Determinação da Microbial Extracelular Enzyme actividade nas águas, solos e sedimentos, utilizando alta taxa de transferência de microplaca Ensaios

O objetivo geral do procedimento a seguir é ensaiar rapidamente a atividade enzimática extracelular microbiana em uma variedade de ambientes naturais. Isso é alcançado adicionando-se amostras de água ou enxaguaduras de solo em microplacas para obter uma replicação adequada. Como segundo passo, um substrato artificial cromogênico ou fluorogênico é adicionado aos poços da microplaca, o que permite que as reações enzimáticas ocorram. Em seguida, mede-se a absorvância ou a fluorescência para determinar a quantidade de produto final liberado durante a reação.

Os resultados mostram diferenças na atividade de enzimas extracelulares entre amostras com base na absorbância ou fluorescência da reação final. Hoje vamos demonstrar como medir a atividade de enzimas extracelulares em ambientes naturais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na ecologia microbiana, como as taxas de água no processamento de matéria orgânica e na mineralização de nutrientes em solos, sedimentos e águas. Geralmente, indivíduos novos no uso deste método enfrentam dificuldades devido à dificuldade em separar partículas da solução da reação, especialmente ao analisar um grande número de amostras.

Uma demonstração visual deste procedimento é essencial, pois o esquema de distribuição em placas pode ser difícil de aprender, e a realização de medições em múltiplos intervalos de tempo pode tornar este procedimento mais desafiador. A análise colorimétrica da atividade enzimática extracelular em solos e sedimentos começa com o preparo do tampão substrato e das soluções padrão conforme descrito no protocolo textual para solo; prepare uma suspensão de cada amostra a ser analisada em um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Adicione uma concentração de aproximadamente um grama por mililitro utilizando tampão acetato 50 milimolar para sedimentos.

Adicione quantidade suficiente de tampão acetato para tornar a suspensão facilmente pipetável. O volume exato de suspensão necessário variará conforme o número de enzimas ensaiadas, mas recomenda-se um mínimo de cinco mililitros. Vortexe cada suspensão até que todos os grumos de solo ou sedimento tenham se dispersado.

E observe o volume final. Corte a extremidade das ponteiras de pipeta com tesoura antes da pipetagem. Como as suspensões de solo tendem a entupir as ponteiras, revicele cada suspensão e pipete imediatamente 150 microlitros em cada um dos seis poços.

Em um bloco de 96 poços profundos. É importante realizar vortexagem completa e frequente. Para manter as partículas do solo em suspensão, deixe pelo menos dois poços por bloco vazios para servir como controle de substrato.

Prepare um bloco de 96 poços para cada enzima a ser analisada. Despeje aproximadamente cinco mililitros de tampão acetato em um reservatório para pipeta e utilize uma pipeta de oito canais para adicionar 150 microlitros do tampão aos dois últimos poços de cada amostra.

Para os controles do tampão da amostra e para as duas poços de controle do substrato. Despeje aproximadamente 10 mililitros da solução apropriada de p-nitrofenol ou substrato PNP em um reservatório para pipeta e use uma pipeta de oito canais para adicionar 150 microlitros da solução de substrato aos quatro primeiros poços de cada amostra e aos dois poços de controle de substrato. Anote o horário, pois a reação começa assim que a solução de substrato for adicionada.

Incube as placas à temperatura ambiente por 0,5 a quatro horas. O tempo exato de incubação variará dependendo do nível de atividade nas amostras e da enzima a ser analisada. Enquanto os ensaios estão em incubação, prepare uma microplaca clara de 96 poços.

Para cada bloco de poços profundos, para leitura da absorbância, pipete 190 microlitros de água destilada e 10 microlitros de hidróxido de sódio um molar em cada poço da microplaca. O hidróxido de sódio retarda a reação enzimática e aumenta o pH, o que realça a cor do PNP liberado durante a reação após a incubação. Centrifugue os blocos de 96 poços a 2000 a 5.000 ×g durante cinco minutos para sedimentar as partículas do solo.

A remoção do líquido sem perturbar o pellet pode ser um desafio. É necessário evitar o uso de uma quantidade excessiva de amostra de solo inicialmente. Certifique-se de centrifugar por tempo suficiente e utilize um movimento cuidadoso, mas firme, para retirar o líquido.

