Name: A Caenorhabditis elegans Sistema Modelo para Estudo Amylopathy (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda a construir vermes transgênicos de C. elegans expressando peptídeo amiloide beta com GFP em neurônios ASER. Avalie toxicidade em ensaios de quimiotaxia e culturas primárias para estudar neurodegeneração.

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<p class="jove_content"&gt; Agradecemos ao Dr. Shuang Liu para a leitura crítica do manuscrito. A construção PCL12 foi um presente formulário Dr. Christopher D. ligação. Este trabalho foi apoiado por dois subsídios National Science Foundation (0842708 e 1026958) e uma subvenção AHA (09GRNT2250529) para FS.</p

1. Construção de Worms transgênicos <ol><li> Transformação. <ol><li> Prepare pastilhas de injeção. Colocar uma gota de água quente, de agarose 2% dissolvido em água, sobre uma lamela de vidro. Colocar rapidamente de uma segunda lamela sobre a queda e leve toque nele. Após a agarose é solidificado, lamelas deslizantes afastados, e cozer a lamela direccional num forno de vácuo a 80 ° CO / N. </li><li> Puxe pipetas. Nós usamos um Sutter P-97 extrator para puxar 1/0.5 mm OD / ID borosilicato capilares com filamento. As pipetas são fundidas com a ponta fechada, que está quebrado aberto numa fase posterior. </li><li> Prepare mix de injeção. Adicione a mistura de injecção contendo o ADN de interesse (20 ng / mL por construto) mais DNA de plasmídeo vazio a uma concentração final de 150 ng / mL. Centrifugar a mistura de injecção para remover qualquer contaminação. Este passo é essencial porque os contaminantes reduzir a eficiência da transformação. Transferir o topo 5 ul (resíduos e outros contaminantes em recolher o fundo) para um tubo fresco para be utilizado na injecção. </li><li> Carregar mix injeção por capilaridade. A parte inferior da pipeta está imerso na mistura de injecção. Normalmente 0,5 mL são suficientes para injetar 100 vermes. </li><li> Carregar pipeta de injecção. Insira a pipeta para o titular do micromanipulador e quebrá-lo aberto, esfregando a ponta contra a borda de uma lamínula montado em uma lâmina de vidro ou alternativamente contra detritos no bloco de agarose. Este é um passo crucial como dicas muito grande dano a minhoca e também pequenas dicas são facilmente obstruídos. A qualidade da ponta quebrada pode ser julgada pela forma e, sobretudo, pela taxa de fluxo. O caudal pode ser avaliada através do tamanho das bolhas de fluir a partir da ponta aberta imerso numa gota de óleo 700 halocarboneto, em resposta a uma pressão de injecção. </li><li> Transferir vermes pad injeção. Coloque uma gota de óleo de 700 halocarbono sobre uma almofada de injeção e transferir vários (1 ou 2 para iniciantes) vermes para o óleo. Use um verme escolher para empurrar os vermes para baixo sobre o bloco até oy aderir à agarose. Worms deve ser orientada em linhas com os lados ventral na mesma direção. Evite tocar a cabeça do verme. Se, depois de várias tentativas os vermes não aderem à almofada, substitua por uma nova almofada de agarose ou aumentar a espessura e / ou a concentração. </li><li> Insira a pipeta no worm. Ao mover o palco, posicionar o verme sob a pipeta. Posicione a pipeta no núcleo central da gônada porque seu citoplasma é compartilhada por muitos núcleos de células germinativas. Isto aumenta a probabilidade de entregar o ADN injectado para muitos progenitura. A pipeta deve ficar quase paralelo ao worm (~ 15 ° -25 °). Empurrar verticalmente a ponta da pipeta para baixo do corpo do verme até que a pele está deprimido. Em seguida, toque suavemente no manipulador para induzir a inserção da ponta. Para melhores resultados injetar tanto gônadas. </li><li> Injetar a solução de DNA. Aplique pressão para a pipeta até as ondas gônadas. Interromper o fluxo e puxar o verme para fora da pipeta. Teste da agulha para o fluxo e movapara o outro verme e etapas de injeção de repetição. </li><li> Recuperar os vermes: Adicionar uma gota (~ 10 ml) de tampão de recuperação sobre os vermes e incubar até que os vermes começam a natação. Adicionar um volume igual de M9, espere até que os vermes retomar a natação e repetir várias vezes até que a solução é mais M9. Individualmente transferir vermes para placas