Todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural Infrared

O objetivo geral do experimento a seguir é produzir um sistema modelo para estudar os efeitos da iluminação a laser infravermelho em neurônios auditivos in vitro. Isso é conseguido por patch clamping, neurônios auditivos cultivados em toda a configuração celular, a fim de explorar suas características elétricas. Posteriormente, a exposição dos neurônios à irradiação a laser pode provocar respostas elétricas na célula exposta, que podem ser medidas com uma configuração de patch clamp.

Os parâmetros de iluminação e as variáveis ambientais podem então ser variados para observar seus efeitos nas respostas elétricas induzidas pelo laser. Os neurônios auditivos expostos à luz do laser exibirão atividade elétrica repetível em resposta a cada pulso de laser para análise posterior. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre os mecanismos subjacentes à estimulação infravermelha dos neurônios do gânglio espirai.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a estimulação infravermelha de células ganglionares espirais especificamente, ele também pode ser estendido a outros tipos de células ou modelos simplificados, como bicamadas lipídicas, para elucidar ainda mais os processos físicos envolvidos. A demonstração visual deste método é importante para garantir o posicionamento preciso da fibra óptica de entrega de luz, porque a exposição de radiância resultante é um parâmetro crítico, Preparei micro pipetas de gravação com uma resistência de dois a seis mega ohms. Eles podem ser retirados de vidro de silicato emprestado com um extrator de laser de CO2.

Prepare o laser acoplado a fibra. Uma ampla gama de fibras ópticas funcionará. Cortar uma fibra em uma configuração de patch cord com conectores FCPC ao meio produz dois elos de fibra com um conector em uma extremidade e fibra exposta na outra extremidade.

Estas são as tranças. Prepare a ponta de urso de um pigtail removendo a jaqueta de fibra, limpando com etanol e clivando com uma ferramenta apropriada sob um microscópio. Verifique se a ponta está perpendicular ao eixo da fibra e se parece plana.

Conecte a outra extremidade do pigtail de fibra à saída do laser de estimulação usando um conector passante apropriado, se necessário. Neste ponto, certifique-se sempre de medir a potência do laser de saída da fibra. Faça isso depois de qualquer outra manipulação de ponta também.

Agora insira a fibra em um mandril e fixe o mandril no micro posicionador apropriado. Em seguida, determine o ângulo que a fibra óptica faz com uma lamínula. Tire uma fotografia do arranjo e calcule o ângulo usando a imagem J. Agora, prenda as conexões que sincronizam o laser com o sistema de aquisição de dados do patch clamp.

A saída digital do sistema de aquisição de dados patch clamp deve ser conectada ao laser por meio de um gerador de função externo, possibilitando especificar os parâmetros de pulso do laser independentemente do sistema de aquisição de dados, o sinal usado para acionar o laser deve ser conectado de volta a uma entrada do sistema de aquisição de dados para garantir que o tempo e o comprimento dos pulsos de laser possam ser registrados simultaneamente com o sinal eletrofisiológico, Defina a vazão do sistema de perfusão entre um e dois mililitros por minuto. Um sistema alimentado por gravidade com um aquecedor em linha para aquecimento rápido da solução e uma bomba peristáltica para remover a solução gasta por sucção funcionará. Poço. Coloque uma lamínula com células cultivadas na câmara de gravação de um microscópio vertical usando uma objetiva de imersão em água de alta ampliação e contraste de fase, localize um neurônio do gânglio espiral.

Um neurônio ganglionar espiral típico é faseado, redondo e brilhante e tem aproximadamente 15 mícrons de diâmetro com um núcleo proeminente. