A Caenorhabditis elegans Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

O objetivo geral deste procedimento é avaliar os efeitos da toxicidade da beta-amilóide na função neuronal e na sobrevida. Isso é feito pela construção de vermes transgênicos C elegance expressando um peptídeo beta amilóide com um repórter GFP em neurônios sensoriais SE. Em seguida, a consequência comportamental da expressão de beta amilóide em neurônios SE é avaliada por um ensaio de quimiotaxia.

O terceiro passo é obter culturas primárias de neurônios SE e, em seguida, tratar os neurônios cultivados com agentes farmacológicos, como Q-V-D-O-P-H, para suprimir o efeito tóxico da beta-amilóide. Em última análise, os resultados podem mostrar os efeitos da toxicidade da beta-amilóide na função e sobrevivência de neurônios SE por meio de ensaios comportamentais e farmacológicos. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre neurodegeneração, como elucidar mecanismos celulares e moleculares específicos.

Efeitos neurotóxicos subjacentes dos oligômeros beta amilóides. Demonstrando os procedimentos estará o Dr. Zing Dwan, um pós-doutorado do meu laboratório Para a transformação, são necessárias almofadas de injeção de 2% agros. Coloque uma gota de aros quente dissolvido em água em uma lamínula de vidro e coloque rapidamente uma segunda lamínula na gota e bata levemente.

Ao fazer a mistura de injeção, certifique-se de centralizar o fut e transferir os cinco microlitros superiores, livres de detritos e outros contaminantes, para um tubo novo para carga de injeção, mistura de injeção e plasmídeo vazio em uma pipeta de injeção por ação capilar. Meio microlitro geralmente é suficiente para injetar 100 vermes para alargar a abertura na pipeta de injeção esfregar sua ponta contra a borda de uma lamínula montada em uma lâmina de vidro Óleo de carbono halo 700. A qualidade da abertura é crítica.

É julgado pelo formato da ponta e, o mais importante, pela vazão, avaliada pelo fluxo e pelo tamanho das bolhas que se formam na ponta da pipeta em resposta à pressão de injeção. Agora coloque uma gota de óleo carbono 700 sagrado em uma almofada de injeção e transfira vários vermes para a almofada. Use uma picareta de minhoca para empurrar as minhocas para baixo na almofada até que elas adiram ao aros.

Os vermes devem ser orientados em fileiras com seus lados ventrais alinhados. Evite tocar em suas cabeças. Se após várias tentativas os vermes não aderirem à almofada, tente uma nova almofada ou aumente a espessura ou concentração da almofada.

Agora insira a pipeta no verme. Primeiro, mova o stage para posicionar o sem-fim sob a pipeta em segundo lugar. Posicione a pipeta ao lado do núcleo central da gônada.

Como seu citoplasma é compartilhado por muitos núcleos de células germinativas, isso aumenta a probabilidade de o DNA injetado ser passado para a progênie. A pipeta deve ficar quase paralela ao verme. Terceiro, mova a ponta verticalmente em direção ao corpo até que a pele esteja deprimida.

Por fim, bata suavemente no manipulador para induzir a inserção das pontas. Agora injete a solução de DNA. Aplique pressão na pipeta até que a gônada inche.

Em seguida, pare o fluxo e puxe o verme para fora da pipeta. Teste o fluxo das agulhas e, em seguida, injete as outras gônadas antes de passar para o próximo verme. Após as injeções, adicione cerca de 10 microlitros de tampão de recuperação aos vermes e espere que eles comecem a nadar.

Depois de nadar, adicione um volume igual de M nove tampão. Quando os vermes retomarem a natação, continue adicionando M nove até que a solução seja principalmente M nove. Agora transfira cada verme para uma placa assentada.

Colete vermes GR em um mililitro de tampão M nove em um tubo de falcão de 50 mililitros. Em seguida, usando o tampão M nove, lave os vermes por centrifugação repetida e substituição da solução até que o M nove esteja claro após a lavagem. Em seguida, adicione 10 volumes de solução básica de hipoclorito aos piolhos.

Os vermes peletizados incubam os vermes em temperatura ambiente até que cerca de quatro quintos deles sejam quebrados, o que normalmente leva 10 minutos. Monitore a reação pegando alíquotas para ver com um microscópio. Pare a reação adicionando um volume igual de tampão de ovo estéril.

