Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é avaliar as estruturas cerebrovasculares em peixes-zebra embrionários. Isso é feito primeiro coletando ovos de peixe-zebra fertilizados e estabelecendo condições de tratamento. Após um período de crescimento de três dias, o peixe-zebra é sacrificado fixo e um olho é cuidadosamente removido antes de montar o espécime na tampa de vidro.

Em seguida, a vasculatura do cérebro é visualizada por microscopia confocal. Finalmente, as renderizações 3D da vasculatura são geradas usando software de código aberto. Em última análise, a análise das reconstruções é usada para determinar os efeitos das condições de tratamento na ramificação e densidade dos vasos sanguíneos.

No cérebro do peixe-zebra em desenvolvimento. Esta técnica avalia todo o sistema vascular do peixe-zebra embrionário. Isso nos permitiu estudar a biologia da beta-amilóide em um nível de sistemas de órgãos.

A demonstração visual desse método é crítica, pois a dissecção e a análise de imagens são difíceis de aprender porque são tecnicamente desafiadoras. Para começar, crie uma cepa de peixe-zebra transgênica expressando proteína fluorescente verde aprimorada nos tecidos desejados a 28,5 graus Celsius com um ciclo de luz de 14 horas e escuro de 10 horas. Neste exemplo, peixes transgênicos que expressam EGFP em células endoteliais vasculares são criados na noite anterior à coleta de óvulos em machos e fêmeas em tanques de acasalamento com fundo de malha Na manhã seguinte, remova a divisória e deixe os peixes acasalarem verificando se há ovos a cada 15 minutos.

Depois de usar uma peneira de malha para coletar os ovos e E três médios para lavá-los, use E três para transferir os ovos para placas de cultura de 100 milímetros e incubá-los a 28 graus Celsius para alterar a ramificação cerebrovascular. A partir de 24 horas após a fertilização, adicione um produto químico como um inibidor da gama secretase solubilizado em DMSO. Se desejar, adicione 0,03% PTU para inibir a formação de pigmentos.

Depois de transferir os embriões em solução para os poços de uma placa de 12 poços, incubar a 28,5 graus Celsius até que os embriões atinjam o estágio de desenvolvimento desejado. Depois de sacrificar embriões in trica e fixá-los com aldeído durante a noite a quatro graus Celsius. Armazene embriões em PBS no escuro a quatro graus Celsius.

Para remover o olho do embrião, use uma agulha de tungstênio afiada e corte ao redor do tecido que conecta um olho. Em seguida, corte os músculos e, finalmente, o nervo óptico para remover o olho. Depois que o olho for removido, vire o embrião sobre uma lamínula com a órbita vazia voltada para baixo e tocando a lamínula.

Adicione uma gota de 3% de metilcelulose para manter o embrião no lugar e cobrir todo o embrião para evitar a dessecação. Durante a imagem usando um microscópio confocal invertido com uma imagem objetiva APO de 20 x plano, o embrião imediatamente, muitos sistemas de imagem só serão capazes de resolver estruturas vasculares na metade deste espécime. Se for esse o caso, resus, suspenda o embrião em PBS e remonte-o no lado contralateral para obter mais imagens para realizar a reconstrução 3D de imagens cerebrovasculares usando a imagem J, que é otimizada para renderizações 3D.

Importe pilhas confocais acessando plugins, loci, importador de formatos bio e, em seguida, selecione o arquivo confocal para pilhas Nikon, selecione a pilha de visualização com hiperpilha e defina o modo de cor para escala de cinza. Em seguida, verifique o dimensionamento automático e a divisão de canais. Essas seleções abrirão quatro painéis de canais separados.

Feche todas, exceto a imagem de 16 bits, com o nome do arquivo seguido por c igual a um. Ajuste o limite usando a guia de rolagem na parte inferior para examinar e localizar uma fatia que tenha a região ou estrutura de interesse. Em seguida, vá para o limite de ajuste de imagem.

No painel que aparece, deslize a barra superior para a esquerda para que a estrutura possa ser vista muito bem sobre o fundo e deixe o slide inferior onde está para criar uma nova imagem de oito bits. Selecione b e w. Em seguida, fundo escuro.

Não selecione calcular limite para cada imagem, a menos que sejam necessários ajustes diferentes para cada fatia. Em seguida, vá para o fator de reamostragem zero do limite do visualizador 3D de plug-ins um ou dois e desmarque as caixas de cores vermelha e azul para fazer uma saída 3D verde. Caso contrário, produzirá uma renderização branca.

Em seguida, selecione aplicar. Use os controles do mouse e do teclado para girar, girar e ampliar a imagem 3D para salvar imagens estáticas a qualquer momento. Use a opção de captura no menu.

O tamanho da caixa de imagem na tela determina as dimensões em pixels da imagem produzida, portanto, se desejar uma imagem de alta resolução, aumente a caixa arrastando o canto inferior direito. Crie um filme 3D giratório selecionando a rotação de 360 graus do registro de exibição. Por fim, salve o arquivo em um dos vários formatos disponíveis e use o reprodutor de mídia de código aberto gratuito VLC para visualização em 3D.

A reconstrução de estruturas vasculares fornece uma perspectiva abrangente e visualmente interessante do desenvolvimento do peixe-zebra. Aqui são mostrados vários ângulos de estruturas vasculares em um embrião de peixe-zebra seis dias após a fertilização que expressou EGFP em células endoteliais com cores monocromáticas verde ou branca. Pode ser difícil apreciar a intensidade do sinal, mas a pseudocoloração fornece intensidade de imagem a partir de uma tabela de pesquisa, o que permite uma melhor percepção de profundidade de estruturas sobrepostas.

Por exemplo, esta figura mostra uma imagem 3D pseudocolorida da vasculatura em um peixe-zebra seis dias após a fertilização após seu desenvolvimento. Essa técnica nos permitiu explorar os efeitos vasculares da beta-amilóide no cérebro de um vertebrado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar as redes vasculares no peixe-zebra embrionário, o que fornece um sistema econômico e acessível para estudar a angiogênese.