semeadas. </li></ol></li><li> Integração. <ol><li> Coloque 40 saudável, bem alimentado, L4 vermes em um prato de doce </li><li> Irradiar com γ-ray com 4.000 rads por 40 min. Transferir vermes irradiados (P0), em OP50 placas semeadas frescas (4 vermes / placa). Os vermes podem, alternativamente, ser irradiado com uma dose de 300 J / m 2 UVs. </li><li> Transferir 10-20 transformantes de F1 a partir de cada uma das placas para placas individuais, rotular as placas com o correspondente origem P0. </li><li> Destacar 2-4 transformantes F2 para cada F1 para placas separadas. Verifique a progenitura F3 para a transmissão de 100% do marcador de transformação. Normalmente, 1-3% da descendência de um wil verme irradiadoTenho um evento de integração. </li><li> As existências de três ou mais linhas transformantes independentes. </li></ol></li></ol> 2. Os testes comportamentais <ol><li> Age-sincronização. <ol><li> Crescer vermes em padrão 10 centímetros placas NGM + OP50 E. coli até uma grande população de adultos grávidos é alcançado (3-5 dias). </li><li> Recolher os vermes em tubos Falcon de 50 ml de suspensão por eles em 1 ml de tampão M9. </li><li> Adicionam-se 5 ml de tampão M9 e centrifugar a 450 xg durante 3 min. Elimine o sobrenadante. Repita 3-4x. </li><li> No final da última centrifugação, remove-se o sobrenadante e adicionar 10 volumes de solução de hipoclorito de base (NaOH 0,5 M, 1% de hipoclorito recentemente misturado) para os vermes peletizadas. Incubar à temperatura ambiente durante ~ 10 min. A reacção de lise pode ser monitorizada por colocar uma gota da reacção de lise sobre uma lamela e examinando os vermes ao microscópio. Quando cerca de 80% dos vermes estão quebrados a reação deve ser interrompido. </li><li> Parar a reacção de lise por adding o mesmo volume de tampão de ovo esterilizada. </li><li> Recolher os ovos (e carcaças) por centrifugação a 450 xg durante 5 min. </li><li> Lavar os ovos com tampão de ovo esterilizada 2-3x. </li><li> Incubar a ovos de O / N em tampão M9 e sementes los em placas NGM padrão. </li></ol></li><li> Ensaio de quimiotaxia. <ol><li> Prepare vários pedaços de ágar cerca 0.5x0.5x0.5 cm. Nós depositar o agar em uma placa de 10 cm e corte os pedaços de ágar a partir daí. </li><li> Embeber o pedaço de agar de uma solução contendo o atraente desejado (em concentrações saturantes, quase saturação) durante 2 horas. Chamarizes típicos são lisina (0,5 M), biotina (0,2 M). </li><li> Depositar um pedaço de agar de uma placa de 10 cm de teste em que a localização de um local de teste e um ponto de controlo foram marcadas (Figura 1A). Permitir o equilíbrio e a formação de um gradiente de O / N (Figura 1B). Prepare 5 placas de uma única experiência. </li><li> Antes do experimento adicione 10 ml de 20 mM NaN 3 (Anesthetic) para cada mancha. </li><li> Colocar 20 vermes idade sincronizados no centro da placa. Colocar a placa na incubadora a 20 ° C. </li><li> Após 1 h, a contagem dos animais sobre os pontos de teste / controlo e calcular o índice de quimiotaxia, (IC), como a seguir: <img alt="Equação 1" fo:content-width=".863in" fo:src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1.jpg" /> em que N, N e N teste Cnt., indicam o número total de animais, o número de animais no local de teste e o número de animais no ponto de controlo. </li></ol></li></ol> 3. Principal Cultura de Células Embrionárias <ol><li> Lyse vermes como descrito na idade de sincronização. </li><li> Parar a reacção de lise pela adição de igual volume de tampão de ovo esterilizada e centrifugar a 450 xg durante 5 min. Gentilmente elimine o sobrenadante com cuidado para não perder os ovos peletizadas. Repita 2-3x ou até sobrenadante é clara. </li><li> Ressuspender ovos peletizada (e carcaças) Em 2 ml de tampão de ovo esterilizada e juntar 2 ml de solução estéril de 60% de sacarose em tampão de ovo. Misture esta solução até que os ovos estejam completamente ressuspenso (como eles tendem a formar aglomerados sob centrifugação) com a mão ou em vortex. </li><li> Centrifugar a 450 xg durante 15 min. </li><li> Transferir cuidadosamente o sobrenadante (contendo os ovos) para um tubo estéril. Descartar pelete que contém as carcaças e outros subprodutos da lise. </li><li> Remover sacarose residual por ressuspensão em tampão de os ovos dos ovos e centrifugação a 450 xg durante 5 min. Gentilmente coletar e descartar o sobrenadante. 3x. </li><li> Sob uma cobertura laminar ressuspender ovos peletizadas em tampão de ovo estéril contendo 1 U / ml de quitinase a RT para digerir as cascas dos ovos. Depois de 30 min começa a controlar a reacção (sob um microscópio invertido de cultura de células). Cada lote de quitinase tem uma actividade ligeiramente diferente. Tipicamente, a digestão é completada em 1 hora. </li><li> Quando cerca de 70-80% cascas de ovos são digeridos por chitinase add CM-15 (G-15 cultura de células medium contendo 10% de soro fetal bovino, 50 U / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina). Dissociar células usando uma seringa com uma calibre 27. Filtra-se a suspensão de células com 5,0 mM de filtro para remover os embriões intactos, aglomerados de células e larvas. </li><li> Pellet a suspensão de células dissociadas por centrifugação a 450 xg durante 15 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em CM-15 de meio de cultura celular. </li><li> Células dissociadas da placa de vidro sobre a cobertura desliza previamente revestida com lectina de amendoim (0,1 mg / ml) dissolvido em água Nota:. Células devem aderir ao substrato, a fim de se diferenciar. </li><li> As células podem ser mantidas à temperatura ambiente (16-20 ° C) ao ar durante mais de 2 semanas. </li></ol>

<ol><li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li>
<li>Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lewy body pathology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).</li>
<li>Greenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+myositis%3A+review+of+recent+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurology+and+Neuroscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Inclusion body myositis: review of recent literature.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).</li>
<li>Revesz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+and+familial+cerebral+amyloid+angiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies.</a> Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).</li>
<li>Hartmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sites+of+intracellular+production+for+Alzheimer%27s+disease+A+beta40%2F42+amyloid+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides.</a> Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).</li>
<li>Ohnishi, S., Takano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibrils+from+the+viewpoint+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding.</a> Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).</li>
<li>C. elegans II. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Monograph%22">Cold Spring Harbor Monograph</a>. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222(1997).</li>
<li>Cotella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+role+of+k%2B+channel+oxidation+in+Mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).</li>
<li>Cai, S. Q., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+a+potassium+channel+causes+progressive+sensory+function+loss+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).</li>
<li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons%3A+a+new+family+of+chemosensory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li>
<li>Caserta, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q-VD-OPh%2C+a+broad+spectrum+caspase+inhibitor+with+potent+antiapoptotic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis+%3A+an+international+journal+on+programmed+cell+death%22%5BJournal%5D)">Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).</li>
<li>Christensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui nós descrevemos uma abordagem combinada, para estudar aspectos celulares e moleculares da amylopathies usando C. elegans. As vantagens dessa abordagem incluem: 1.) De baixo custo C.elegans é mantido no prato normal de Petri semeadas com bactérias, à temperatura ambiente. 2) genética poderosas. Os animais transgénicos podem ser obtidos em alguns meses, e uma grande variedade de sequências de promotor está disponível para conduzir a expressão do gene desejado em neurónios específicos. 3) bem caracte...

