Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma descrição detalhada das técnicas para o estudo funcional e estrutural do efeito dos lipídios sobre proteínas de membrana. Isso é realizado primeiramente pela expressão e purificação do canal de potássio ativado por voltagem. O segundo passo é a reconstituição do canal iônico.

Em seguida, realiza-se a gravação elétrica dos canais iônicos em bicamadas lipídicas para o estudo funcional dos canais iônicos. O passo final é a cristalização dos canais iônicos na membrana para determinação da estrutura. Em última análise, ensaios bioquímicos, método eletrofisiológico e estudo de cristalografia eletrônica são utilizados para investigar os efeitos dos lipídios sobre o movimento do sensor de voltagem dos canais iônicos.

Em geral, as pessoas novas neste método enfrentarão dificuldades devido aos muitos detalhes técnicos na reconstrução proteica e nas gravações bioelétricas. Esperamos que este vídeo ajude você a acompanhar todo o procedimento e obter sucesso. A demonstração de todo o processo será realizada pelo Dr. Hui Jim do meu laboratório.

Antes da preparação dos lipídios, tinham-se um tubo de ensaio descartável de vidro de 14 mililitros, um tubo de vidro com tampa rosqueada e uma seringa de vidro de 250 microlitros contendo clorofórmio. Em seguida, transfira 10 mililitros de clorofórmio para o tubo de ensaio. Para preparar lipossomos de POPE e POPG, transfira 3,75 miligramas de POPE e 1,25 miligramas de POPG em clorofórmio para o tubo de vidro com tampa rosqueada.

Seque os lipídios sob um fluxo contínuo de gás argônio quando não restar clorofórmio visível. Em seguida, seque os lipídios sob vácuo ambiente por uma hora. Depois, adicione 440 microlitros de tampão de baixa salinidade ou água ao vórtex de lipídios seco.

O tubo para hidratar os lipídios. A suspensão de lipídios deve apresentar aparência esbranquiçada e turva. Em seguida, sonique a suspensão de lipídios em banho de gelo até que a solução de vesículas fique translúcida.

Em seguida, adicione 50 microlitros de cloreto de potássio três molar e 10 microlitros de DM 0,5 molar à mistura, de modo que a suspensão lipídica final contenha cloreto de potássio 300 milimolar e DM 10 milimolar. Incube a solução em um agitador rotativo por duas horas à temperatura ambiente para permitir a formação de células mistas lipídicas e detergentes. Após a incubação, a suspensão deve ficar um pouco turva devido à fusão induzida pelo detergente das pequenas vesículas ELLA. Quando a proteína for concentrada a mais de dois miligramas por mililitro, adicione os componentes listados, a mistura de lipídio e detergente, para obter um volume final de um mililitro.

Em seguida, incubar a mistura de proteína, lipídio e detergente no tubo de vidro em um rotador por mais duas horas. A preparação do KVAP em mistura com o DTaP solubilizado por detergente ou DOGS é semelhante à preparação de lipídios para o vesículo P-O-P-E-P-O-P-G. No entanto, a sonicagem dos lipídios hidratados em vesículos pequenos e unilamelares leva um tempo mais longo do que para os lipídios P-O-P-E-P-O-P-G; os vesículos de DOGS podem lentamente se fundir entre si e formar pequenas gotículas oleosas para solubilizar completamente o detergente ou o DOGS.

As vesículas sonicadas são misturadas com DM 10 milimolar e beta og 40 milimolar. A mistura de lipídio-detergente é incubada durante a noite à temperatura ambiente e a mistura deve ficar bastante clara, sem partículas ou gotículas pequenas. Em seguida, misture a proteína KVAP com o DTaP ou DOGS solubilizado por detergente numa proporção proteína:lipídio menor ou igual a 1:10.

A mistura de proteína, detergente e lipídio é incubada à temperatura ambiente por duas a três horas com rotação orbital contínua. Para demonstrar a remoção lenta dos detergentes que possuem CMC relativamente alta, como DM e Beta og, prepare primeiro dois litros de tampão de diálise para cada mililitro da mistura.

Em seguida, recorte um comprimento adequado de tubo de diálise e lave-o com água desionizada para verificar e garantir que não há vazamentos no tubo. A seguir, carregue a mistura de proteína, lipídio e detergente no tubo de diálise. Prenda ambas as extremidades do tubo com o mínimo de espaço restante acima da solução.

Coloque o tubo carregado sobre uma placa de agitação no tampão de diálise, de modo que o tubo gire lentamente na solução. Troque o tampão de diálise uma vez a cada oito horas. Prepare agora as microesferas de poliestireno para a remoção de detergentes com CMC baixo, primeiro pesando 0,5 gramas de microesferas secas.

