Name: Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a realizar imunomarcação dupla em tecidos de sistema nervoso central e linfonodos periféricos de ratos. Este protocolo otimizado permite visualizar padrões de localização proteica por microscopia de luz.

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Agradecemos a Hans Lassmann e Jan Bauer por sua orientação e apoio. Agradecemos também a Katalin Benedek pela excelente assistência técnica e a Caroline Westerlund pela avaliação crítica e linguística.
Este estudo foi apoiado por doações da Biogen Idec, da Fundação Wenner-Gren, do Conselho Sueco de Pesquisa, da Associação Sueca de Pessoas com Deficiências Neurológicas, da Fundação Sueca do Cérebro, do EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) e Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

Declaração de ética O presente estudo é realizado em conformidade com as orientações do Conselho Nacional Sueco de Animais de Laboratório e a Directiva do Conselho da Comunidade Europeia (86/609 / CEE), sob as licenças éticas N338 / 09, N15 / 10 e N65 / 10, que foram aprovadas pelo Comissão de Ética do Norte Estocolmo animal. 1. Preparação do Tecido <ol><li> Perfusão e fixação <ol><li> Anestesiar os animais com isoflurano para realizar perfusão transcardial através do ventrículo esquerdo. Inicia-se a lavagem da vasculatura com salina tamponada com fosfato (PBS) para remover os componentes do sangue, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS 0,1 M (PFA). </li><li> Fixar cérebros dissecados, medula espinhal e tecido LN periférica por imersão em PFA. Após 24 h a 4 ° C, transferir o tecido de PFA em PBS e armazenar a 4 ° C até posterior processamento. Em alternativa ao PBS comercial, dissolver 9 g de NaCl em 250 ml da S &amp;# 246; tampão Rensen e adicionar 750 mL de água desionizada (dH2O); para preparar tampão 0,2 M Soerensen (pH 7,4) dissolver-se 13,8 g de NaH 2 PO 4 x 1H 2 O e 71,2 g de Na 2 HPO 4 x 2H 2 O em 2,5 L de dH2O </li></ol></li><li> A desidratação e incorporação <ol><li> Cortar o tecido em cerca de 5 mm de espessura porções utilizando uma lâmina de barbear. </li><li> Iniciar o processo de endurecimento do tecido (desidratação), utilizando o processador de vácuo Infiltração VIP Tissue-Tek (procedimento padrão com base em submersão em concentrações crescentes de etanol, seguindo-se o xileno e, finalmente, parafina (Tabela 1). </li><li> Colocar o tecido em um molde e despeje a parafina líquida em torno da amostra de modo a formar um &quot;bloco de parafina&quot;. armazenamento de longo prazo requer temperatura ambiente (RT). No entanto, antes do corte, é recomendável para arrefecer os blocos, por exemplo, durante a noite (O / N) a 4 ° C.</li></ol></li></ol> 2. Seccionamento <ol><li> Colocar o bloco de parafina em um suporte fixo do micrótomo trenó, que pode mover-se para a frente e para trás através da faca. Ajustar o ângulo óptimo entre o bloco e a faca micrótomo (que depende da geometria da faca, mas também sobre a velocidade de corte e da técnica). </li><li> Cortar 3-5 mm de espessura secções transversais do bloco de parafina. </li><li> Transferir secção basta cortar em um recipiente de água e montá-lo posteriormente a partir da água sobre a lâmina de vidro. </li><li> Pressione a seção montada cuidadosamente contra uma toalha de papel para remover a água residual e bolhas de ar em potencial. Comercialmente pré-revestidos lâminas de vidro adesivas são recomendáveis. </li><li> Dry slides montados por um par de horas em um fogão em 50 - 60 ° C. </li></ol> 3. desparafinização (Reidratação e bloqueio da peroxidase endógena) <ol><li> Mergulhe as lâminas 2x em xileno (substituto alternativamente xilenoXEM-200), cada período de 15 - 20 &#39;. </li><li> Enxágüe em 99% de etanol. </li><li> Para bloquear a actividade da peroxidase endógena, incubar as secções durante 30 minutos em solução de metanol contendo 0,25% de peróxido de hidrogénio. </li><li> Continuar a reidratação usando etanol com o aumento do teor de água (99%, 70%, terminando-se em água destilada. </li><li> A partir deste ponto até que a montagem da cobertura desliza seções tem que ser mantido úmido. </li></ol> 4. Antigen Retrieval <ol><li> Usar um vapor de alimentos para ferver as lâminas numa solução de recuperação de antigénio (neste caso de EDTA pH 8,5 tampão) durante 60 &#39;(EDTA solução tampão contém 1,21 g de Tris e 0,37 g de EDTA em 50 ml de dH2O; para preparar o trabalho solução de 2,5 ml de EDTA em solução diluída de 47,5 ml de dH2O). </li><li> Esfriar as lâminas sobre RT durante aprox. 