Utilização de In vivo Imagem para monitorar a progressão da infecção pelo citomegalovírus Experimental Rato em recém-nascidos

O objetivo geral deste procedimento é realizar imagens in vivo de recém-nascidos de camundongos para investigar a disseminação do citomegalovírus luminescente. Isso é feito preparando primeiro a diluição apropriada do vírus a partir de uma solução padrão. Em seguida, os neonatos são injetados com o MCMV luminescente na cavidade peritoneal.

Em momentos após a injeção. Os filhotes são anestesiados e injetados com Lúcifer antes da imagem in vivo. Em última análise, a imagem in vivo é usada para mostrar e quantificar a replicação e disseminação do vírus na cavidade peritoneal e no sistema nervoso central.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como filtrações virais em órgãos após a eutanásia de animais infectados, é que menos tempo e menos recursos são consumidos. Demonstrando o procedimento estará Mr.Il Macan, um técnico do meu laboratório. Uma cepa de MCMV expressando luciferase obtida no laboratório de Ulrich Kowski é usada no estudo a seguir.

Para amplificar a cepa, adicione o vírus às células cultivadas em meio livre de soro a 37 graus Celsius. Após uma hora, remova o sobrenadante e substitua-o por DMEM suplementado com soro de bezerro fetal a 10%. Cinco dias depois, a cultura é colhida e as alíquotas são armazenadas a 80 graus Celsius negativos.

Até uso posterior. Após titular a suspensão viral por ensaio de placa, diluir a amostra a 50 pfu em 50 microlitros de DMEM e deixar no gelo até que as injeções prontas para uso sejam realizadas em neonatos com idade entre quatro e 20 horas. Antes de manusear os filhotes, manipule a cama e as fezes com as mãos enluvadas.

Para evitar a introdução de odores estranhos que possam estressar a mãe a realizar uma injeção prática, encha uma seringa de insulina com azul de metileno a 1% diluído em DPBS. Quando estiver pronto, segure o recém-nascido pela pele dorsal, como visto aqui, com o lado ventral para cima. Introduza a agulha sob as quatro pernas e empurre-a suavemente por via subcutânea para dentro da cavidade peritoneal.

Quando a ponta da agulha estiver na posição correta, injete o metil em azul. Em seguida, retire lentamente a agulha e limpe o sangue do local da injeção. Retorne o recém-nascido de volta à gaiola de origem após a injeção após uma injeção prática bem-sucedida, repita este procedimento com a suspensão viral preparada anteriormente.

As imagens são tiradas sete dias após a injeção, manuseando os neonatos com cautela, conforme mostrado anteriormente. Injete cada um com uma mistura de anestésicos e Lúcifer enquanto espera 12 a 15 minutos Para que o LUCIFERIAN atinja sua emissão máxima, certifique-se de que a plataforma na câmara de aquisição do dispositivo de imagem seja aquecida para manter a temperatura corporal correta. Depois que os filhotes são anestesiados e marcados para identificação, eles estão prontos para serem colocados no sistema de imagem.

Primeiro, realize a aquisição da luz emitida por todo o corpo. Como o vírus se replicou em vários órgãos-alvo, a duração da exposição deve ser curta. Aqui, a aquisição é realizada por 10 a 20 segundos.

É útil obter imagens de baixa resolução de vários animais dentro de uma rodada de aquisição e, em seguida, mover a plataforma para mais perto para focar em uma parte de um animal específico ou em um órgão isolado após a dissecação. Para obter um sinal de luz apenas da cabeça, cubra o resto do corpo com um papel grosso e escuro que mascarará os fótons, faça a aquisição por cinco a 10 minutos e repita isso para o lado oposto do animal. Nas mesmas condições.

Após a imagem, retorne os filhotes a uma gaiola aquecida para manter a temperatura corporal enquanto anestesiados. Essas imagens foram tiradas nos dias 7, 9, 11 e 14 após a infecção, o título viral geral no animal parece diminuir com o tempo. Neste exemplo, o corpo é coberto, deixando a cabeça exposta.

Isso revela um ponto discreto ao nível da orelha esquerda, cuja intensidade aumenta entre o sétimo e o 14º dia, sugerindo que a disseminação do MCMV para o cérebro pode ser observada dinamicamente in vivo. Após este procedimento, outros métodos, como imuno-histoquímica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a localização precisa do vírus no cérebro.