Em seguida, coloque-os em um tubo Corning de 50 mililitros e adicione 20 mililitros de metanol; sonique a solução em banho ultrassônico por cinco minutos para remover bolhas aprisionadas e centrifugue as esferas a 5.000 rpm por cinco minutos. Posteriormente, decante completamente o metanol e repita a lavagem com etanol e água milli-Q. Em seguida, armazene as esferas lavadas em etanol 20% a quatro graus Celsius e substitua por um tampão livre de detergentes antes do uso. Estime a quantidade de detergentes na mistura de proteína, lipídio e detergente a ser tratada e calcule a quantidade de esferas necessária para remover os detergentes.

Pese as bolinhas úmidas sem excesso de água e adicione-as diretamente à mistura de proteína, aguardando pelo menos 15 a 20 minutos para que as bolinhas sejam totalmente eficazes. Para remover 8,7 miligramas de DDM em um mililitro de solução, um total de 87 miligramas de bolinhas de poliestireno, como bio beads SM dois, é dividido em cinco porções iguais. Misture a mistura de proteína, lipídio e detergente com cada fração por 20 a 30 minutos com rotação constante de ponta a ponta à temperatura ambiente.

Centrifugue os grânulos, depois transfira o sobrenadante para a próxima fração de grânulos e repita até o final. Nesta etapa, comece limpando um tubo de ensaio de vidro e um frasco âmbar com tampa rosqueável revestida de teflon, bem como um conjunto de seringas de vidro, utilizando clorofórmio. Em seguida, seque o frasco âmbar sob um fluxo de gás argônio.

Em seguida, transfira 0,75 miligramas de POPE e 0,25 miligramas de POPG em clorofórmio para o frasco de embreagem e evapore o clorofórmio com gás argônio. Depois disso, adicione 0,2 mililitros de pentano ao frasco para dissolver os lipídios secos e seque completamente para remover o clorofórmio residual. Em seguida, adicione 50 microlitros de decano ao frasco para dissolver o lipídio seco.

Agora, pinte o orifício redondo na superfície cilíndrica do copo de bicamada com os lipídios, tomando cuidado para não introduzir solução lipídica no orifício. Aguarde um a dois minutos para que o decano evapore completamente, a fim de realizar gravações elétricas de canais KVAP em bicamadas lipídicas. Insira o copo na câmara de gravação, coloque as pontes salinas e conecte os eletrodos aos dois lados do copo de gravação.

Adicione a solução de cisteína aos orifícios do eletrodo e a solução de CYS e trans às câmaras externa e interna. Em seguida, ajuste o deslocamento de potencial entre os dois lados da câmara para menos de dois milivolts e, então, aplique o lipídio sobre o orifício na tampa. Aguarde até que a membrana fique mais fina e se torne relativamente estável.

Assim que a membrana se estabilizar, aplique de 0,5 a um microlitro do canal contendo vesículas posicionando a extremidade fina da ponteira de uma pipeta P2 logo acima do orifício. As vesículas caem através do orifício até o fundo do copo.

Para testar os canais KVAP na bicamada. Um pulso curto de 80 milivolts é aplicado a partir do potencial de retenção de menos 80 milivolts devido à inativação rápida e recuperação lenta da ativação; um longo intervalo, cerca de 120 segundos para canais em membranas PEPG, é dado entre dois pulsos. Assim que a corrente apresentar um tamanho adequado, equilibre as concentrações iônicas nas soluções em ambos os lados da membrana adicionando sais iônicos adicionais ao lado de baixa concentração.

Aqui está uma imagem de um cristal 2D com coloração negativa, no estágio intermediário da otimização de cristais. Os cristais foram corados com molibdato de amônio 6%, pH 6,4, mais 0,5% de triose devido ao açúcar, que às vezes fazia com que se empilhassem uns sobre os outros. A caixa quadrada preta aqui delimita uma área que dá origem ao padrão de difração com manchas de difração.

Indo até cerca de 20 angstroms, aqui está uma imagem de microscopia eletrônica criogênica (cryo EM) de um cristal 2D a partir de uma amostra semelhante à mostrada anteriormente. O espécime foi misturado com 3% TLOs e congelado por imersão direta, sendo então analisado em uma microscopia eletrônica criogênica a 50.000 aumentos. É evidente que havia defeitos locais no empacotamento cristalino.

Aqui está outra imagem de microscopia eletrônica de criogenia de um cristal ainda mais otimizado. O espécime foi embutido em 0,75% de tanino e 10% de tree hellos, e a imagem foi obtida a 50.000 x. As linhas retas no empacotamento denso sugerem que os canais estavam bem ordenados neste tipo de cristal, enquanto as duas setas pretas indicam os vetores quadrados.

Depois de assistir a este vídeo, espero que você tenha uma boa noção de como manipular lipídios e proteínas adequadamente, e este vídeo esperançosamente o ajudará a estudar a interação entre lipídios e proteínas na membrana de forma mais eficiente.