Name: Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprenda a reconstituir canais de potássio em membranas lipídicas para estudos estruturais e funcionais. Este método permite análises bioquímicas, gravações elétricas e cristalografia eletrônica de proteínas de membrana.

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Os estudos sobre KvAP no laboratório Jiang ter obtido ajuda significativa do laboratório do Dr. Roderick MacKinnon na Universidade Rockefeller. Um agradecimento especial ao Dr. Kathlynn Brown e Michael McQuire para os seus conselhos e ajuda em nossos experimentos fago tela. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH (GM088745 e GM093271 a Q-XJ) e AHA (12IRG9400019 a Q-XJ).

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Os autores não têm nada a revelar.

A reconstituição dos canais KvAP em diferentes membranas tem sido utilizado em vários estudos 8-10. Seguindo a ideia de assegurar a distribuição de lípidos entre detergente / lípido micelas mistas e as micelas mistas de proteína / detergente / lípido, que são capazes de atingir a reconstituição quase completa da KvAP em membranas feitas de diferentes lípidos. Cada canal KvAP tetrameric precisa de aproximadamente 100 moléculas lipídicas para cobrir integralmente o seu domínio transmembrana. A exigência essenci...

Células materiais taxas e informações com seu ambiente através das funções das proteínas de membrana específicos 1. Proteínas de membrana nas membranas celulares funcionam como bombas, canais, receptores, enzimas intramembrane, linkers e simpatizantes estruturais através das membranas. As mutações que afetam as proteínas de membrana têm sido relacionado a muitas doenças humanas. Na verdade, muitas proteínas de membrana têm sido os principais alvos de drogas, porque eles são importantes e facilmente acessível nas membranas celulares. É, portanto, muito importante para compreender a estrutura e função de várias proteínas da membrana em membranas, e torná-lo possível conceber novos métodos para aliviar os efeitos prejudiciais das proteínas mutantes em doenças humanas. Lipids cercar todas as proteínas integradas na membrana bicamadas 2, 3. Em membranas eucarióticos, são conhecidos vários tipos de lípidos para ser organizados em microdomínios 4, 5.Muitas proteínas de membrana foram mostrados para serem distribuídos entre estes microdomínios, bem como o fluido de fase volumosa das membranas 3, 6. O mecanismo subjacente à organização dos microdomínios ea entrega de proteínas de membrana para eles eo significado fisiológico de tais distribuições são claramente importantes, mas permanecem pouco conhecidos. Uma grande dificuldade técnica em estudar os efeitos sobre as proteínas de membrana de lípidos é a reconstituição de confiança de bioquimicamente purificado proteínas de membrana em membranas de composição lipídica bem controlado de modo a que quase todas as proteínas são reconstituídos funcional 7. Nos últimos anos, foi desenvolvido métodos para reconstituir a voltagem dependentes do canal de potássio do protótipo A. pernix (KvAP) em sistemas de membrana diversos para estudos estruturais e funcionais 8-10. Os dados de outros nós em conjunto e mostraram que os lípidos são provavelmente um determinante nas mudanças conformacionais do sensor de tensãodomínios de um canal de iões e por voltagem pode moldar as estruturas de alguns destes canais 11. No próximo, vamos fornecer uma descrição detalhada de nossos métodos e irá oferecer dicas técnicas críticas que provavelmente vai garantir o sucesso da reprodução dos resultados, bem como a extensão dos nossos métodos para estudos de outras proteínas da membrana.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>RPI Corp.</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>RPI Corp.</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI Corp.</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecil-&#946;-D-Maltoside</td><td>Affymetrix</td><td>D322S</td><td>N-Octyl-&</td></tr><tr><td>#946;-D-Glucoside </td><td>Affymetrix</td><td>O311</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td> de Grau Ana <td>RPI Corp.</td><td>A20550-0.05</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>RPI Corp.</td><td>L22035-0.025</td><td></td></tr><tr><td>Pestatina A</td><td>RPI Corp.</td><td>P30100-0.025</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>13407000</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Bead SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>RPI Corp.</td><td>H75030</td><td></td></tr><tr><td>POPE</td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>850757C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>CÃES</td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>870314C</td><td></td></tr><tr><td>DMPC </td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-DOPE </td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>870282C</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>grânulos de agarose NeutrAvidin 890890C</td><td></td></tr><tr><td> </td><td>Piercenet</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de diálise</td><td>Spectrum Laboratories, Inc</td><td>132-570</td><td></td></tr><tr><td>Pentano</td><td>Fisher</td><td>R399-1</td><td></td></tr><tr><td>Decane</td><td>TCI America</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>MTS-PEG5000</td><td>Toronto Research Cemicals</td><td>M266501</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstituição de um canal de kv para membranas lipídicas de estudos estruturais e funcionais

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Para estudar a interacção lípido-proteína numa forma reductionistic, é necessário incorporar as proteínas de membrana em membranas de composição lipídica bem definida. Estamos estudando os efeitos de propagação de lipídios-dependentes em um canal de potássio voltagem-dependentes protótipo (Kv), e tem trabalhado procedimentos pormenorizados para reconstituir os canais em sistemas de membrana diferentes. Nossos procedimentos de reconstituição tomar conta de ambos fusão detergente induzida por vesículas e da fusão de proteína / detergente micelas com os lipídios / detergente micelas mistas, bem como a importância de se chegar a uma distribuição de equilíbrio de lipídeos entre a proteína / detergente / lipídio e do detergente micelas mistas / lipídicas. Os nossos dados sugerem que a inserção dos canais nas vesículas lipídicas é relativamente aleatória em orientações, e a eficiência da reconstituição é tão elevado que não foram detectáveis ​​agregados proteicos encontrados em experiências de fraccionamento. Nós utilizamos a reconstituird canais para determinar os estados conformacionais dos canais em diferentes lípidos, gravar actividades eléctricas de um pequeno número de canais incorporados em bicamadas lipídicas planas, a tela para ligandos específicos para a conformação de uma biblioteca de péptido-fago exibida, e apoiar o crescimento dos cristais 2D dos canais em membranas. Os procedimentos de reconstituição descritas aqui pode ser adaptado para o estudo de outras proteínas da membrana em bicamada de lípidos, especialmente para a investigação dos efeitos de lípidos nos canais iónicos dependentes da voltagem eucarióticas.