Beta amilóide (Ap) é um péptido de 36-43 aminoácidos que é formada após a clivagem sequencial da proteína precursora de amilóide (APP) por β e γ secretases 1. A secretase γ processa a extremidade C-terminal do péptido Aíi e é responsável pelos seus comprimentos variáveis ​​5. As formas mais comuns de Ap são Ap 40 e Ap 42, sendo o último mais comum associado a condições patológicas tais como a AD 5. Em altas concentrações ABeta forma β-folhas que agregam para formar fibrilas amilóides 6. Depósitos de fibrilas são o principal componente das placas senis que cercam os neurônios. Ambas as placas e difusíveis, oligómeros de Ap não-placa, são pensados ​​para constituir as formas de Ap patogénicos subjacentes. Estudo de laboratório de amylopathies neuronais é complicada pelo facto de estas condições o progresso ao longo do tempo. Portanto, é important para o desenvolvimento de animais geneticamente tratável modelos complementares para camundongos com vida curta. Estes modelos podem ser utilizados para elucidar os aspectos específicos de amylopathies-tipicamente celular e molecular, e em virtude da sua simplicidade, para ajudar a captar a essência do problema. O verme Caenorhabditis elegans quedas está nesta categoria. Ele tem uma vida curta, ~ 20 dias e, além disso processos celulares básicos, incluindo a regulação da expressão do gene, o tráfico de proteína, a conectividade neuronal, sinaptogênese, sinalização celular e morte são semelhantes aos dos mamíferos 7. As características únicas do worm incluem genética poderosos ea falta de um sistema de vasos, o que permite estudar dano neuronal independentemente de dano vascular. Por outro lado, a falta de um cérebro limita a utilização de C. elegans para estudar vários aspectos da neurodegeneração. Além disso, a reprodução e a identificação das distribuições anatómicas de lesões não pode ser executada neste organismo. Outro limiteções incluem a dificuldade para avaliar tanto as diferenças nos perfis de expressão gênica e comprometimento do comportamento complexo e função de memória. Aqui descrevemos métodos para gerar C. modelos elegans de amylopathies.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. NGM</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>3 g</td></tr><tr><td>Ágar bacteriológico</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td>17 g</td></tr><tr><td>Bactopeptona</td><td>AMRESCO</td><td>J636</td><td>2,5 g</td></tr><tr><td>Água</td><td></td><td></td> Destilada <td>Leve a 975 ml</td></tr><tr><td colspan="4">Esterilizado em autoclavagem, adicione os seguintes itens e misture bem</td></tr><tr><td>Sulfato</td> <td>de magnésioSigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 ml de estoque 1 M</td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de cálcio Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>1 ml de estoque 1</td></tr><tr><td>M Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3045</td><td>1 ml de estoque de 5 mg / ml (em etanol)</td></tr> <tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de fosfato <td>de potássio 25 ml de estoque 1M</td></tr> <tr>< td colspan = "4 ">< forte>2. Tampão fosfato de potássio</forte></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>108,3 g</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>35,6 g</td></tr><tr><td>Água</td><td></td><td></td> destilada <td>Leve a 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Esterilizado em autoclavagem</td></tr><tr><td colspan="4">3. Tampão M9</forte></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>3 g</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td>6 