Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar estudos ectômicos para comparar perfis de interação de proteínas de diferentes variantes de patógenos com um conjunto comum de fatores celulares. Isso é obtido por meio do acasalamento de leveduras, duas triagens híbridas de CDNA para identificar potenciais parceiros de interação de proteínas de diferentes variantes de patógenos. Como segunda etapa, os quadros de leitura abertos dos parceiros que interagem são sequenciados e transferidos para vetores compatíveis para validação posterior.

Em seguida, um conjunto de parceiros individuais emergentes de todas as duas triagens híbridas é selecionado e testado novamente quanto à sua interação com a gama completa de cepas estudadas. Isso é feito usando um ensaio de complementação de fragmentos de proteína baseado em luciferase ortogonal realizado em células de mamíferos para fornecer conjuntos de dados de interação comparativa robustos. Os resultados mostram diferentes intensidades de interação entre as proteínas do patógeno e as proteínas celulares com base nas medidas de luciferase obtidas e, portanto, fornecem uma visão comparativa das interações entre a proteína da proteína do hospedeiro e o patógeno.

O processamento dos perfis de interação por agrupamento hierárquico correlaciona interações específicas do patógeno hospedeiro com características patológicas e fornece informações sobre o envolvimento de proteínas patogênicas na patogênese. A principal vantagem dessa abordagem sobre outros métodos que mapeiam as interações entre proteínas e proteínas do patógeno hospedeiro é que ela fornece um conjunto de dados de interação comparativa rigoroso entre várias variantes de cepas. Essas técnicas fornecem informações sobre a rede de interação de uma proteína patogênica, mas também podem ser aplicadas a outros sistemas como uma molécula infecciosa usando vírus completos e genética de rios, por exemplo, Comece este protocolo com o acasalamento e espalhamento das células de levedura conforme descrito na semente do protocolo escrito.

30 mililitros de meio de dropout seletivo sem triptofano com poucas colônias de cepa de levedura AH 1 0 9 transformada com o plasmídeo P-G-B-K-T sete expressando a proteína do patógeno. Incubar 30 horas a 30 graus Celsius com rotação. Próxima semente, 200 mililitros de meio de abandono seletivo menos triptofano com os 30 mililitros do AH 1 0 9.

As culturas incubam com rotação por 20 horas a 30 graus Celsius. Além disso, a biblioteca CDNA de pensamento incubada transformou Y 187 em 20 mililitros de cola YP por 10 minutos a 30 graus Celsius com rotação. Em seguida, centrifugue um volume da cultura AH 109 transformada em PG BK T sete, correspondendo a uma quantidade equivalente de células de levedura Y 187 viáveis por cinco minutos a 3.500 RPM e 20 graus Celsius.

Retire cuidadosamente o sobrenadante e Resus suspenda o palato em 10 mililitros de cola YP. Misture o fermento AH 109 ressuspenso com a biblioteca contendo Y 187. Transferir para um tubo de 50 mililitros antes de centrifugar durante cinco minutos a 3 500 rpm e 20 graus Celsius.

Depois de retirar cuidadosamente o super dat Resus, suspenda o pellet em cola YP para obter um total de 1,5 mililitros. Em seguida, espalhe o fermento em três ágar YCM, placas de 150 milímetros a 0,5 mililitros por placa e incube 4,5 horas a 30 graus Celsius. Colete o fermento acoplado das placas YCM raspando com um copo de ancinho em 10 mililitros de meio de dropout seletivo menos leucina, triptofano e histidina.

Enxágue a placa duas vezes com cinco mililitros do mesmo meio e acumule após centrifugação por cinco minutos a 3.500 RPM e 20 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e o reus. Suspenda o pellet de levedura em cinco mililitros de meio de abandono seletivo menos leucina, triptofano e histidina.

Em seguida, espalhe a levedura acasalada em 10 placas de ágar dropout seletivo menos leucina, triptofano e histamina suplementada com a concentração apropriada de três amino triazol ou três at, conforme determinado no teste de autoativação. Calcule a taxa diplóide conforme descrito no protocolo escrito após incubação a 30 graus Celsius em uma atmosfera umidificada por seis a 10 dias. Escolha as colônias de levedura e transfira para pratos preparados frescos a partir de ágar dropout seletivo menos leucina, triptofano e histidina, mais três a t.

Encomende a levedura em um esquema de oito pistas de 12 poços reproduzindo uma placa de 96 poços para que mais tarde seja mais fácil o sequenciamento. Deixe as colônias de leveduras crescerem por quatro a cinco dias a 30 graus Celsius em uma atmosfera umidificada. O objetivo desta seção é fazer PCR, amplificar o CDNA contido no PA ct de dois vetores de colônias de leveduras lisadas cultivadas em ágar dropout seletivo menos placas de leucina, triptofano e histidina.

Comece colocando uma placa de PCR de 96 poços no gelo para licitar células de levedura a 50 microlitros por poço de solução xmal 20 T. Ressuspenda suavemente uma colônia por poço. Incube a placa por 15 minutos a 37 graus Celsius e 15 minutos a 95 graus Celsius.

Depois de colocar a placa de volta no gelo, adicione 50 microlitros de água destilada por mistura de poço, pipetando para cima e para baixo, e prossiga para centrifugar por cinco minutos a 3.500 RPM e quatro graus Celsius. Depois de preparar a mistura de aderência X conforme descrito no protocolo de texto, distribua 40 microlitros da mistura por poço na placa de PCR de 96 poços. Adicione 10 microlitros da levedura lisada por poço e execute a amplificação conforme listado no protocolo de texto.

Execute três microlitros dos produtos de PCR em um gel de 1,2% agros para detectar clones positivos para PCR. Sequenciar os fragmentos amplificados por PCR isolados de seus três clones positivos. Em seguida, execute uma análise de explosão para identificar quadros de leitura abertos celulares, descartando alinhamentos de baixa confiança, bem como deslocamento de quadro e código de parada prematuro na contenção de sequências antes da transfecção celular.

Transfira a proteína do patógeno e os quadros de leitura abertos da proteína celular em seus respectivos vetores para gerar proteínas fundidas a fragmentos da luciferase Gaia, conforme detalhado no protocolo de texto, semeie 2 9 3 células T a 350.000 células por mililitro de DMEM com 10% de soro bovino fetal sem antibiótico. Distribua 100 microlitros por poço em placas de cultura brancas estéreis antes de crescer por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono no dia seguinte. As células transfectadas usando qualquer protocolo de transfecção adequado usam 100 nanogramas por poço de funil de plasmídeo de quadro de leitura aberto do patógeno e do hospedeiro transfectam 10 nanogramas por poço de plasmídeo de luciferase de vaga-lume CMV para normalizar a eficiência da transfecção.

Cada ponto é testado em mistura de transfecção de transferência triplicada para as placas de células 2 9 3 T cultivadas. Tenha cuidado para depositar suavemente a mistura de DNA nas células, pois as células T 2 9 3 não são fortemente aderentes e são facilmente destacadas do fundo do poço, incubar em uma incubadora de cultura de células por 24 a 30 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono lave as células com PBS a 100 microlitros por poço. Adicione 40 microlitros de uma lise de baunilha, tampão e incube por 30 minutos em temperatura ambiente.

Sob agitação, guarde 10 microlitros de lisados celulares em outra placa branca para dosagem subsequente da luciferase do vaga-lume armazenada a quatro graus Celsius ou, alternativamente, a 20 graus Celsius negativos com teto para medir a atividade de Gaia. Coloque a placa em um luminômetro e injete 100 microlitros de reagente de ensaio de luciferase de baunilha nos lisados celulares. Em seguida, conte a luminescência por 10 segundos.

