Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar estudos ectômicos para comparar os perfis de interação de proteínas de diferentes variantes de patógenos contra um conjunto comum de fatores celulares. Isso é realizado por meio de triagens baseadas em levedura, utilizando o sistema two-hybrid com CDNA para identificar possíveis parceiros interagentes de proteínas de diferentes variantes de patógenos. Como segundo passo, as sequências de quadros de leitura aberta dos parceiros interagentes são sequenciadas e transferidas para vetores compatíveis para validação adicional.

Em seguida, seleciona-se um conjunto de parceiros individuais resultantes de todas as triagens de duplo híbrido e realiza-se novamente o teste de interação com a gama completa de cepas estudadas. Isso é feito utilizando um ensaio ortogonal de complementação de fragmentos proteicos baseado em luciferase (GIA), realizado em células de mamíferos, a fim de fornecer conjuntos robustos de dados comparativos de interação. Os resultados mostram diferentes intensidades de interação entre as proteínas do patógeno e as proteínas celulares com base nas medidas de luciferase obtidas e, assim, fornecem uma visão comparativa das interações entre proteínas do patógeno e proteínas do hospedeiro.

O processamento dos perfis de interação por agrupamento hierárquico correlaciona interações específicas entre hospedeiro e patógeno com características patológicas e fornece insights sobre o envolvimento de proteínas do patógeno na patogênese. A principal vantagem dessa abordagem em comparação com outros métodos de mapeamento de interações entre proteínas do patógeno e do hospedeiro é que ela fornece um conjunto de dados comparativo rigoroso entre múltiplas variantes de cepas. Essas técnicas fornecem informações sobre a rede de interações de uma proteína patogênica, mas também podem ser aplicadas a outros sistemas como moléculas infecciosas utilizando vírus completos e a genética de ribozimas, por exemplo. Inicie este protocolo com o acasalamento e a distribuição das células de levedura conforme descrito no protocolo escrito para semeadura.

30 mililitros de meio seletivo de eliminação sem triptofano com poucas colônias da linhagem de levedura AH 1 0 9 transformada com o plasmídeo P-G-B-K-T sete, expressando a proteína do patógeno. Incubar por 30 horas a 30 graus Celsius com agitação. Em seguida, semear 200 mililitros de meio seletivo de eliminação sem triptofano com os 30 mililitros do AH 1 0 9.

Os cultivos são incubados com rotação por 20 horas a 30 graus Celsius. Além disso, incube a biblioteca de cDNA transformada em Y 187 em 20 mililitros de YP agar por 10 minutos a 30 graus Celsius com rotação. Em seguida, centrifugue um volume do cultivo de PG BK T sete transformado em AH 109 correspondente à quantidade equivalente de células de levedura viáveis de Y 187 por cinco minutos a 3.500 RPM e 20 graus Celsius.

Retire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o palato em 10 mililitros de cola YP. Misture o levedo AH 109 ressuspenso com a biblioteca contendo Y 187. Transfira para um tubo de 50 mililitros antes de centrifugar por cinco minutos a 3.500 RPM e 20 graus Celsius.

Após retirar cuidadosamente o sobrenadante de ressuspensão, suspenda o pellet em cola YP para obter um volume total de 1,5 mililitro. Em seguida, distribua a levedura em três placas de ágar YCM de 150 milímetros, com 0,5 mililitro por placa, e incube por 4,5 horas a 30 graus Celsius. Colete a levedura acasalada das placas YCM raspando com uma espátula de vidro em 10 mililitros de meio seletivo de eliminação sem leucina, triptofano e histidina.

Lave a placa duas vezes com cinco mililitros do mesmo meio e reúna após centrifugação por cinco minutos a 3.500 RPM e 20 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e reutilize. Suspenda o pellet de levedura em cinco mililitros de meio seletivo de eliminação sem leucina, triptofano e histidina.

