Name: Rápidas alto rendimento amilose Determinação em amostras liofilizadas tubérculo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprenda um método colorimétrico de alto rendimento para determinar as proporções de amilose e amilopectina em amostras de tubérculos de batata liofilizados. Esta técnica auxilia programas de melhoramento genético para variedades mais nutritivas.

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O financiamento para esta pesquisa foi fornecido em parte pelo Programa de Pesquisa Associado USDA-ARS e do Comitê de culturas de Germoplasma do USDA.

1. Determinação de amilose de batata Tuber Amido <ol><li> Descasque e corte os tubérculos frescos em cubos pequenos. </li><li> Coloque cubos de batata em pequenos sacos castanhos e armazenar durante a noite a -80 ° C. </li><li> Transfira os cubos de batata para sacos de nylon e por liofilização. </li><li> Depois de liofilizado, moer a amostra de batata em pó utilizando almofariz e pilão ou um Wiley Mill. </li><li> Num tubo de 50 ml, adicionar 20-30 mg da, amostra tubérculo solo seco por congelação. </li><li> Prepara-se uma solução de 45% (w / v) de ácido perclórico (misturar 24,4 ml de ácido perclórico a 60% e 25,6 ml de água ultra-pura. </li><li> Adicionar 500 mL de 45% (w / v) de ácido perclórico e agitar ou agite-a para dispersar os grânulos de amido. </li><li> Após um período de incubação de quatro minutos à temperatura ambiente, adicionar 16 ml de água ultra-pura a solução e misturar por vortex. </li><li> Depois que o material não solúvel tem assentado no fundo do tubo (7-10 minutos mais tarde), a transferência de 40 mL da solução a uma placa de microtitulação (evitando a pipetagem de quaisquer partículas). </li><li> Adicionar 50 ul de solução de iodo (2 g de KI e 1 g de I 2 por 900 ml de água ultra-pura) e misturar a amostra por pipetagem. </li><li> Ler a absorvância a 550 nm e 620 nm imediatamente. </li><li> Determinar a percentagem de amilose depois de comparar a proporção de amilose / amilopectina de cada amostra (620 nm/550 nm de absorvância) com uma curva padrão gerada a partir de amilose e amilopectina soluções a uma gama de concentrações. Este procedimento será descrito a seguir. Leia a (solução de iodo e ácido perclórico) em branco juntamente com as amostras de teste. Use apagado dados para as análises. </li></ol> 2. Amilose / amilopectina Curve <ol><li> Em tubos separados pesa 12,5 mg de teor de amilose e de amilopectina de 12,5 mg. </li><li> Adicionar a cada tubo 5 mL de 45% (w / v) de ácido perclórico e dissolver completamente. </li><li> Para cada uma das soluções (amilose e amilopectina) e levar a um volume final de 50 ml com água ultra-pura. </li><li> Misture 6,25ml de estoque de amilose da etapa anterior com 18,75 ml de água ultra-pura. Isso fará com que uma solução de amilose 6,25 mg / ml. </li><li> Repetir o procedimento para a solução de amilopectina. </li><li> Usando o teor de amilose e amilopectina soluções padrão a partir de passos 2.4 e 2.5, preparar os padrões de amilose por cento que são 0-100% de amilose (100-0% de amilopectina) com um volume final de 5 mL para criar a curva padrão em intervalos de 10%. Por exemplo, para se preparar: A amilose / amilopectina padrão de 100% a 0%, pipeta de 5 ml de solução de amilopectina. A amilose / amilopectina de 90% norma 10%, 0,5 ml de combinar amilose e 4,5 ml de soluções de amilopectina. A amilose / amilopectina padrão de 80% a 20%, misture 1,0 ml de amilose e amilopectina 4,0 ml de soluções. A amilose / amilopectina de 70% norma 30%, 1,5 ml de combinar amilose e 3,5 ml de soluções de amilopectina. A amilose / amilopectina de 60% norma 40%, 2,0 ml combinar amilose e 2,0 ml de soluções de amilopectina. O teor de amilose de 50%/ 50% de amilopectina padrão, combinar 2,5 ml de amilose e amilopectina com 2,5 ml de soluções. A amilose / amilopectina de 40% norma 60%, 3,0 ml combinar amilose e amilopectina de 2,0 ml, e assim por diante). </li><li> Transferir 40 uL de cada mistura de padrão para uma placa de microtitulação. Incluir um poço com 40 uL de 45% (w / v) de ácido perclórico como o branco. </li><li> Adicionar 50 ul de solução de iodo (2 g de KI e 1 g de I 2 por 900 ml de água ultra-pura) e misturar cada amostra (incluindo a branco) por pipetagem. </li><li> Ler as absorvâncias a 550 nm e 620 nm imediatamente e calcular a proporção de amilose / amilopectina, para cada concentração. </li></ol>