Use uma pipeta multicanal para retirar 100 microlitros de cada poço, tomando cuidado para evitar o pellet. Transfira o líquido para o poço correspondente em uma microplaca clara de 96 poços previamente preparada, ligue o leitor de microplacas e configure qualquer software necessário, registre a absorbância em 410 nanômetros. Após a determinação da massa seca das amostras conforme descrito no protocolo textual, calcule a absorbância final de cada amostra subtraindo a absorbância do controle da amostra da absorbância do ensaio da amostra.

Se os controles de substrato apresentarem alta absorbância superior a 0,060, subtraia esses valores. Em seguida, prossiga para calcular a atividade enzimática em micromoles por hora por grama de massa seca utilizando esta equação. Após organizar uma microplaca preta para cada enzima conforme o exemplo mostrado no protocolo descrito no texto, despeje aproximadamente cinco mililitros da primeira amostra de água em um reservatório para pipeta e utilize uma pipeta de oito canais para transferir 200 microlitros para todas as cavidades.

Na coluna um da microplaca, descarte as ponteiras usadas e repita conforme necessário para cada amostra de água, preenchendo as colunas de um a nove. Configure controles para considerar amostras, padrões, substrato e inibição na mesma microplaca preta utilizada para as amostras. Os controles de amostra contêm água da amostra e tampão de bicarbonato e não são utilizados nos cálculos de atividade, mas demonstrarão a consistência das leituras ao longo do experimento.

Os controles de quenching consistem em água da amostra e uma quantidade padrão da marcação fluorescente e são usados para medir a difração da fluorescência. Em água da amostra, os controles de substrato e padrão são compostos por substrato ligado ou marcação fluorescente padrão, respectivamente, e tampão de bicarbonato. Despeje aproximadamente cinco mililitros de tampão de bicarbonato cinco milimolar em um reservatório de pipeta limpo.

Pipete 50 microlitros de tampão em poços de um a nove nas linhas d e e para formar dois poços replicados de controles de amostra por amostra, troque as ponteiras da pipeta e, em seguida, transfira 200 microlitros de tampão bicarbonato para os poços 10 a 12 nas linhas A e H. Embora a luz seja mantida intensa nesta demonstração por motivos de filmagem, a iluminação ambiente deve ser reduzida diminuindo a intensidade ou desligando as luzes, já que o padrão fluorescente é sensível à luz. Despeje aproximadamente cinco mililitros de 10 micromolar de quatro metil umbeliferona ou MUB em um reservatório de pipeta limpo, pipete 50 microlitros nos poços de um a 12 na linha H. Em seguida, pipete 50 microlitros nos poços de um a nove nas linhas G e F para formar três réplicas de controles de quenching por amostra e controles padrão globais. Coloque a microplaca no escuro ou cubra-a com uma tampa opaca para reduzir a degradação da MUB pela luz, ligue o fluorímetro e configure qualquer software necessário para estar pronto para leitura antes da adição do substrato.

Para aproximadamente cinco mililitros do substrato MUB apropriado revestido em um reservatório de pipeta limpo, use uma pipeta de 12 canais para transferir 50 microlitros para os poços de um a 12 da linha A e para os poços de um a nove das linhas B e C, formando três ensaios em replicata para cada amostra e três controles de substrato. Prossiga imediatamente para registrar a fluorescência. Leia a fluorescência inicial imediatamente após a adição do substrato à microplaca. Após a leitura, incube a microplaca à temperatura ambiente, em local escuro ou coberta com tampa opaca.

Para reduzir a degradação da MUB pela luz. O tempo de incubação necessário para medir a atividade enzimática potencial máxima dependerá da concentração da enzima dentro de uma amostra. Como essa concentração é desconhecida, antes de analisar a amostra, será necessário ler uma microplaca em múltiplos intervalos de tempo.

Para a maioria das enzimas, intervalos de 10 a 15 minutos ao longo de uma hora são apropriados, embora algumas amostras com altas concentrações atinjam o pico antes de 10 minutos. Continue lendo a fluorescência na microplaca nos intervalos designados por pelo menos uma hora. Certifique-se de manter a microplaca coberta ou no escuro entre as leituras.