Em seguida, espalhe o levedo acasalado em 10 placas de ágar seletivo de omissão, sem leucina, triptofano e histidina, suplementado com a concentração apropriada de três amino triazol ou três a t, conforme determinado no teste de autoativação. Calcule a taxa de diploides conforme descrito no protocolo escrito, após incubação a 30 graus Celsius em atmosfera umidificada por seis a dez dias. Escolha colônias de levedo e transfira para placas preparadas recentemente com ágar seletivo de omissão, sem leucina, triptofano e histidina, acrescidas de três a t.

Pedir o levedo em um esquema de oito fileiras de 12 poços reproduzindo uma placa de 96 poços, para que posteriormente seja mais fácil o sequenciamento. Deixe as colônias de levedo crescerem por quatro a cinco dias a 30 graus Celsius em uma atmosfera umidificada. O objetivo desta seção é realizar PCR e amplificar o cDNA contido nos vetores PA ct dois de colônias de levedo lisadas, cultivadas em placas de ágar seletivo sem leucina, triptofano e histidina.

Inicie colocando uma placa PCR de 96 poços sobre gelo para lisar as células de levedura com 50 microlitros por poço da solução xmal 20 T. Reuspenda suavemente uma colônia por poço. Incube a placa por 15 minutos a 37 graus Celsius e por 15 minutos a 95 graus Celsius.

Após colocar a placa de volta no gelo, adicione 50 microlitros de água destilada por poço, misturando por pipetagem para cima e para baixo, e em seguida proceda à centrifugação por cinco minutos a 3.500 RPM e quatro graus Celsius. Após preparar a mistura X tack conforme descrito no protocolo textual, distribua 40 microlitros da mistura por poço na placa PCR de 96 poços. Adicione 10 microlitros do levedo lisado por poço e realize a amplificação conforme indicado no protocolo textual.

Execute três microlitros dos produtos de PCR em um gel de agarose 1,2% para detectar clones positivos por PCR. Sequencie os fragmentos amplificados por PCR isolados desses três clones positivos. Em seguida, realize uma análise BLAST para identificar quadros de leitura abertos celulares, descartando alinhamentos de baixa confiança, bem como sequências contendo quadros de leitura deslocados e códons de parada prematuros antes da transfeção celular.

Transfira as sequências codificantes de proteínas de patógenos e proteínas celulares para seus vetores respectivos, a fim de gerar proteínas fundidas a fragmentos da luciferase Gaia, conforme detalhado no protocolo textual. Semeie células 293T a 350.000 células por mililitro de DMEM com 10% de soro bovino fetal, sem antibiótico. Distribua 100 microlitros por poço em placas de cultura brancas estéreis antes de cultivar por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono no dia seguinte. Transfete as células utilizando qualquer protocolo de transfeção adequado, usando 100 nanogramas por poço dos plasmídeos contendo as sequências codificantes do patógeno e do hospedeiro; transfete 10 nanogramas por poço do plasmídeo CMV de luciferase de vaga-lume para normalização pela eficiência de transfeção.

Cada ponto é testado em triplicata na mistura de transfeção transferida para as placas de células 293T cultivadas. Tenha cuidado para depositar suavemente a mistura de DNA sobre as células, pois as células 293T não são fortemente aderentes e podem ser facilmente destacadas do fundo do poço. Incube em uma estufa de cultura celular por 24 a 30 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Lave as células com PBS usando 100 microlitros por poço. Adicione 40 microlitros de tampão de lise 1x vanilla e incube por 30 minutos à temperatura ambiente.

Sob agitação, reserve 10 microlitros de lisados celulares em outra placa branca para posterior dosagem da luciferase de vagalume armazenada a quatro graus Celsius ou alternativamente a menos vinte graus Celsius com tampa para medir a atividade Gaia. Coloque a placa em um luminômetro e injete 100 microlitros do reagente de ensaio de luciferase de baunilha nos lisados celulares. Em seguida, conte a luminescência por 10 segundos.