O fluxo geral das experiências para a purificação do canal KvAP em homogeneidade bioquímica está descrito na Figura 1A. Amostras típicas durante a expressão e purificação da proteína é mostrado no gel de SDS-PAGE na Figura 1B. A proteína, após a purificação IMAC é relativamente puro. O rendimento do canal KvAP é de cerca de 1,0 mg / litro de cultura. Solubilização de vesículas lipídicas com detergentes precisa ser trabalhado para cada par de lipídios contra ...

Procedimentos para a reconstituição completa da voltagem dependentes do canal de potássio protótipo em membranas lipídicas são descritos. Os canais reconstituídos são adequados para ensaios bioquímicos, gravações elétricas, triagem ligante e estudos de cristalografia de elétrons. Esses métodos podem ter aplicações gerais para os estudos estruturais e funcionais de outras proteínas de membrana.

Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma descrição detalhada das técnicas para o estudo funcional e estrutural do efeito dos lipídios sobre proteínas de membrana. Isso é realizado primeiramente pela expressão e purificação do canal de potássio ativado por voltagem. O segundo passo é a reconstituição do canal iônico.Em seguida, realiza-se a gravação elétrica dos canais iônicos em bicamadas lipídicas para o estudo funcional dos canais iônicos. O passo final é a cristalização dos canais iônicos na membrana para determinação da estrutura. Em última análise, ensaios bioquímicos, método eletrofisiológico e estudo de cristalografia eletrônica são utilizados para investigar os efeitos dos lipídios sobre o movimento do sensor de voltagem dos canais iônicos.Em geral, as pessoas novas neste método enfrentarão dificuldades devido aos muitos detalhes técnicos na reconstrução proteica e nas gravações bioelétricas. Esperamos que este vídeo ajude você a acompanhar todo o procedimento e obter sucesso. A demonstração de todo o processo será realizada pelo Dr. Hui Jim do meu laboratório.Antes da preparação dos lipídios, tinham-se um tubo de ensaio descartável de vidro de 14 mililitros, um t

reconstitution-kv-channel-into-lipid-membranes-for-structural

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Reconstituindo as proteínas da membrana funcionais em lipossomas gigantes de composição definida é uma abordagem poderosa quando combinado com eletrofisiologia patch-clamp. No entanto, a produção de lipossomas gigante convencional pode ser incompatível com a estabilidade da proteína. Descrevemos protocolos para a produção de lipossomas gigantes de lípidos puros ou de pequenos lipossomas contendo canais de iões.

Preparação de lipossomas gigantes por Imagem e patch-clamp Eletrofisiologia

A reconstituição da proteína transmembranar, KvAP, em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) é demonstrada por dois métodos de desidratação-re-hidratação - eletroformação, e inchaço assistida-gel. Em ambos os métodos, vesículas pequenas unilamelares que contêm a proteína são fundidos em conjunto para formar GUVs que pode, em seguida, ser estudadas por microscopia de fluorescência e de patch-clamp electrofisiologia.

Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

Descrito aqui é um procedimento rápido e eficaz para a reconstituição funcional da purificado do tipo selvagem e proteína CFTR mutante que preserva a atividade para este canal de cloro, que está com defeito na Fibrose Cística. Efluxo de iodeto de proteoliposomes reconstituídos mediadas por CFTR permite estudos da atividade do canal e os efeitos de pequenas moléculas.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

Este artigo descreve métodos específicos para obter quantidades bioquímicas de detergente-solubilizado TRPV1 para análises espectroscópicas. Os protocolos combinados fornecem ferramentas bioquímicas e biofísicas que podem ser adaptadas para facilitar estudos estruturais e funcionais para os canais de íon mamíferos em um ambiente controlado por membrana.

Purificação e reconstituição de TRPV1 para análise espectroscópica

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Neste manuscrito, demonstramos as técnicas experimentais para encapsular o citoesqueleto F-actin em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (também chamadas lipossomos), e o método para formar uma camada de F-actin de córtex biomimicing no folheto interno da membrana lipossosome.

In vitro Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar

A reconstituição livre de células tem sido uma ferramenta fundamental para entender a montagem do citoesqueleto, e o trabalho na última década estabeleceu abordagens para estudar a dinâmica dos septins em sistemas mínimos. Aqui apresentados estão três métodos complementares para observar a montagem de septina em diferentes contextos de membrana: bicamadas planares, suportes esféricos e suportes de hastes.

Reconstituição da Assembleia septina em membranas para estudar propriedades e funções biofísicas

Aqui é descrito o procedimento implementado no Grupo Biologia Caffrey Membrana Estrutural e Funcional para configurar manualmente ensaios de cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

Avaliação bidimensional ensaios (2D) de cristalização para a formação de matrizes de proteína de membrana ordenado é uma tarefa altamente crítico e difícil em cristalografia de elétrons. Aqui, descrevemos a nossa abordagem na triagem para identificação de cristais e 2D de proteínas da membrana predominantemente de pequena faixa de 15 - 90 kDa.

Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron

Vamos demonstrar como estudar o efeito de uma única mutação de ponto na função de um canal iônico.

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