1 h e, em seguida, lavar 3 - 5x com solução salina tamponada com Tris (TBS, usar alternativamente PBS) que consiste em Tris 0,05 M e NaCl 0,15 M; pH 7,5 ajustado with HCl. Como alternativa, use TBS comercial. </li></ol> 5. O bloqueio dos Sites ligação inespecífica <ol><li> Para evitar reacções inespecíficas fundo, incubar as secções em RT durante 30 minutos na solução de bloqueio contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 90% de tampão DAKO. </li></ol> 6. Faça duplo imunomarcação: incubação simultânea com as Abs primárias <ol><li> Dilui-se a quantidade necessária de anticorpos primários na solução de bloqueio e incubar o / n a 4 ° C. Para o duplo imunocoloração combinar α-eotaxina (CCL11; 1: 300) com α-CD68 (Ed1; 1: 1000) ou α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) ou α-CD8a (Ox-8; 1: 200) . </li><li> Enxaguar as lâminas 3-5x com tampão de TBS (usar alternativamente 10x tampão DAKO diluído). </li><li> Dilui-se a quantidade necessária de anticorpos secundários (anti-cabra biotinilado e anti-murganho conjugado com AP, tanto 1: 200) em solução de bloqueio e incubar durante 1 h em TA. </li><li> Lavar as lâminas 3 - 5x com tampão de TBS (use, alternativamente, 10x diluída tampão DAKO). </li><li> Incubar as lâminas com o complexo de avidina-peroxidase de rábano (HRP), diluído em solução de bloqueio durante 1 h em TA. </li><li> Lavar as lâminas 3 - 5 vezes com tampão TBS (tampão de usar alternativamente 10x diluída DAKO). </li></ol> 7. Visualization <ol><li> A visualização do anticorpo secundário marcado ligado AP- <ol><li> Preparar tampão Tris-HCl 0,1 M por dissolução de 12,1 g de Tris em 1 L de dH2O e ajustar o pH para, utilizando HCl. Utilizar o mesmo tampão Tris-HCl para preparar a solução de 1 M de levamisol. Preparar de fresco uma solução a 4% de NaNO2 em dH 2 O. </li><li> Para se obter 50 ml do azul (FB) substrato rápido (volume necessário para uma cuvete de vidro padrão) dissolvem 6,25 mg de Naftol-AS-MX-fosfato em 312,5 DMF ul no tubo de vidro e agita-se em 50 ml de pré-aquecido (37 ° C) tampão Tris-HCl. Para dissolver 12,5 mg FB RR sal em 312,5 mL de HCl 2 N adicionar 312,5 ul de previamente prepavermelho 4% de solução de NaNO2 e agitar a mistura para os mesmos 50 ml de tampão Tris-HCl a pré-aquecido. Agitar suavemente até que o líquido amarelo claro e torna-se, finalmente, adicionar 77 ul de uma solução 1 M Levamisol previamente preparada. Filtrado obtido mistura e despeje em lâminas colocados na cuba de vidro. </li><li> Inicia-se a incubação a 37 ° C e controlar processo de desenvolvimento sob a luz do microscópio aprox. cada 15-30 min. Se virando irregular, substitua a solução FB com a nova mistura. </li><li> Lavar as lâminas 3 - 5x com tampão de TBS e, subsequentemente, a transferência para tampão de PBS. </li></ol></li><li> Visualização do anticorpo secundário biotinilado ligado <ol><li> Prepare DAB / H 2 O 2 a solução de revelação por diluição de 1 ml de solução de DAB (25 mg de DAB por 1 mL de PBS) em 49 ml de PBS. Adicionar 16.5 ul de H 2 O 2 e filtrado antes vertendo-a em secções. </li><li> Conversão do DAB cromogénio em precipitando testan pigmento pode ser imediata. Controlar o processo de desenvolvimento sob o microscópio de luz (mesmo par de segundos a mais de incubação pode levantar um fundo de altura e mascarar o sinal específico). </li><li> A intensidade do pigmento castanho precipitado pode ser aumentada em alternativa, através de incubação na solução que consiste de 2% de sulfato de cobre e 0,9% de NaCl em 5 &#39;. </li><li> Lavar as lâminas 3 - 5 vezes com PBS e finalmente com dH2O, utilize em alternativa, a água da torneira. </li><li> Montar as lâminas com tampa desliza diretamente da água, utilizando meio de montagem GelTol aquosa. Evitar a criação de bolhas de ar. </li><li> Permitir a secagem completa do meio de montagem, por exemplo, o / n a 4 ° C. Loja seca lâminas em RT. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1. </td><td> % Etanol </td><td> 20 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 2. </td><td> % Etanol </td><td> 60 &amp;# 39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 3. </td><td> % Etanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 4. </td><td> % Etanol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 5. </td><td> % Etanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 6. </td><td> % Etanol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 7. </td><td> % Etanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 8. </td><td> % Etanol </td><td> 120 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 9. </td><td> xilol </td><td> 30 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 10. </td><td> xilol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 11. </td><td> Parafina </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 12. </td><td> Parafina </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 13. </td><td> Parafina </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 14. </td><td> Parafina </td><td> 120 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Processamento de tecido por Tissue-Tek VIP Vacuum Infiltração Processor.

