Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

O objetivo geral deste procedimento é microinjetar oligonucleotídeos morph no ventrículo cerebral do cérebro de peixes-zebra adultos e reduzir a atividade de genes nas células gliais radiais. Isso é realizado primeiramente anestesiando o peixe-zebra. Em seguida, uma incisão é feita no crânio, sobrepondo o teto óptico, utilizando uma agulha dentada com ponta barbuda.

Em seguida, a solução de morpholino é injetada através do local da incisão no líquido ventricular cerebral. Por fim, a eficiência e precisão da injeção são verificadas sob o microscópio de fluorescência. Em última instância, podem-se obter resultados com o bloqueio demasiado eficiente e disseminado da produção proteica a partir dos genes de interesse nas células gliais radiais do cérebro de peixe-zebra adulto por meio da inibição gênica mediada por morpholino, que pode ser analisada por meio de cortes histológicos e colorações imunohistoquímicas.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como abordagens transgênicas ou métodos de entrega baseados em eletroporação, é que a IMVC é menos demorada e mais eficiente no direcionamento de toda a população de células gliais radiais. Esses genes ajustáveis e múltiplos podem ser silenciados ao mesmo tempo. Para preparar a mistura de injeção, comece produzindo uma solução estoque de Morpho a 500 micromolares.

Usando PBS para 10 injeções, prepare 10 microlitros da mistura de injeção combinando nove microlitros de solução de morpholino diluída ou não diluída com um microlitro de um corante fluorescente de rastreamento. Armazene em temperatura ambiente. Use um puxador de agulhas para preparar capilares de injeção de vidro de acordo com os seguintes parâmetros.

Ligue a fonte de pressão e ajuste as configurações de pressão para 50 PSI ou 3,5 bar. Ajuste as configurações do microinjetor da seguinte maneira: pressão de retenção 20 PSI, pressão de ejeção 10 PSI, valor do período 2,5 e 100 milissegundos.

Intervalo de acionamento. Ligue o iluminador anelar e localize o anel sobre a platina do microscópio. Posicione o suporte de capilar em uma posição apropriada ao lado do microscópio.

Insira a capilar de vidro no suporte e ajuste o ângulo de injeção para 45 graus. Usando pinças de ponta fina, quebre a ponta da capilar de vidro e calibre a pressão liberada pela abertura. Mergulhando a ponta da agulha na água do peixe e aplicando um pulso de pressão contínuo, as bolhas de ar devem formar uma única fileira, indicando pressão ou tamanho de abertura ideais.

Carregue a micropipeta de vidro com a solução de injeção. Evitando bolhas de ar, aplique pressão para remover o ar entre a ponta da micropipeta de vidro e a solução de injeção carregada. Após preparar uma solução de 0,1% de meab anestésico, transfira o número desejado de peixes para um recipiente de transporte com água para peixes.

Prepare uma solução de trabalho do anestésico misturando 200 mililitros de água para peixes com cinco mililitros da solução estoque de MISP. Encha um recipiente de Petri até a metade com o anestésico para uso nas injeções. Incube um peixe no anestésico até que pare de se mover.

Em seguida, use uma rede para transferi-lo para a placa de Petri contendo o anestésico. Para facilitar a incisão, use a pinça para segurar suavemente o peixe e posicione-o com a cabeça ligeiramente inclinada para baixo. Usando a ponta de uma agulha fina de calibre 30, faça um pequeno corte no crânio sem penetrar muito profundamente, pois isso causará danos ao tecido cerebral.

Enquanto mantém o peixe, insira a ponta da pipeta de vidro através do local da incisão cerca de meio milímetro e, evitando o contato com o tecido cerebral, direcione-a em direção ao cefalão. Injete a solução, que deve se dispersar imediatamente. Transfira o peixe para água fresca para peixes e permita que se recupere.

Cerca de 30 minutos depois, reanestesie o peixe e verifique-o sob um microscópio de fluorescência para observar a distribuição ampla do líquido. Com base na fluorescência vermelha. Devolva o peixe ao seu tanque e coloque-o novamente em circulação.

Até o uso para análises comportamentais ou para o preparo de espécimes de tecido como visto aqui, uma injeção precisa leva à dispersão da solução injetada por todo o cérebro e ao direcionamento eficiente das células próximas à superfície ventricular. No entanto, em injeções nas quais a capilaridade de vidro perfura o tecido cerebral, haverá um sinal fluorescente denso no ponto de injeção. E se a quantidade injetada não for suficiente, um sinal fluorescente fraco será observado.

Esta figura demonstra que os morphos vivo podem penetrar alguns diâmetros celulares na superfície ventricular e, portanto, podem direcionar eficientemente as células ventriculares em comparação com o controle Morpho. A injeção de morpho contra PCNA reduz eficientemente a expressão gênica em células ventriculares. Nessas imagens de imunofluorescência, as marcações imunes de BRDU e QCD após o experimento de pulse chase A-B-R-D-U demonstram que a redução de PCNA com morpholinos antissenso leva a uma diminuição significativa em neurônios recém-nascidos, sugerindo que a CVMI pode ser usada para silenciar genes endógenos que subsequentemente geram consequências funcionais.

Assim, após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da área de neurociência explorassem os mecanismos moleculares envolvidos na resposta de neurogênese regenerativa no cérebro adulto de peixes.