g</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 ml de caldo 1 M Água</td></tr><tr><td>destilada</td><td></td><td></td><td>Leve para 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Esterilizado por autoclavagem</td></tr><tr><td colspan="4"><forte>4. Tampão de ovo (pH 7,3, 340 mOsm)</forte></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>118 mM</td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de Potássio Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>48 mM</td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td>25 mM</td></tr><tr>Água <td></td><td></td><td>destilada</td><td>Traga para 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Esterilizado por autoclavagem</td></tr><tr><td colspan="4"><forte>5. CM-15</td></tr><tr><td>L-15 meio de cultura</td><td>Gibco</td><td>11415</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 unidades/ml</td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 g/ml<</td></tr><tr>td colspan="4">Ajuste para 340 mOsm com sacarose, depois filtre estéril em frascos autoclavados e armazene a 4 &graus; C</td></tr><tr><td colspan="4">6. Outros Reagentes</td></tr><tr><td>Halocarbon 700 óleo</td><td>Halocarbon Products</td><td>9002-83-9</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu; m Filtro de seringa Acrodisc</td><td>PALL Co.</td><td>4199</td><td></td></tr><tr><td>Quitinase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6137-5UN</td><td></td></tr><tr><td>Lectina (amendoim)</td> <td>Hidróxido de sódio Sigma-Aldrich</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>Lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Solução</td> <td>de hipoclorito de sódioSigma-Aldrich</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>azida sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

a<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; sistema modelo para estudo amylopathy

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy é um termo que descreve a síntese e a acumulação anormal de beta-amilóide (Ap) em tecidos com o tempo. Ab é uma característica da doença de Alzheimer (AD) e é encontrado na demência com corpos de Lewy, a inclusão miosite corpo e angiopatia amilóide cerebral 1-4. Amylopathies desenvolver progressivamente com o tempo. Por esta razão, os organismos simples com tempos de vida curtos podem ajudar a elucidar os aspectos moleculares destas condições. Aqui, descrevemos os protocolos experimentais para estudar a neurodegeneração Aâ mediada através do verme Caenorhabditis elegans. Assim, construímos vermes transgênicos, injetando DNA humano codificação ABeta 42 para as gônadas de hermafroditas sincicial adultos. Linhas de transformantes são estabilizados por uma integração induzida por mutagénese. Nemátodes são sincronizados idade recolhendo e semeando os seus ovos. A função de neurónios que expressam Ap 42 é testada em ensaios comportamentais oportunos (ensaio de quimiotaxias). Culturas neuronais primárias obtidas a partir de embriões são usados ​​para complementar os dados de comportamento e para testar os efeitos neuroprotectores dos compostos anti-apoptóticos.

Com os nossos protocolos nós estudamos os efeitos do humano ABeta 42 oligômero na função neuronal 8. Um fragmento de codificação ABeta humano 42 eo sinal peptídeo sequência codificante artificial de Fogo vetor pPD50.52 foi amplificado a partir construção PCL12 9 usando primers que introduziram um Sma uma restrição local endonuclease nas extremidades. O fragmento foi então inserido em uma construção contendo um flp-6 sequência do promotor 2481 pb no vector pPD95.75 fog...