<ol><li>Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).</li>
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<li>Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endogenous+tissue+alkaline+phosphatase+with+the+use+of+alkaline+phosphatase+conjugates+in+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).</li>
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<li>Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+endogenous+biotin-containing+proteins+in+mouse+Bergmann+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells.</a> The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).</li>
<li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Immunohistochemical+Staining+Today%3A+Choices+to+Make%2C+Challenges+to+Take%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

procedimentos IHC padrão muitas vezes exigem ajustes específicos para obter um ótimo resultado, que normalmente implica uma vasta experiência, mas também abordagem de &quot;tentativa e erro&quot;. De preparação do tecido até visualização alvo, quase cada etapa do protocolo pode ser submetido a modificações concebidas individualmente, a fim de melhorar o resultado final. protocolo de coloração dupla aqui apresentado exemplifica proteínas na IHC visando particularmente ajustada para avaliar as inter-relações entre as prot...

Apesar de a utilização de técnicas avançadas de alto rendimento análises realizadas na methylome, transcriptoma ou até mesmo nível de proteoma, imunocoloração continua sendo o padrão ouro para detecção de proteína directamente na amostra de tecido, cultura celular ou um esfregaço celular. Ao revelar o padrão de localização / distribuição, imuno-histoquímica (IHQ) pode avaliar proporções relativas e inter-relações topográficas das proteínas alvo, e até mesmo indicar as suas atividades biológicas. Portanto, IHC é amplamente utilizada para fins clínicos e de pesquisa, por exemplo, para o diagnóstico, avaliações de tratamento, estudo dos mecanismos da doença, alterações funcionais e fenotípicas em modelos animais, etc. Compreendendo essencialmente histologia, patologia, bioquímica e imunologia, IHC tem avançado de forma significativa desde 1941, quando os anticorpos marcados com fluorescência foram utilizados pela primeira vez para identificar antigénios pneumocócicos no tecido infectado 1. Visualization de produtos e componentes celulares por IHC é baseada na ligação de anticorpos (Abs) para o seu antigénio específico (Ag). Além disso, utilizando anticorpos etiquetados fluoróforo, reacções imunes pode também ser visualizada usando enzimas como peroxidase ou fosfatase alcalina 2,3 4. Além disso, os anticorpos marcaram-ouro coloidal 5 são usados para detectar a interacção específica antigénio-anticorpo por luz e microscopia electrónica, enquanto marcadores radioactivos são visualizadas por autorradiografia. A imuno Ag-Ab pode ser detectado através de métodos diretos e indiretos. O método directo é essencialmente mais simples e mais rápido, uma vez que utiliza directamente marcado Abs primária 6. No entanto, devido à falta de sensibilidade significativa, métodos indirectos são preferidos para os directos. Procedimentos de detecção indirecta duas etapas requerem unlabeled Abs primária, como o primeiro, e rotuladas Abs secundários dirigidos contra o Abs primário, como a segunda camada 7.amplificação do sinal pode ser conseguida com o envolvimento mais, de enzima acoplada terciária Ab (três passos método indirecto) que se liga ao Ab secundário. métodos de detecção comummente usados ​​são indirectos avidina-biotina peroxidase-antiperoxidase e (PAP). Alternativamente, fosfatase alcalina fosfatase antialcalinos (APAAP) complexo pode ser usado em vez do método PAP. Notavelmente, fosfatase alcalina (AP) métodos parecem ser ainda mais sensível do que os métodos de imunoperoxidase 4. método de complexo avidina-biotina (ABC) utiliza Ab biotinilado secundário em combinação com avidina marcada com biotina complexo (LAB), ou estreptavidina marcada com biotina complexo (LAJE). A sensibilidade da detecção pode ser adicionalmente aumentada através do envolvimento de avidina marcada com peroxidase ou fosfatase alcalina 8. Outros métodos de detecção em uso são rotulagem polimérica, amplificação tiramina eo círculo 9 imuno-rolamento. Notavelmente, os diferentes métodos de detecção podem ser combinados para a detecção múltipla de Ag no mesmo tecidoamostra, que foi relatada pela primeira vez em 1978 4. imunomarcação dupla simultânea aqui apresentado foi realizado em fixado em formol e rato parafinado do SNC e LN cortes de tecidos utilizando anticorpos secundários ligados a peroxidase e AP-conjugados, respectivamente. Os sinais foram visualizados utilizando 3,3&#39;-diaminobencidine cromogénio (DAB) e o Azul Rápido (FB) APAAP complexo, respectivamente.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagente</td></tr><tr><td>Isoflurano (Isoflurano): 1-Cloro-2,2,2-trifluoretilo (éter difluormetílico) 2-Cloro-2-(difluormetoxi)-1,1,1-trifluoretano (C3H2ClF5O)</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td>Irradiação ocular. Provavelmente influencia a fertilidade e danifica o bebê no útero. Administrar apenas em ambiente anestesiante adequadamente equipado.