<ol><li>Composition Hoover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((molecular+structure%2C+and+physicochemical+properties+of+tuber+and+root+starches%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr%22%5BJournal%5D)">molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review.</a> Carbohydr. 45 (3), 253-267 (2001).</li>
<li>Bertoft, E., Blennow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Potato+Starch%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Potato+Chemistry+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Structure of Potato Starch.</a> Advances in Potato Chemistry and Technology. , 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).</li>
<li>Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+amylose+screening+in+maize+starches+from+exotic+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds.</a> Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).</li>
<li>Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+amylose+determination+methods+and+the+development+of+a+dual+wavelength+iodine+binding+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique.</a> Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).</li>
<li>Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+estimation+of+the+amylose+amylopectin+ratio+in+small+amounts+of+tuber+and+leaf+tissue+of+the+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Potato+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato.</a> Potato Res. 31, 241-246 (1988).</li>
<li>Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShannon%2C+JC+%22Starch%22">Starch</a>. , 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).</li>
<li>Haase, N. U., Plate, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+potato+starch+in+relation+to+varieties+and+environmental+factors%5BTitle%5D)+AND+%22St%C3%A4rke%22%5BJournal%5D)">Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors.</a> Stärke. 48 (5), 167-171 (1996).</li>
<li>Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+on+the+size+distribution+and+amylose%2Famylopectin+ratio+in+potato+starch+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Pot.+J%22%5BJournal%5D)">Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules.</a> Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).</li>
<li>Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+to+measure+amylose+in+cereal+starches+and+flours+with+concanavalin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereal+Sci%22%5BJournal%5D)">A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A.</a> J. Cereal Sci. 25 (2), 111-119 (1997).</li>
<li>Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+amylose+content+of+starches+after+precipitation+of+amylopectin+by+concanavalin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Starch%22%5BJournal%5D)">Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A.</a> Starch. 42, 302-305 (1990).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

Teor de amilose em tubérculos de batata geralmente varia de 20-35% 7,8. Se a maioria dos valores estão do lado de fora deste intervalo, considerar estes erros possíveis: 1) Os dados brutos foram usados ​​em vez de dados inibidas para a construção da curva padrão de amilose / amilopectina, 2) Os dados brutos foram usados ​​em vez de dados inibidas para a determinação do teor de amilose / proporções de amilopectina das amostras de batata, ou 3) a água utilizada para a análise não foi suficientemente puro. Perce...

Cerca de 80% do peso fresco de um tubérculo da batata é água; quase toda a matéria seca remanescente é de amido 1. A maior parte do amido (70%) é composto de amilopectina, enquanto que o restante é amilose. A relação entre a amilose e amilopectina é a propriedade mais importante que influencia as propriedades físicas do amido. Amilose é um alfa 1-4 cadeia glicose linear, enquanto a amilopectina é uma cadeia alfa 1-4 linear com alfa 1-6 ramos 2. Métodos tais como iodo de ligação, calorimetria diferencial de varrimento (DSC), cromatografia de exclusão de tamanho de elevado desempenho (HPSEC) e concanavalina A interacções têm sido desenvolvidos para a determinação de amido em diferentes espécies de plantas 3,4. Cada protocolo requer habilidades e equipamentos especiais, o que torna difícil para escalar até quantificar numerosas amostras de cada vez. O método que apresentamos aqui é um protocolo modificado de Hovenkamp-Hermelink et al. 5, que é uma associação de iodo comprimento de onda duplométodo baseado em grânulos de amido coradas. As vantagens deste método em relação a outras incluir a determinação do teor de amilose de amido em bruto sem purificação e a utilização do sistema de duplo comprimento de onda para aumentar a precisão do método 4,6.

<table><tbody><tr><td colspan="4"> Reagentes</td></tr><tr><td>Amylose </td><td>Sigma</td><td>859656</td><td></td></tr><tr><td>Amilopectina </td><td>Sigma</td><td>A8515</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Perclórico 60%</td><td>Sigma</td><td>311413</td><td>Muito perigoso para a pele e os olhos</td></tr><tr><td>Iodo</td><td>Sigma</td><td>23214TD</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de potássio</td><td>Sigma</td><td>08625JE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><forte>Equipamento</forte></td></tr><tr><td>Leitor de Placas</td><td>Bio Tek</td><td>ELx800</td><td></td></tr></tbody></table>

rápidas alto rendimento amilose determinação em amostras liofilizadas tubérculo

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Este protocolo descreve um elevado através do método colorimétrico de colocar que se baseia na formação de um complexo entre o iodo e cadeias de moléculas de glucose em amido. Iodo forma complexos com tanto amilose e amilopectina em longas cadeias. Após a adição de iodo a uma amostra de amido, o máximo de absorção de amilose e amilopectina ocorre a 620 e 550 nm, respectivamente. A proporção de amilose / amilopectina pode ser estimada a partir da razão dos valores de absorvância de 620 e 550 nm e comparando-os com uma curva padrão em que as concentrações específicas conhecidas são traçados em função de valores de absorção. Esta alta taxa de transferência, método barato é confiável e reprodutível, permitindo a avaliação de grandes populações de clones de batata.