Em seguida, recolher os ovos e as carcaças por centrifugação a 450 g durante cinco minutos. Remova suavemente o sobrenadante. Adicionar novamente um volume igual de tampão de ovos e centrifugar novamente o tubo a 450 g durante cinco minutos.

Repita o procedimento até que o tampão esteja limpo. Agora incube os ovos durante a noite em tampão M nine e, no dia seguinte, semeie-os em placas NGM padrão. Prepare vários cubos de ágar, com cerca de meio centímetro de lado.

Mergulhe os pedaços de ágar em uma solução contendo o atrativo desejado por duas horas. Depositar um pedaço de ágar numa placa de ensaio de 10 centímetros na qual tenha sido marcada a localização do ponto de ensaio e de um ponto de controlo. Prepare cinco dessas placas por experimento.

Deixe as placas formarem um gradiente químico, deixando-as durante a noite a 20 graus Celsius no dia seguinte. Antes do experimento, adicione 10 microlitros de azida sódica 20 milimolar a cada ponto nas placas. Isso atua como um anestésico.

Comece o experimento colocando 20 minhocas sincronizadas com a idade no centro da placa e, em seguida, colocando a placa em uma incubadora de 20 graus Celsius por uma hora. Após uma hora, contar os animais no teste sobre os pontos de controle e calcular o índice IC. Depois de lisar os vermes gr e limpar os ovos e carcaças conforme descrito anteriormente, suspenda-os novamente em dois mililitros de tampão de ovo estéril e adicione dois mililitros de sacarose estéril a 60% no tampão de ovo.

Em seguida, misture o tubo manualmente ou por vórtice até que os ovos estejam completamente ressuspensos. Centrifugar os ovos ressuspensos a 450 vezes G durante 15 minutos. Em seguida, recolha cuidadosamente o sobrenadante cheio de ovos e descarte o palato para remover a sacarose residual, ressuspenda os ovos em tampão de ovo e centrifugue-os a 450 G por cinco minutos.

Recolha e elimine cuidadosamente o sobrenadante e repita o processo de limpeza três vezes no exaustor. Use tampão de ovo estéril contendo uma unidade por mililitro de quitinase para ressuspender os ovos peletizados. Deixe os ovos digerirem em temperatura ambiente por 30 minutos e, em seguida, comece a monitorar a reação em um microscópio de cultura de células invertido.

Quando 70 a 80% das cascas dos ovos forem digeridas, adicione cinco mililitros de meio de cultura L 15 completo ou CM 15. Para isolar as células, dissocie-as para que não formem aglomerados, fluindo-as através de uma agulha de calibre 27 algumas vezes. Agora passe a solução por uma seringa com um filtro de cinco mícrons.

Pulverizar a suspensão de células dissociadas por centrifugação a 450 g durante 15 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda as células peletizadas em CM 15. Para ter certeza de que as células estão dissociadas, verifique a suspensão ao microscópio.

Por fim, coloque as células dissociadas em lamínulas de vidro previamente revestidas. Com a lectina do amendoim, as células podem ser mantidas em temperatura ambiente com ar normal por mais de duas semanas. Usando as técnicas de transformação descritas, um verme transgênico foi construído para expressar um Beta 42 humano nos neurônios a SE, neurônios que detectam atrativos solúveis em água, como a biotina, usando o ensaio de quimiotaxia.

Vermes transgênicos com sete dias de idade foram testados. Os controles não tiveram problemas para encontrar biotina. Em contraste, apenas alguns vermes expressando um beta 42 conseguiram encontrar o ponto atrativo.

O índice de quimiotaxia para biotina foi de 0,68 versus 0,12 para vermes controle e experimento, respectivamente, em três a quatro dias. Houve também uma queda pequena, mas detectável, no índice. Um neurônio A SER cultivado aos quatro dias ainda expressando GFP após nove dias de vida.

No entanto, a fluorescência da GFP desapareceu e a apoptose foi suspeita para testar essa teoria. Os neurônios SER A primários foram preparados conforme descrito e suplementados com um inibidor de caspase de amplo espectro. Como esperado, o tratamento interrompeu a perda de fluorescência, confirmando que a expressão de A beta 42 humano desencadeia apoptose em neurônios A SER.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir os elegantes vermes transgênicos, estudá-los em ensaios comportamentais e como obter a cultura primária de Ambrose.