Para cada amostra em cada intervalo de tempo, calcule a fluorescência média inicial da amostra, a fluorescência média final da amostra, a fluorescência média do padrão e a fluorescência média do controle de quenching para cada intervalo de tempo. Calcule a atividade enzimática em m por hora por mililitro, utilizando a equação apresentada no protocolo do texto.

Examine os valores de atividade calculados para cada intervalo de tempo e determine a atividade potencial final a partir do intervalo com a maior atividade. Se os valores de atividade continuarem aumentando, podem ser necessários intervalos posteriores. Se os valores de atividade diminuírem ao longo da execução, repita o procedimento com intervalos de tempo mais curtos.

Os solos e os sedimentos aquáticos geralmente apresentam níveis consideráveis de atividade enzimática extracelular como resultado de comunidades microbianas aderidas que crescem na superfície das partículas. Esta figura mostra como essa atividade varia conforme o tamanho das partículas obtidas do sedimento superficial de um riacho de terceira ordem no norte do Mississippi, EUA. Um estudo anterior demonstrou que as comunidades bacterianas presentes nas partículas de sedimento desse riacho podem ser separadas em três grupos distintos com base na análise molecular de sua estrutura comunitária.

Aqueles em partículas de 0,063 milímetros, aqueles em 0,125, 0,25 e 0,5 milímetros e aqueles em partículas de um milímetro. A análise dos padrões na atividade de enzimas extracelulares apoia esta conclusão, mostrando que a fosfatase apresenta níveis semelhantes nas partículas de 0,125, 0,25 e 0,5 milímetros, mas muito mais altos nas frações de um e 0,063 milímetros quando medida com a técnica do substrato ligado ao PNP. Outras enzimas, como a beta-glicosidase e a NAGase, exibem picos semelhantes nas partículas mais finas, mas não apresentam aumento nas partículas de um milímetro.

Destacando o fato de que diferentes enzimas podem apresentar distribuições ambientais distintas e que estas podem ser elucidadas utilizando este ensaio. As barras de erro relativamente pequenas mostram que os ensaios colorimétricos de atividade enzimática em sedimentos são reproduzíveis e, portanto, passíveis de análise estatística. Ao comparar diferentes amostras ambientais, as águas naturais tendem a apresentar menor atividade enzimática extracelular por mililitro do que os solos ou sedimentos por grama.

Como tal, eles devem ser ensaiados metricamente quanto à flora, utilizando substratos ligados ao MUB. Esta figura mostra como a atividade das enzimas, fosfatase, beta, glucco e NGAs, varia com a profundidade. Em um lago raso no norte do Mississippi, EUA, sabe-se que o lago é pobre em nutrientes, o que também é indicado pela atividade relativamente alta da fosfatase e da enzima que os microrganismos produzem para adquirir fosfato de compostos orgânicos.

Para as três enzimas, as amostras dos ensaios coletadas na superfície da água e a 50 centímetros de profundidade mostraram atividade semelhante. Enquanto a atividade foi elevada na amostra de 100 centímetros, esta foi essencialmente coletada na interface entre água e sedimento, e a presença de partículas de sedimento na amostra provavelmente explica a maior atividade observada, especialmente para beta-glucosidase e N-AGAs. Como ocorre com os substratos PNP, as pequenas barras de erro indicam que, mesmo com apenas três leituras em replicata, a reprodutibilidade dos ensaios fluorométricos utilizando substratos MUB é alta.

Observe que as unidades para a atividade enzimática em amostras de água estão em nanomoles de substrato consumido, enquanto aquelas para a atividade enzimática em partículas de sedimento estão em micromoles de substrato consumido, ainda que o tamanho por unidade seja comparável. Isso destaca o fato de que solos e sedimentos tendem a apresentar atividade extracelular muito maior do que águas naturais. Também demonstra o aumento na sensibilidade da técnica com substrato ligado ao MUB e a necessidade de usar essa técnica para ensaiar a atividade enzimática extracelular em amostras de água, uma vez dominada.

Essa técnica pode ser usada para analisar nove amostras de água quanto à atividade de até nove enzimas em pouco mais de uma hora. Ao aplicar este procedimento em solos e sedimentos, é importante utilizar uma massa conhecida de material, de modo que a atividade possa ser expressa com base no peso seco. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a atividade enzimática extracelular em uma variedade de ambientes naturais, utilizando técnicas colorimétricas ou fluorimétricas.