</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Merck</td><td>1.0604</td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato salino (PBS), comprimido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% em 1x PBS</td><td>Apl pharma</td><td>34 24 28</td><td>Perigo para a saúde. Corrosivo. Inflamável. Toxicidade aguda.</td></tr><tr><td>Etanol &#8805; 99,5%, absoluto (CH3CH2OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-1L</td><td>Flamable.</td></tr><tr><td>Xileno (xilenos, grau histológico; C6H4(CH3)2 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Flamable. Toxicidade aguda.</td></tr><tr><td>Cera de Parafina Histo-Comp</td><td>Tecido-Tek</td><td>V0-5-1001</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio Adesivas</td><td>Starfrost</td><td>MIC-1040-W</td><td></td></tr><tr><td>Substituto de xilol XEM-200 </td><td>Vogel GmbH</td><td>ND-HS-200</td><td>Sensibilização respiratória. Carcinogenicidade.</td></tr><tr><td>&alpha;-CD8 (Ox-8) camundongo anti-rato, anticorpo primário</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA48G</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Iba1 (AIF1) anti-rato, anticorpo primário</td><td>Millipore</td><td>MABN92</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD68 (ED1) anti-rato, anticorpo primário</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA341R</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-eotaxina C-19 (CCL11) anti-rato de cabra, anticorpo primário</td><td>Santa Cruz BT</td><td>SC-6181</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina (AP)</td><td>Dakopatts, Dinamarca</td><td>D0314</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário biotinilado</td><td>Amersham Biotech</td><td>RPN1025</td><td></td></tr><tr><td>complexo Avidin-peroxidase de rábano (HRP) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3151</td><td></td></tr><tr><td>Naftol fosfato AS-MX (C19H18NO5P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4875-1G</td><td>Toxicidade aguda.</td></tr><tr><td>Sal RR azul rápido, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FBS25</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de levamisol (C11H13ClN2S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31742</td><td>Toxicidade aguda.</td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobenzidina tetracloridrato (DAB Chromogen)</td><td>DAKO</td><td>S3000</td><td>Altamente inflamável. Tóxico.</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (CuSO4)</td><td>Merck</td><td>1.02791</td><td>Toxicidade aguda. Perturbação ambiental.</td></tr><tr><td>GelTol Aquoso Montagem Medium</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>230100</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio, 30% (H2O2)</td><td>Merck</td><td>107210</td><td>Toxicidade aguda.</td></tr><tr><td>Metanol (CH3OH)</td><td>Fluka</td><td>65543</td><td>Toxicidade aguda. Sensibilização respiratória. Carcinogenicidade. Inflamável.</td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil) aminometano, base TRIS (C4H11NO3 )</td><td>AppliChem</td><td>A1379</td><td>Irritação da pele e dos olhos.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada Tris (TBS), comprimido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5030</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado (Na2HPO4 x 2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.0658</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrogenofosfato de sódio monohidratado (NaH2PO4 x 1H2O) </td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS) </td><td>Cambrex BioScience</td><td>DE-14-802F</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lavagem de citomação DAKO 10x </td><td>DAKO</td><td>S3006</td><td>Deve ser armazenado a 2-8 &graus; C para inibir o crescimento bacteriano. Evite espuma.</td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida; DMF (C3H7NO)</td><td>Fluka</td><td>40250</td><td>Inflamável. Toxicidade aguda.</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro 24 x 36 mm </td><td>Menzel-Gl&#228; ser</td><td>BB024036A1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico, conc. (HCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td>Corrosivo, irritante, permeador. Sensibilizador pulmonar (como névoa ácida). Tóxico.</td></tr><tr><td>Solução de ácido clorídrico volumétrica, HCl 2 M (2 N)</td><td>Fluka</td><td>71826</td><td>Corrosivo, irritante, permeador. Sensibilizador pulmonar (como névoa ácida). Tóxico.</td></tr><tr><td>Nitrito de sódio, ReagentPlus, &#8805; 99,0% (NaNO2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2252</td><td>Oxidante. Tóxico. Perigoso para o meio ambiente.</td></tr><tr><td>Sal dissódico do ácido etilenodiaminotrilotetracético di-hidratado (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.08454</td><td>As exposições orais podem causar efeitos reprodutivos e de desenvolvimento.</td></tr><tr><td colspan="4"> Equipment</td></tr><tr><td>Tissue-TekV.I.P Processador de infiltração a vácuo</td><td>Sakura</td><td>5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz</td><td></td></tr><tr><td>Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome </td><td>Instrumentos</td><td></td><td></td>Hacker</tr><tr><td>Vaporizador de alimentos domésticos </td><td>Braun</td><td>MultiGourmet FS 20</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz </td><td>Leica Polyvar 2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico rat linfonodo tissue secções