A dosagem em uma placa de 96 poços leva cerca de meia hora. Utilize sempre extratos frescos, pois o congelamento ou o armazenamento prolongado podem afetar a atividade Gaia mediada por interação nos extratos celulares remanescentes de 10 microlitros. Injete 50 microlitros do reagente de ensaio de luciferase de vaga-lume nos lisados celulares utilizando um luminômetro e conte a luminescência por 10 segundos.

A dosagem em uma placa de 96 poços leva cerca de meia hora para cada interação. Calcule a razão entre a atividade da luciferase Gaia e a atividade da luciferase de vaga-lume para obter um valor de luminiscência GAIA normalizado, levando em consideração a eficiência de transfeção e a viabilidade celular.

Calcule a média das triplicatas para monitorar a interação. Estime uma razão de luminiscência normalizada ou NLR para cada par patógeno-hospedeiro. Para tanto, divida a atividade de luminiscência GAIA normalizada detectada na presença de ambas as proteínas de patógeno e hospedeiro pela soma das atividades medidas em poços controle.

O valor limite do NLR para interações positivas foi estimado em um estudo anterior como sendo em torno de 3,5. Uma grande vantagem do ensaio de COMPLEMENTAÇÃO de proteínas, ou H-T-G-P-C-A, de alto rendimento reside em sua alta sensibilidade, conforme ilustrado pela avaliação das taxas de falso positivo e falso negativo para as duas proteínas do HPVE, a fim de determinar a taxa de falso negativo. Interações conhecidas da proteína E2 do HPV 16 foram avaliadas pelo H-T-G-P-C-A, e quatro das 18 interações não foram recuperadas, correspondendo a uma taxa de falso negativo de 22%.

As interações falsas positivas foram medidas em 5,8% utilizando duas proteínas HPVE contra um conjunto aleatório de proteínas celulares. A alta especificidade do método é destacada nesta figura, que mostra que uma única mutação pontual conhecida por interferir na ligação da E dois ao seu parceiro celular BRD quatro anula a razão NLR. Essa abordagem ecomica comparativa em larga escala foi recentemente aplicada com sucesso a três proteínas precoces de vírus do papiloma humano, E dois, E seis e E sete, originárias de diferentes genótipos, representativas de sua diversidade natural em tropismos e patologias para cada uma das proteínas precoces.

A agrupamento hierárquico dos perfis de interação recapitula em grande parte a filogenia do HPV, comprovando a robustez da abordagem e o escopo dos conjuntos de dados de interação. Pode ser utilizado para correlacionar perfis específicos de interação vírus-hospedeiro com características patológicas, fornecendo assim pistas sobre o envolvimento de proteínas virais. Na patogênese, podem ser extraídas interações específicas de genótipos, que potencialmente correspondem a biomarcadores de tropismo ou patogenicidade.

Como ilustrado aqui para os parceiros interagentes de E seis, os alvos celulares foram classificados com base na intensidade da interação e agrupados de acordo com o tipo de HPV interagente. Essa representação permite a identificação de biomarcadores específicos, como fad, que interage apenas com as proteínas E seis do HPV oncogênico. Tal alvo deve ser crucial para a característica carcinogênica de todos os HPV oncogênicos e, portanto, constitui um bom candidato para ser utilizado como marcador substituto da infecção por HPV ou como alvo terapêutico.

Após este procedimento, o H-T-G-P-C-A pode ser adaptado para ser usado com uma terceira proteína expressa como uma fusão com uma etiqueta de biotina. Isso permite a captura de três complexos de parceiros em placas de cor com estreptavidina, o que pode responder à questão da formação de grandes complexos proteicos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como caracterizar interações entre patógeno, hospedeiro e potencial. Em terceiro lugar, investigando os parceiros de interação de múltiplas variantes de cepas. Em segundo lugar, comparando suas interações com um conjunto completo de tipos de patógenos utilizando uma duração proteína-proteína, por exemplo, em células de mamíferos.