A curva padrão construída a partir de dados inibidas de soluções de concentração de amilose / amilopectina diferentes mostra proporções aproximadas de absorvância entre 0,7 e 1,6 (Tabela 1). Uma linha de tendência de regressão linear a partir destes dados é utilizada mais tarde para inferir o teor de amilose no liofilizadas amostras de batata (Figura 1). O ambiente de produção da planta tem algum efeito sobre o teor de amilose do tubérculo 7. Repl...

Rápidas alto rendimento amilose Determinação em amostras liofilizadas tubérculo

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar de maneira de alto rendimento as proporções relativas de AMLO e amilopectina. Na fécula de tubérculo de batata, a fécula rica em AMLO é desejável devido à sua menor digestibilidade. Batatas com fécula rica em AMLO possuem índice glicêmico mais baixo e maior teor de fibra.Essa técnica está sendo demonstrada por Philip Smith, um estudante de graduação da Universidade de Wisconsin Madison. Em nosso laboratório, estamos interessados em obter variedades de batata mais nutritivas. Uma maneira de fazer isso é aumentar o teor de AMLO no amido de batata.O amido com alto teor de AMLO é mais nutritivo porque possui um índice glicêmico mais baixo, e neste ensaio, desenvolvemos um procedimento que permite analisar um grande número de amostras de forma relativamente rápida. Trata-se de um ensaio repetível, de alto rendimento e de baixo custo. Este ensaio é uma modificação de um procedimento de coloração com iodo. É um ensaio colorimétrico e pode ser realizado em uma placa de 96 poços. Tuberas frescos de batata são utilizados neste método; cubra as tuberas em cubos de aproximadamente um centímetro e descarte os pedaços que contenham pele.Um cortador de batatas fritas permite que esta etapa seja realizada de forma eficiente. Os cubos são colocados em um saco etiquetado. Utilizamos meias de náilon, como as usadas em lojas de calçados.Eles são baratos e permitem que as amostras sequem rapidamente e de forma uniforme no liofilizador. As bolsas de náilon contendo as amostras são colocadas em um saco de papel e congeladas durante a noite a menos 80 graus C. As amostras congeladas são retiradas do saco de papel e colocadas no liofilizador. Com o nosso liofilizador.Leva cerca de cinco dias para secar completamente as amostras. Após os cubos estarem secos, estão prontos para serem processados. Os cubos de batata secos são finamente moídos usando um moinho Wiley ou com um motor e pistilo.Os cubos ou o pó podem ser armazenados até serem processados. No entanto, certifique-se de selá-los em sacos plásticos ou recipientes para evitar que absorvam água. O pó é colocado em um saco plástico para armazenamento até que os ensaios de AMLO possam ser realizados.Uma balança analítica é usada para pesar aproximadamente 20 miligramas de pó de batata, que é então colocado em um tubo plástico de 50 mL. Amostras com peso inferior a 20 miligramas ou superior a 30 miligramas não fornecem resultados confiáveis para tornar o amido solúvel. Adiciona-se 500 microlitros de ácido perclórico a 45% a cada tubo.Tenha cuidado ao trabalhar com ácido perclórico: trabalhe em uma capela de exaustão e use equipamento de proteção individual. Após um período de incubação de quatro minutos, a amostra é diluída com 16 mililitros de água Milli Q sob agitação em vórtex. Em seguida, depois que o material não solúvel se sedimentar no fundo do tubo, transfira 40 microlitros do sobrenadante para a placa de microtitulação.Tenha cuidado para evitar a transferência de qualquer material não solúvel. Adicionam-se 50 microlitros de solução de iodo à amostra e mistura-se cuidadosamente por pipetagem. Não permita que bolhas de ar permaneçam na amostra ou nas paredes do poço.Se bolhas de ar se formarem, toque suavemente na placa sobre a bancada para removê-las. Coloque a placa de microtitulação no leitor de placas e leia a absorbância de cada amostra a 550 nanômetros e 620 nanômetros. Após obtermos os resultados do leitor de placas, podemos comparar os dados com a curva padrão e determinar a razão AMLO/amilopeptina na amostra de amido, conforme tabela um.Esta é uma saída típica da curva padrão conforme explicado no protocolo. Na figura um, as razões de absorbância são representadas graficamente e uma linha de regressão é calculada para a determinação de AMLO nas amostras de batata. Durante a construção da curva padrão, cada ponto na curva deve ser o valor de absorbância da amostra com a concentração conhecida de AMLO.Após subtrair o valor de absorvância do branco. Ao calcular o valor de uma amostra desconhecida, subtraia também o valor de absorvância da tabela de branco. Dois. Esta é uma saída típica do teor de AMLO em tubérculos de batata.Utilizando este método COLORIMÉTRICO, empregamos este ensaio em nosso laboratório para determinar as contribuições relativas do genótipo e do ambiente para a razão AMLO amilopectina na fécula de batata. Esperamos, em última instância, desenvolver marcadores moleculares associados à fécula de alta AMLO e à batata, bem como desenvolver germoplasma que os melhoristas possam utilizar para criar variedades de batata com alto teor de amilose.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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