Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma descrição detalhada das técnicas para o estudo funcional e estrutural do efeito dos lipídios nas proteínas da membrana. Isso é feito primeiro expressando e purificando o canal de potássio dependente de voltagem. O segundo passo é a reconstituição do canal iônico.

Em seguida, o registro elétrico dos canais iônicos em bicamadas lipídicas é realizado para o estudo funcional do canal iônico. A etapa final é a cristalização dos canais iônicos na membrana para determinação da estrutura. Em última análise, ensaios bioquímicos, método eletrofisiológico e estudo cristalográfico eletrônico são usados para investigar os efeitos lipídicos no movimento do sensor de voltagem dos canais iônicos.

Geralmente, as pessoas novas neste método terão dificuldades por causa de muitos detalhes técnicos na reconstituição de proteínas e biogravações. Espero que este filme, o processo o ajude a passar por todo o procedimento e ter sucesso. A demonstração de todo o procedimento será realizada pelo Dr. Hui Jim do meu laboratório.

Antes da preparação lipídica, havia um tubo de ensaio de vidro descartável de 14 mililitros, um tubo de vidro com parafuso e uma seringa de vidro de 250 microlitros com clorofórmio. Em seguida, transfira 10 mililitros de clorofórmio para o tubo de ensaio. Para preparar os lipossomas POPE e POPG, transfira 3,75 miligramas de POPE e 1,25 miligramas de POPG em clorofórmio para o tubo de vidro com tampa de rosca.

Seque os lipídios sob um fluxo contínuo de gás argônio quando não houver clorofórmio visível. Experimente o lipídio ainda mais sob vácuo por uma hora. Em seguida, adicione 440 microlitros de tampão com baixo teor de sal ou água no vórtice lipídico seco.

O tubo para hidratar os lipídios. A suspensão lipídica deve parecer esbranquiçada e turida. Em seguida, sonicar a suspensão lipídica em banho gelado até que a solução da vesícula se torne translúcida.

Em seguida, a 50 microlitros de cloreto de potássio de três molares e 10 microlitros de 0,5 molar de MS à mistura, de modo que a suspensão lipídica final tenha 300 milimolares de cloreto de potássio e 10 milimolares de DM, incubar a solução em um rotador por duas horas em temperatura ambiente para permitir a formação de células M misturadas com detergente lipídico. Após a incubação, a suspensão deve tornar-se um pouco turídea devido à fusão induzida por detergente das pequenas vesículas ELLA. Quando a proteína estiver concentrada em mais de dois miligramas por mililitro, adicione os componentes listados, a mistura de detergente lipídico para fazer um mililitro do volume final.

Em seguida, incube a mistura de detergente lipídico proteico no tubo de vidro em um rotador por mais duas horas. A preparação do KVAP em mistura com o DTaP solubilizado em detergente ou DOGS, é semelhante à preparação lipídica para vesícula P-O-P-E-P-O-P-G. No entanto, a sonicação de lipídios hidratados em pequenas vesículas unli leva mais tempo do que para os lipídios P-O-P-E-P-O-P-G, as vesículas DOGS podem se fundir lentamente umas com as outras e formar pequenas gotículas oleosas para solubilizar completamente o dote ou DOGS.

As vesículas sonicadas são misturadas com 10 milimolares DM e 40 milimolares beta og. A mistura de detergente lipídico é incubada durante a noite à temperatura ambiente e a mistura deve ser bastante clara e não deve conter pequenas partículas ou gotículas. Em seguida, misture a proteína KVAP com o DTaP solubilizado em detergente ou DOGS em uma proporção proteína/lipídio menor ou igual a um para 10.

A mistura lipídica em detergente proteico pode incubar em temperatura ambiente por duas a três horas com rotação orbital contínua. Para demonstrar a remoção lenta dos detergentes que possuem CMC relativamente alto, como MS e Beta og. Primeiro prepare um tampão de diálise de dois litros para cada mistura de um mililitro.

Em seguida, corte um comprimento adequado de tubo de diálise e lave-o com água DI para verificar e certificar-se de que não há vazamento no tubo. Em seguida, carregue a mistura de detergente lipídico proteico no tubo de diálise. Prenda ambas as extremidades da tubulação com o mínimo de espaço deixado acima da solução.

Coloque o tubo carregado em uma placa de agitação no tampão de diálise para que o tubo gire lentamente em solução. Troque o tampão de diálise uma vez a cada oito horas. Agora prepare os grânulos de poliestireno para a remoção de detergentes que têm baixo CMC pela primeira asa 0,5 gramas de grânulos secos.