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

A imuno-histoquímica (IHQ) fornece a visualização de proteínas altamente específico, confiável e atraente. execução correcta e a interpretação de um rotulagem multicolor baseado no IHC é difícil, especialmente quando utilizado para avaliar as inter-relações entre proteínas alvo no tecido com um elevado teor de gordura, tais como o sistema nervoso central (SNC). Nosso protocolo representa um aperfeiçoamento da técnica de imunomarcação padrão particularmente adaptado para a detecção de ambas as proteínas estruturais e solúveis no rato SNC e nódulos linfáticos periféricos (LN) por neuroinflamaï¿½o afectadas. No entanto, com ou sem modificações adicionais, o nosso protocolo poderia provavelmente ser utilizados para a detecção de outros alvos de proteína relacionados, mesmo noutros órgãos e espécies que aqui apresentados.

imunomarcações duplos (co-colorações) foram realizados em fixado em formol e rato parafinado do SNC e LN seções. 3-5 uM fatias de tecido de espessura foram cortadas usando um micrótomo trenó, montado posteriormente em lâminas de vidro pré-revestida com adesivo e tratou-se como anteriormente descrito 10,11,12. Resumidamente, após deparaffinizing, re-hidratação do tecido e inactivação da peroxidase endógena, as secções foram submetidas ao processo de recuperação de antigénio, se...