Nós descrevemos métodos para estudar aspectos da amylopathies do verme<em&gt; C. elegans</em&gt;. Mostramos como construir vermes expressando ABeta humano<sub&gt; 42</sub&gt; Em neurônios e como testar sua função em ensaios comportamentais. Temos ainda mostram como obter culturas neuronais primárias que podem ser utilizadas para testes farmacológicos.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar os efeitos da toxicidade do peptídeo beta-amilóide na função e sobrevivência neuronais. Isso é realizado primeiramente pela construção de vermes transgênicos de C. elegans que expressam um peptídeo beta-amilóide com um marcador GFP em neurônios sensoriais SE. Em seguida, a consequência comportamental da expressão do beta-amilóide em neurônios SE é avaliada por meio de um ensaio de quimiotaxia.O terceiro passo é obter culturas primárias de neurônios a SE e, em seguida, tratar os neurônios cultivados com agentes farmacológicos, como Q-V-D-O-P-H, para suprimir o efeito tóxico do beta amiloide. Em última análise, os resultados podem demonstrar os efeitos da toxicidade do beta amiloide na função e sobrevivência de neurônios a SE por meio de ensaios comportamentais e farmacológicos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre neurodegeneração, como elucidar mecanismos celulares e moleculares específicos.Efeitos neurotóxicos subjacentes dos oligômeros de beta amiloide. O Dr. Zing Dwan, pós-doutorando do meu laboratório, demonstrará os procedimentos. Para a transformação, são necessários discos de injeção de agarose a 2%. Coloque uma gota de agarose quente dissolvida em água sobre uma lamínula de vidro e, rapidamente, posicione uma segunda lamínula sobre a gota, batendo levemente.Ao preparar a mistura de injeção, certifique-se de centrifugar e transferir os cinco microlitros superiores, livres de detritos e outros contaminantes, para um tubo novo para a carga de injeção. Coloque a mistura de injeção e o plasmídeo vazio em uma pipeta de injeção por ação capilar. Meio microlitro geralmente é suficiente para injetar 100 vermes. Para alargar a abertura da pipeta de injeção, esfregue sua ponta contra a borda de uma lamínula montada em uma lâmina de vidro com óleo de halo carbono 700. A qualidade da abertura é crítica.É avaliado pela forma da ponta e, mais importante, pela taxa de fluxo, determinada pelo fluxo e pelo tamanho das bolhas que se formam na ponta da pipeta em resposta à pressão de injeção. Agora, coloque uma gota de óleo de carbono oco 700 em uma almofada de injeção e transfira vários vermes para a almofada. Use um palito para vermes para empurrar os vermes contra a almofada até que aderem aos aros.Os vermes devem ser orientados em fileiras com seus lados ventrais alinhados. Evite tocar suas cabeças. Se, após várias tentativas, os vermes não aderirem ao suporte, experimente um suporte novo ou aumente a espessura do ágar ou a concentração do suporte.Agora insira a pipeta no verme. Primeiro, mova a platina para posicionar o verme sob a pipeta. Posicione a pipeta ao lado do núcleo central da gônada.Como seu citoplasma é compartilhado por muitos núcleos de células germinativas, isso aumenta a probabilidade de o DNA injetado ser transmitido à prole. A pipeta deve ficar quase paralela ao verme. Em terceiro lugar, mova a ponta verticalmente em direção ao corpo até que a pele seja pressionada.Por fim, toque suavemente no manipulador para induzir a inserção das pontas. Agora, injete a solução de DNA. Aplique pressão na pipeta até que o gônada inche.Em seguida, interrompa o fluxo e retire o verme da pipeta. Teste o fluxo da agulha e, então, injete os outros gônadas antes de passar para o próximo verme. Após as injeções, adicione cerca de 10 microlitros de tampão de recuperação aos vermes e aguarde até que comecem a nadar.Uma vez nadando, adicione um volume igual de tampão M nove. Quando os vermes retomarem a natação, continue adicionando M nove até que a solução seja predominantemente M nove. Agora, transfira cada verme para uma placa com suporte.Colete vermes GR em um mililitro de tampão M nine em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, utilizando o tampão M nine, lave os vermes por meio de centrifugações repetidas e substituição da solução até que o M nine fique claro após a lavagem. A seguir, adicione 10 volumes de solução básica de hipoclorito aos vermes.Incube os vermes em pelote à temperatura ambiente até que cerca de quatro quintos deles estejam rompidos, o que normalmente leva 10 minutos. Monitore a reação retirando