Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

O objetivo geral deste procedimento é atingir uma proteína específica no tecido do rato. Isso é feito primeiro isolando, fixando e incorporando o tecido com parafina, seguido pela secção do tecido e montando-o em lâminas. O segundo passo é desparafinizar e reidratar as seções de tecido embebidas em parafina e, em seguida, bloquear a peroxidase endógena.

Em seguida, os epítopos são descobertos pela recuperação do antígeno. Posteriormente, o bloqueio é realizado para reduzir a ligação inespecífica antes da introdução dos anticorpos. A etapa final é detectar o epítopo específico por imunomarcação com anticorpos primários e secundários e desenvolver o sinal do anticorpo secundário marcado.

Por fim, o sinal é visualizado usando microscopia de luz para mostrar o padrão de localização da proteína nas seções de tecido. Embora esse método possa fornecer informações sobre a localização de proteínas e padrões de expressão no sistema nervoso central de ratos e nos gânglios linfáticos periféricos, ele também pode ser aplicado a outros órgãos e espécies. Para demonstrar o procedimento será um técnico.

O nome dela é Katalin Benedek, da instalação central do centro de microbiologia de tumores e biologia celular do Karolinska Institutet. Para iniciar a preparação do tecido, mergulhe o cérebro dissecado, a medula espinhal e o tecido dos linfonodos periféricos em quatro por cento de paraformaldeído e coloque-o a quatro graus Celsius por 24 horas. Depois que os tecidos estiverem fixados, transfira o tecido para PBS e armazene-o a quatro graus Celsius até o processamento posterior.

Para começar a processar o tecido, use uma lâmina de barbear para cortar o tecido em porções de aproximadamente cinco milímetros. Em seguida, inicie o processo de endurecimento do tecido com um processador de infiltração a vácuo. O procedimento padrão é baseado na submersão em concentrações ascendentes de etanol, seguido de xilol e, finalmente, parafina.

Em seguida, coloque o tecido em um molde. Despeje a parafina líquida ao redor da amostra para formar um bloco de parafina e armazene-a em temperatura ambiente. Antes de seccionar o tecido, resfrie o bloco de parafina durante a noite na placa fria ou na geladeira.

Depois que o bloco de parafina for resfriado, coloque o bloco no suporte fixo de um micrótomo de trenó que pode se mover para trás e para frente em uma faca. Em seguida, ajuste o bloco e a faca do micrótomo para o ângulo ideal, que depende da geometria da faca e da velocidade e técnica de corte. Corte três seções transversais de cinco mícrons de espessura do bloco de parafina.

Em seguida, transfira as seções cortadas para um recipiente de água e monte as seções da água em uma lâmina de vidro adesiva pré-revestida comercial. Em seguida, pressione a seção montada cuidadosamente contra uma toalha de papel para remover a água residual e possíveis bolhas de ar. Seque as lâminas montadas por algumas horas em um fogão ajustado para 50 a 60 graus Celsius.

Quando as lâminas estiverem secas, mergulhe-as duas vezes em xilol por 15 a 20 minutos cada. Em seguida, enxágue cada lâmina com etanol a 99%. Para bloquear a atividade da peroxidase endógena, incube as seções por 30 minutos em uma solução de metanol contendo 0,25% de peróxido de hidrogênio.

Em seguida, continue reidratando as seções de tecido enxaguando com soluções de etanol contendo teor crescente de água. Execute a etapa final de reidratação em água destilada. Certifique-se de manter as seções úmidas até que as lamínulas sejam montadas.

Para recuperar o antígeno, aqueça as lâminas com um vaporizador doméstico e tampão EDTA a pH 8,5 por 60 minutos. Em seguida, resfrie as lâminas em temperatura ambiente por aproximadamente uma hora. Quando as lâminas estiverem frias, enxágue cada lâmina de três a cinco vezes em solução salina tamponada com Tris, ou TBS.

Em seguida, incube as seções de tecido em temperatura ambiente por 30 minutos em uma solução de bloqueio contendo 10% de soro fetal de bezerro e 90% de tampão de lavagem para bloquear quaisquer reações de fundo inespecíficas. Depois que as seções de tecido forem bloqueadas, dilua a quantidade necessária de anticorpos primários na solução de bloqueio e incube as lâminas nesta solução de anticorpos primários durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, enxágue as lâminas de três a cinco vezes com tampão TBS.

Em seguida, incubar as lâminas com anticorpos secundários diluídos na solução de bloqueio durante uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, enxágue novamente as lâminas três a cinco vezes com tampão TBS. Em seguida, incubar as lâminas com complexo de peroxidase de rábano avidina, diluído de um a 100 na solução de bloqueio, durante uma hora à temperatura ambiente.

Quando a incubação de uma hora estiver concluída, enxágue as lâminas de três a cinco vezes com tampão TBS. Depois de preparar a solução azul rápida conforme descrito no protocolo de texto, agite levemente o prato e filtre a mistura obtida. Despeje a solução nas lâminas da cubeta de vidro.

Comece a incubação a 37 graus Celsius e observe o processo de revelação ao microscópio óptico a cada 15 a 30 minutos. Quando a incubação estiver concluída, enxágue as lâminas três a cinco vezes com tampão TBS e, em seguida, transfira as lâminas para o tampão PBS. Para fazer a solução reveladora de peróxido de hidrogênio DAB, primeiro dilua um mililitro de uma solução estoque DAB em 49 mililitros de PBS.

Adicione 16,5 microlitros de peróxido de hidrogênio e filtre a solução. Despeje a solução nas lâminas e certifique-se de controlar o processo de revelação sob o microscópio óptico para evitar um fundo alto que possa mascarar o sinal específico. Em seguida, enxágue as lâminas de três a cinco vezes com P-B-S, seguido de uma lavagem final com água destilada ou água da torneira.

Monte as lâminas com lamínulas diretamente da água, usando meio de montagem aquoso. Evite criar bolhas de ar entre a lamínula e o slide. Depois de montar as seções, incube as lâminas durante a noite a quatro graus Celsius para permitir que o meio de montagem seque completamente.

Armazene as lâminas secas em temperatura ambiente. A dupla coloração de cortes de tecido linfonodal periférico isolados de ratos no sétimo dia pós-imunização revelou que os linfócitos T CD8 positivos não secretaram a quimiocina C-C-L 11. Alternativamente, descobriu-se que o CCL 11 co-localiza com o ED, um marcador para proteína lisossômica em macrófagos ativados.

A coloração dupla I-H-C da medula espinhal de um rato identificou a produção de onze C-C-L em pericários neuronais, dendritos e axônios, mas não em macrófagos positivos para IBA um e células da microglia residentes no cérebro. Além disso, a maioria dos macrófagos positivos para E-D 1 e células da microglia residentes no cérebro também não foram positivas para CCL 11. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um direcionamento imuno-histoquímico específico e confiável da proteína diretamente nas seções de tecido.