Em seguida, coloque-os em um tubo Corning de 50 mililitros e adicione 20 mililitros de metanol sonicate a solução em um banho Sonicate por cinco minutos para remover as bolhas presas e gaste nas contas a 5.000 RP por cinco minutos depois, decantar o metanol completamente e repetir a lavagem com etanol e água mili Q. Em seguida, armazene as contas lavadas em etanol a 20% a quatro graus Celsius e mude-as para um tampão sem detergente antes de usar. Estime a quantidade de detergentes na mistura de detergente lipídico proteico a ser tratada e calcule a quantidade de esferas necessárias para remover os detergentes.

Pese as esferas molhadas sem excesso de água e adicione-as diretamente à mistura de proteínas e aguarde pelo menos 15 a 20 minutos para que as esferas sejam totalmente eficazes. Para remover 8,7 miligramas de DDM em um mililitro de solução, um total de 87 miligramas de grânulos de poliestireno, como grânulos biológicos, o SM dois é dividido em cinco porções iguais. Misture a mistura de detergente lipídico proteico com cada fração por 20 a 30 minutos com rotação constante de ponta a ponta à temperatura ambiente.

Gire as contas, transfira o sobrenadante para a próxima fração de contas e repita até o fim. Nesta etapa, comece limpando um tubo de ensaio de vidro e um frasco âmbar com uma tampa de rosca com superfície de Teflon e um conjunto de seringas de vidro com clorofórmio. Em seguida, seque o frasco âmbar sob uma corrente de gás argônio.

Em seguida, transfira 0,75 miligramas de POPE e 0,25 miligramas de POPG em clorofórmio para o frasco de brasa e evapore o clorofórmio com gás argônio. Depois disso, adicione 0,2 mililitros de pentano ao frasco para dissolver os lipídios secos e seque completamente para remover o clorofórmio residual. Em seguida, adicione 50 microlitros de decano ao frasco para dissolver o lipídio seco.

Agora, pinte o orifício redondo na superfície cilíndrica do copo de bicamada com os lipídios sem colocar nenhuma solução lipídica no orifício. Aguarde de um a dois minutos para que a década evapore completamente para realizar registros elétricos dos canais KVAP em lipídios por camadas. Insira o copo na câmara de gravação, coloque as pontes de sal e conecte os eletrodos aos dois lados do copo de gravação.

Adicione a solução de cisto aos orifícios dos eletrodos e a solução CYS e trans aos copos externos e internos da câmara. Em seguida, ajuste o deslocamento de potencial entre os dois lados do copo para menos de dois milivolts e, em seguida, pinte o lipídio no orifício da tampa. Espere até que a membrana fique mais fina e relativamente estável.

Assim que a membrana se tornar estável. Atire 0,5 a um microlitro de canal contendo vesículas posicionando a extremidade fina de uma ponta de pipeta P dois logo acima do orifício. As vesículas caem através do orifício até o fundo do copo.

Para testar os canais KVAP na bicamada. Um pulso curto de 80 milivolts é fornecido a partir do potencial de retenção de menos 80 milivolts devido à rápida inativação e recuperação lenta de uma ativação em um longo intervalo, cerca de 120 segundos para canais em membranas PEPG são dados entre dois pulsos. Quando a corrente parecer boa em tamanho, equilibre as concentrações de íons nas soluções em ambos os lados da membrana adicionando sais de íons adicionais ao lado de baixa concentração.

Aqui está uma imagem de um cristal 2D manchado negativamente, o meio da otimização do cristal. Os cristais foram corados com 6% de moto de amônio, pH 6,4 mais 0,5% de triose devido ao açúcar que às vezes se acumulavam. A caixa quadrada preta aqui designa uma área que dá origem ao padrão de difração com pontos de difração.

Indo para cerca de 20 angstrom, aqui está uma imagem cryo EM de um cristal 2D de uma amostra semelhante à mostrada antes. O espécime foi misturado com 3%TLOs e congelado por mergulho direto e fotografado sob um criogênico EM a 50.000 decks. É claro que havia defeitos locais na embalagem do cristal.

Aqui está outra imagem crio-EM de um cristal ainda mais otimizado. O espécime foi incorporado em 0,75% de tanino e 10% de olás de árvore, e a imagem foi tirada a 50.000 x. As linhas retas no empacotamento apertado sugeriam que os canais estavam bem ordenados neste tipo de cristais, enquanto as duas setas pretas marcam os vetores quadrados.

Depois de assistir a este vídeo, espero que você tenha uma boa noção sobre como lidar com lipídios e proteínas adequadamente, e espero que este vídeo o ajude a estudar a proteína lipídica para agir na membrana com mais eficiência.