A dosagem de uma placa de 96 poços leva cerca de meia hora. Sempre use extratos frescos, pois o congelamento ou o armazenamento de longo prazo podem afetar a atividade Gaia mediada por interação nos extratos celulares de 10 microlitros restantes. Injete 50 microlitros de reagente de ensaio de luciferase de vaga-lume em lisados celulares usando um luminômetro e contando a luminescência por 10 segundos.

A dosagem de uma placa de 96 poços leva cerca de meia hora para cada interação. Calcule a razão entre a atividade da luciferase de Gaia e a atividade da luciferase de vaga-lumes para obter um valor de luminescência GAIA normalizado. Levando em consideração a eficiência de transfecção e a viabilidade celular.

Calcule a média dos triplicados para monitorar a interação. Estime uma taxa de luminescência normalizada ou NLR para cada par de hospedeiros de patógenos. Para fazer isso, divida a atividade de luminescência GAIA normalizada detectada na presença de patógenos e proteínas hospedeiras pela soma das atividades medidas em poços de controle.

O valor de corte da RNL para interações positivas foi estimado em um estudo anterior em torno de 3,5. Um dos principais pontos fortes dos preceitos GIA de alto rendimento, ensaio de COMPLEMENTAÇÃO de proteínas ou HTPCA reside em sua alta sensibilidade, conforme ilustrado pela avaliação das taxas de falsos positivos e falsos negativos para a proteína HPVE dois para determinar a taxa de falsos negativos. As interações conhecidas de E, dois do HPV 16 foram avaliadas por H-T-G-P-C-A, quatro das 18 interações não foram recuperadas, correspondendo a uma taxa de 22% de falsos negativos.

As interações falso-positivas foram medidas em 5,8% usando 12 HPVE duas proteínas contra um conjunto aleatório de proteínas celulares. A forte especificidade do método é destacada nesta figura mostrando que uma mutação de ponto único conhecida por interferir na ligação de E dois ao seu parceiro celular BRD quatro aniquila, a razão NLR. Esta abordagem ectômica comparativa em larga escala foi recentemente aplicada com sucesso a três proteínas iniciais do vírus do papiloma humano, E dois, E seis e E sete, originárias de diferentes genótipos, representativas de sua diversidade natural de tropismos e patologias para cada uma das proteínas iniciais.

O agrupamento hierárquico dos perfis de interação, em sua maioria, recapitula a filogenia do HPV, provando a robustez da abordagem e o pance dos conjuntos de dados de interação. Ele pode ser usado para correlacionar perfis específicos de interação do hospedeiro do vírus com características patológicas, dando pistas sobre o envolvimento de proteínas virais. Na patogênese, podem ser extraídas interações específicas do genótipo, que potencialmente correspondem ao tropismo ou biomarcadores patogênicos.

Conforme ilustrado aqui para E seis parceiros interagentes, os alvos celulares foram classificados com base na intensidade da interação e agrupados de acordo com o tipo de HPV em interação. Essa representação permite a identificação de biomarcadores específicos, como o fad, que interage apenas com as proteínas E seis do HPV oncogênico. Esse direcionamento deve ser crucial para o caráter carcinogênico de todo o HPV oncogênico e, portanto, constitui um bom candidato para ser usado como um marcador substituto para a infecção pelo HPV ou como um alvo terapêutico.

Seguindo este procedimento. O H-T-G-P-C-A pode ser adaptado para ser usado com uma terceira proteína expressa como uma fusão com uma etiqueta de biotina. Isso permite a captura de três complexos parceiros em placas coloridas de mergulho estreptocócico, e isso pode responder à questão da formação de grandes complexos proteicos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como caracterizar as interações entre patógenos e potes hospedeiros. Terceiro, sondando parceiros de interação de várias variantes de cepa. Em segundo lugar, comparando sua interação com todo um conjunto de tipos de patógenos usando uma duração de proteína proteica, digamos, em células de mamíferos.