Apresentamos aqui um protocolo otimizado e detalhado para imunocoloração dupla em seções de tecido do sistema nervoso central (SNC) e linfonodo periférico (LN) de rato fixado em formalina e embebido em parafina.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

O objetivo geral deste procedimento é direcionar-se a uma proteína específica no tecido de rato. Isso é realizado primeiramente isolando, fixando e embutindo o tecido em parafina, seguido pelo corte do tecido e montagem em lâminas. O segundo passo consiste em desparafinizar e reidratar as seções de tecido embutidas em parafina e, em seguida, bloquear a peroxidase endógena.Em seguida, os epítopos são expostos por meio da recuperação de antígeno. Posteriormente, realiza-se o bloqueio para reduzir a ligação inespecífica antes da introdução dos anticorpos. O passo final consiste em detectar o epítopo específico por imunomarcação com anticorpos primários e secundários, e desenvolver o sinal proveniente do anticorpo secundário marcado.No final, o sinal é visualizado utilizando microscopia de luz para mostrar o padrão de localização da proteína nas seções de tecido. Embora este método possa fornecer informações sobre os padrões de localização e expressão proteica no sistema nervoso central de ratos e nos linfonodos periféricos, ele também pode ser aplicado a outros órgãos e espécies. Para demonstrar o procedimento, será utilizado um técnico.Seu nome é Katalin Benedek, da instalação central do centro de microbiologia, tumor e biologia celular do Karolinska Institutet. Para iniciar a preparação do tecido, imerja o cérebro, medula espinhal e tecido do linfonodo periférico dissecados em paraformaldeído a quatro por cento e coloque a quatro graus Celsius por 24 horas. Após a fixação dos tecidos, transfira-os para P-B-S e armazene a quatro graus Celsius até o processamento posterior.Para iniciar o processamento do tecido, use uma lâmina de barbear para cortar o tecido em porções de aproximadamente cinco milímetros. Em seguida, inicie o processo de endurecimento do tecido com um processador de infiltração a vácuo. O procedimento padrão baseia-se na imersão em concentrações crescentes de etanol, seguido por xilol e, finalmente, parafina.Em seguida, coloque o tecido em um molde. Despeje a parafina líquida ao redor da amostra para formar um bloco de parafina e armazene-o à temperatura ambiente. Antes do corte do tecido, resfrie o bloco de parafina durante a noite na placa fria ou na geladeira.Após o bloco de parafina ter sido resfriado, coloque o bloco no suporte fixo de um micrótomo de deslizamento, que pode se mover para frente e para trás sobre uma lâmina. Em seguida, ajuste o bloco e a lâmina do micrótomo ao ângulo ideal, que depende da geometria da lâmina e da velocidade e técnica de corte. Corte três secções transversais de cinco mícrons de espessura a partir do bloco de parafina.Em seguida, transfira as seções cortadas para um recipiente com água e monte as seções a partir da água em uma lâmina de vidro adesiva pré-revestida comercial. Depois, pressione cuidadosamente a seção montada contra uma toalha de papel para remover a água residual e possíveis bolhas de ar. Seque as lâminas montadas por algumas horas em uma estufa ajustada entre 50 e 60 graus Celsius.Uma vez que as lâminas estejam secas, mergulhe-as duas vezes em xilol, por 15 a 20 minutos cada vez. Em seguida, lave cada lâmina em etanol a 99 por cento. Para bloquear a atividade de peroxidase endógena, incube as seções por 30 minutos em uma solução de metanol contendo 0,25 por cento de peróxido de hidrogênio.Em seguida, prossiga com a reidratação dos cortes teciduais lavando com soluções de etanol contendo teor crescente de água. Realize o passo final de reidratação em água destilada. Certifique-se de manter os cortes úmidos até que as lamínulas sejam montadas.Para recuperar o antígeno, aqueça os lâminas com um vaporizador doméstico e tampão EDTA em pH 8,5 durante 60 