizando uma coluna de filtração em gel PD 10 cujo leito de gel foi equilibrado com 25 mililitros de tampão de suspensão Resus. Aplique 2,5 mililitros da amostra de DPS sobre a parte superior da coluna PD 10 e deixe penetrar, descartando o fluxo inicial. Colete o DPS eluindo com 3,5 mililitros de tampão de suspensão Resus e centrifugando.A amostra trocada no tampão foi centrifugada a 16.000 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Para remover quaisquer componentes insolúveis, dilua a amostra com seis a 10 mililitros de tampão de diluição para garantir que a concentração de sal seja baixa o suficiente para DPS. Para ligação à coluna SP SPHEROS, carregue a amostra em uma coluna de fluxo rápido SP spheros de 30 mililitros previamente equilibrada com tampão SP.Lave com o tampão SP A até que o traçado da DO280 retorne à linha de base e descarte o fluxo passante. Realize um gradiente linear de 150 mililitros de 0 a 100% do tampão B, coletando frações de dois mililitros. O DPS será eluído em um pico acentuado por volta de 50% de B, embora variações de até 10% sejam possíveis.Verifique as frações de elucina quanto à contaminação por DNA medindo a razão da OD 260 para a OD 280. Utilizando um espectrofotômetro, a razão deve ser tipicamente em torno de 0,7 quando as frações de elucina são submetidas a um gel de SDS-PAGE a 15%. O gel deve mostrar apenas uma banda em torno de 19 quilodaltons.Reúna as frações de DPS após concentrar e trocar o DPS para um tampão de armazenamento. Usando uma unidade de filtro centrífugo, alíquota o DPS purificado e congele em nitrogênio líquido para armazenamento a menos 80 graus Celsius. O ensaio de proteção genética consiste em múltiplos reagentes e esquemas complexos de patógenos.A preparação cuidadosa dos reagentes e o controle preciso do tempo são requisitos absolutos para a reprodutibilidade. Recomenda-se o uso de uma mesa de pipetagem para acompanhar os passos e volumes durante este procedimento. Meça 30 mililitros de água em um frasco hermético para remover o oxigênio da solução.Enxágue a água com nitrogênio por 10 minutos usando duas agulhas de seringa, uma imersa no líquido e outra acima dele. Adicione 0,0168 gramas de sulfato ferroso hepta-hidratado à água para obter uma solução estoque de dois milimolares. Feche o frasco e enxágue com nitrogênio por mais cinco minutos.Em seguida, misture. A solução deve ficar límpida; se qualquer traço de amarelo for detectável, prepare uma nova solução de ferro. Prepare uma solução de peróxido de hidrogênio 100 milimolar e mantenha-a em gelo, protegida da luz, devido à sua degradação espontânea.Use esta solução de peróxido de hidrogênio apenas por cerca de uma a duas horas após a preparação. Siga um eloqua de DPS purificado rapidamente em banho de água à temperatura ambiente e mantenha em gelo a centrifugação por 10 segundos a 4.000 ×g em uma centrífuga de bancada tipo pico para precipitar agregados após a centrifugação. Meça a concentração utilizando um espectrofotômetro, em seguida dilua o DNA linear a partir de um estoque de alta concentração usando tampão de reação 12× para obter uma concentração de 100 nanogramas por microlitro, pipete quantidade suficiente de água nos tubos de PCR para que o volume final da reação seja de 12 microlitros.Em seguida, crie uma amostra estoque de DNA misturado com DPS de modo que a concentração final de DPS seja de três micromolares. Pipete a mistura de DNA-DPS nos tubos de PCR. Os tubos de controle recebem apenas DNA e são incubados por 15 minutos em temperatura ambiente para permitir que o DPS se ligue ao DNA. Adicione quantidade suficiente de solução de sulfato ferroso 2 milimolar para atingir a concentração desejada e adicione rapidamente um microlitro da solução de peróxido de hidrogênio 100 milimolar, obtendo uma concentração final de 10 milimolares, e incube em temperatura ambiente por cinco minutos.Para permitir que ocorra a reação de degradação mediada pelo Fenton, adicione um microlitro da mistura de SDS a 20% e incube a 85 graus Celsius por cinco minutos para romper os complexos D-P-S-D-N-A; o SDS desestabiliza o complexo DPS-DNA e evita deslocamentos indesejados do DNA em gel, o que melhora a facilidade de quantificação. Incube agora no gelo por um minuto e, em seguida, adicione corante de carga e carregue em um gel de agarose para eletroforese. Realize a coloração para DNA usando brometo de atherium após a eletroforese, em vez de antes. Isso evita que o SDS interfira na distribuição do brometo de atherium no gel.As etapas intermediárias da purificação de DPS analisadas por eletroforese em gel de SDS são mostradas aqui. A primeira via é o extrato livre de células. A segunda via é o fluxo que atravessou a coluna DEAE SPHEROS.A faixa três é o EIT da coluna DEAE. A faixa quatro é o sobrenadante da precipitação com sulfato de amônio a 60%. A faixa cinco é a amostra de DPS após precipitação com sulfato de amônio a 90% e troca de tampão mediante coluna PD 10.E a faixa seis é a fração pura combinada de DPS. Após a proteína da coluna SP spheros. Os marcadores de peso molecular estão na faixa sete.As porcentagens na parte inferior de cada linha indicam a pureza do DPS conforme determinado por software de quantificação de imagens. O processo de purificação do DPS demonstrado aqui é altamente reprodutível e a pureza da proteína é consistentemente superior a 99%. Nenhuma outra proteína aparece nos géis de SDS-PAGE como bandas visíveis. O DPS purificado pode ser utilizado em um ensaio de proteção do DNA no qual o ferro catalisa a degradação do peróxido de hidrogênio por meio da química de Fenton, produzindo espécies radicais que danificam diretamente o DNA presente na reação; resultados representativos são mostrados nesta figura.Todas as linhas contêm 100 nanogramas de DNA linear de cinco quilobases; a linha um contém apenas DNA, a linha dois contém DNA com um milimolar de peróxido de hidrogênio, e a linha três contém DNA com um milimolar de peróxido de hidrogênio e 166 micromolares de sulfato ferroso. Porém, o DNA foi degradado. As linhas quatro a oito contêm DNA com três micromolares de DPSD demer, um milimolar de peróxido de hidrogênio e concentrações crescentes de ferro da esquerda para a direita.É evidente que a DPS media a proteção do DNA contra a degradação oxidativa a partir da comparação entre as linhas três e cinco. Também é aparente um aumento geral na degradação do DNA com a concentração crescente de ferro. Os resultados obtidos por meio do ensaio de proteção do DNA podem ser quantificados com o uso de software de processamento de imagens, como o Image Quant.Este gráfico mostra o resultado dessa quantificação média obtida em três ensaios. As barras de erro indicam o alto nível geral de reprodutibilidade alcançado. Uma vez dominado.Essa técnica pode ser realizada em cerca de quatro horas para até 40 amostras, permitindo caracterizar muitas condições diferentes em paralelo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preparar seus reagentes com precisão e cronometrar cada etapa tão exatamente quanto possível. Como o ensaio é bastante sensível aos tempos de incubação, após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir proteína DPS de alta pureza e caracterizá-la em um ensaio in vitro para determinar sua atividade na proteção do DNA contra degradação por espécies reativas de oxigênio.

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