alíquotas para visualização ao microscópio. Interrompa a reação adicionando um volume igual de tampão estéril para ovos.Em seguida, colete os ovos e as carcaças por centrifugação a 450 G durante cinco minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Adicione novamente um volume igual de tampão para ovos e centrifugue o tubo novamente a 450 G durante cinco minutos.Repita o procedimento até que o tampão fique límpido. Incube os ovos durante a noite em tampão M nove e, no dia seguinte, semeie-os em placas NGM padrão. Prepare vários cubos de ágar, com aproximadamente meio centímetro de lado.Deixe os pedaços de ágar embebidos em uma solução contendo o atrativo desejado por duas horas. Coloque um pedaço de ágar em uma placa de teste de 10 centímetros na qual as posições do ponto de teste e do ponto controle tenham sido marcadas. Prepare cinco placas desse tipo por experimento.Deixe as placas formarem um gradiente químico mantendo-as durante a noite a 20 graus Celsius no dia seguinte. Antes do experimento, adicione 10 microlitros de azida de sódio 20 milimolar a cada ponto nas placas. Isso atua como um anestésico.Inicie o experimento colocando 20 vermes sincronizados por idade no centro da placa e, em seguida, coloque a placa em um incubador a 20 °C por uma hora. Após uma hora, conte os animais nas áreas de teste em relação às áreas controle e calcule o índice CI. Após a lise de vermes gr e a limpeza dos ovos e cadáveres conforme descrito anteriormente, re-suspenda-os em dois mililitros de tampão estéril para ovos e adicione dois mililitros de sacarose estéril a 60% no tampão para ovos.Em seguida, misture o tubo manualmente ou em vórtex até que os ovos sejam completamente ressuspendidos. Centrifugue os ovos ressuspendidos a 450 vezes G durante 15 minutos. Em seguida, colete cuidadosamente o sobrenadante contendo os ovos e descarte o pellet para remover a sacarose residual, ressuspenda os ovos em tampão para ovos e centrifugue-os a 450 G durante cinco minutos.Colete e descarte suavemente o sobrenadante e, em seguida, repita o processo de limpeza três vezes na câmara de fluxo laminar. Use tampão estéril de ovo contendo uma unidade por mililitro de quitinase para ressuspender os ovos sedimentados. Deixe os ovos digerirem à temperatura ambiente por 30 minutos e, então, comece a monitorar a reação em um microscópio invertido para cultura celular.Quando 70 a 80% das cascas dos ovos forem digeridos, adicione cinco mililitros de meio de cultura L 15 completo ou CM 15. Para isolar as células, dissocie-as para que não formem agregados, fazendo-as passar algumas vezes por uma agulha de 27 graus. Em seguida, passe a solução por uma seringa com filtro de cinco mícrons.Centrifugue a suspensão celular dissociada a 450 G durante 15 minutos para obter o pellet. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em CM 15. Para garantir que as células estejam dissociadas, verifique a suspensão ao microscópio.Por fim, plaque as células dissociadas em lamínulas de vidro previamente revestidas. Com lectina de amendoim, as células podem ser mantidas à temperatura ambiente com ar normal por mais de duas semanas. Utilizando as técnicas de transformação descritas, um verme transgênico foi construído para expressar a Beta 42 humana nos neurônios SE, neurônios que detectam atrativos solúveis em água, como biotina, utilizando o ensaio de quimiotaxia.Vermes transgênicos com sete dias de idade foram testados. Os controles não tiveram dificuldade em encontrar a biotina. Em contraste, apenas alguns vermes expressando beta 42 conseguiram localizar o ponto do atrativo.O índice de quimiotaxia para biotina foi de 0,68 contra 0,12 para os vermes controle e experimentais, respectivamente, entre três e quatro dias. Também houve uma pequena, mas detectável, queda no índice. Um neurônio A SER cultivado em quatro dias ainda expressando GFP após nove dias de vida.No entanto, a fluorescência da GFP desapareceu e suspeitou-se de apoptose para testar essa teoria. Neurônios primários A SER foram preparados conforme descrito e suplementados com um inibidor de caspase de amplo espectro. Como esperado, o tratamento interrompeu a perda de fluorescência, confirmando que a expressão da A beta 42 humana desencadeia apoptose em neurônios A SER.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como construir os elegantes vermes transgênicos, estudá-los em ensaios comportamentais e como obter cultura primária a partir de Ambrose.

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