minutos. Em seguida, deixe os lâminas esfriarem à temperatura ambiente por aproximadamente uma hora. Quando os lâminas estiverem frios, lave cada lâmina de três a cinco vezes em solução salina tamponada com Tris, ou T-B-S.Em seguida, incubar as seções de tecido à temperatura ambiente por 30 minutos em uma solução bloqueadora contendo 10 por cento de soro bovino fetal e 90 por cento de tampão de lavagem para bloquear quaisquer reações de fundo não específicas. Após o bloqueio das seções de tecido, diluir a quantidade necessária de anticorpos primários na solução bloqueadora e incubar as lâminas nesta solução de anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lavar as lâminas de três a cinco vezes com tampão T-B-S.Em seguida, incubar as lâminas com anticorpos secundários diluídos na solução bloqueadora por uma hora à temperatura ambiente. Posteriormente, enxaguar novamente as lâminas de três a cinco vezes com tampão T-B-S. Então, incubar as lâminas com o complexo avidina peroxidase do rábano picante, diluído de um para 100 na solução bloqueadora, por uma hora à temperatura ambiente.Após a conclusão da incubação de uma hora, enxágue as lâminas de três a cinco vezes com tampão T-B-S. Depois de preparar a solução de azul rápido conforme descrito no protocolo textual, agite levemente o recipiente e filtre a mistura obtida. Despeje a solução sobre as lâminas na cubeta de vidro.Inicie a incubação a 37 graus Celsius e observe o processo de desenvolvimento sob o microscópio óptico a cada 15 a 30 minutos. Após a conclusão da incubação, lave as lâminas de três a cinco vezes com tampão T-B-S e, posteriormente, transfira as lâminas para tampão P-B-S. Para preparar a solução reveladora de peróxido de D-A-B, dilua primeiro um mililitro de uma solução estoque de D-A-B em 49 mililitros de P-B-S.Adicione 16,5 microlitros de peróxido de hidrogênio e, em seguida, filtre a solução. Despeje a solução sobre as lâminas e certifique-se de controlar o processo de revelação sob o microscópio óptico para evitar um fundo elevado que possa mascarar o sinal específico. Em seguida, enxágue as lâminas de três a cinco vezes com P-B-S, seguido por uma lavagem final com água destilada ou água da torneira.Monte as lâminas com lamínulas diretamente na água, utilizando meio de montagem aquoso. Evite a formação de bolhas de ar entre a lamínula e a lâmina. Após o montagem dos cortes, incube as lâminas durante a noite a quatro graus Celsius para permitir que o meio de montagem seque completamente.Armazene as lâminas secas à temperatura ambiente. A dupla coloração de seções de tecido de linfonodo periférico isoladas de ratos no sétimo dia após imunização revelou que os linfócitos T CD8 positivos não secretaram a quimiocina C-C-L 11. Alternativamente, C-C-L 11 foi encontrada co-localizada com E-D um, um marcador para proteína lisossômica em macrófagos ativados.A dupla marcação I-H-C da medula espinhal de uma rata identificou a produção de C-C-L 11 nos pericários neuronais, dendritos e axônios, mas não em macrófagos positivos para I-B-A 1 e células de micróglia residentes no cérebro. Além disso, a maioria dos macrófagos positivos para E-D 1 e células de micróglia residentes no cérebro também não foi encontrada positiva para C-C-L 11. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um direcionamento imunohistoquímico específico e confiável da proteína diretamente em cortes de tecido.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra a coloração imuno-histoquímica de fibras colinérgicas no núcleo basal da região de Meynert de seções cerebrais de camundongos. As seções são bloqueadas e tratadas com anticorpos primários contra colina acetiltransferase, seguidos por anticorpos secundários biotinilados. São adicionados complexos avidina-biotina-peroxidase, que se ligam a anticorpos secundários, seguidos pelo substrato cromogênico. As seções são então desidratadas e montadas antes de serem visualizadas ao...

Coloração imuno-histoquímica de fibras nervosas no núcleo basal de Meyner do cérebro de camundongo

Fonte: Evilsizor, M. N., et. al., Primer para imuno-histoquímica em tecido cerebral de rato criosseccionado: exemplo de coloração para microglia e neurônios. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra um procedimento de coloração imuno-histoquímica passo a passo em tecido cerebral de rato criosseccionado para visualizar o arranjo espacial da microglia e dos neurônios.

Coloração imuno-histoquímica de criossecções de tecido coronal de rato para microglia e neurônios

Este protocolo de nível introdutório descreve os reagentes, equipamentos e técnicas necessárias para completar a coloração imuno-histoquímica de cérebros de roedores, usando marcadores para microglia e elementos neuronais como exemplo.

Primer para imunohistoquímica em tecido criosseccionada cérebro de um rato: Exemplo de coloração para Microglia e Neurônios

Aqui, descrevemos um método simples e barato que permite a quantificação de células tumorais adesivos para genimosgenas de nódulos linfáticos (LN). As células tumorais aderentes de LN são prontamente identificadas pela microscopia leve e confirmadas por um método baseado em fluorescência, dando um índice de adesão que revela a afinidade de ligação celular tumoral ao parenchyma lN.

Quantificação da adesão celular tumoral em crioseções de nó linfático

Os principais gânglios pélvicos contêm neurônios parassimpáticos e simpáticos que inervam os órgãos pélvicos. Aqui descrevemos um método de dissecção e fornecemos esquemas para identificação desses gânglios e seus nervos associados. Esses métodos podem ser aplicados à manipulação experimental desses gânglios in vivo ou à remoção pós-morte para estudos posteriores.

Dissecção de Gânglios Autônomos Pélvicos e Nervos Associados em Ratos Masculinos e Femininos

Este manuscrito apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental ativa (EAE) em camundongos. Um método de isolamento e caracterização dos linfócitos infiltrados no sistema nervoso central (SNC) também é apresentado para mostrar como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune cns.

Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Este artigo apresenta dois protocolos otimizados para examinar células imunes residentes e derivadas periféricas dentro do sistema nervoso central, incluindo cérebro, medula espinhal e meninges. Cada um desses protocolos ajuda a determinar a função e a composição das células que ocupam esses compartimentos em condições de estado estacionário e inflamatório.

Isolando Tecidos do Sistema Nervoso Central e Meninges Associadas para Análise a Jusante de Células Imunes

Aqui, descrevemos um método preciso para coletar linfócitos toráclicos e observar a migração de linfócitos gut-tropic nos patches de Rato Peyer por 3 horas usando fotografia de lapso de tempo. Esta técnica pode esclarecer como a dinâmica dos linfócitos são afetadas em condições inflamatórias.

Observação microscópica da Dinâmica do Linfócito em Patches de Rat Peyer

A técnica de flutuação livre permite que os pesquisadores realizem colorações histológicas, incluindo imuno-histoquímica em seções de tecido fixas para visualizar estruturas biológicas, tipo de célula e expressão e localização de proteínas. Esta é uma técnica histoquímica eficiente e confiável que pode ser útil para investigar uma infinidade de tecidos, como cérebro, coração e fígado.

Coloração histológica usando seções de tecido flutuantes livres

Um método conveniente de perfusão alimentado pela gravidade para análise histológica do sistema nervoso central do rato é apresentado. A detecção imunofluorescente de α-sinucleína fosfoilada é demonstrada em um modelo de camundongo da doença de Parkinson. Este trabalho também descreve de forma abrangente as etapas de perfusão transcárdia, dissecção, congelamento/incorporação de tecidos e etapas de secção congelada.

Um método de perfusão transcárvia alimentado pela gravidade para análise histológica do sistema nervoso central do rato

Este protocolo descreve uma técnica de imunofluorescência multicolor para avaliação do modelo de rinite alérgica em ratos.

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Aprenda a realizar imunomarcação dupla em tecidos de sistema nervoso central e linfonodos periféricos de ratos. Este protocolo otimizado permite visualizar padrões de localização proteica por microscopia de luz.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

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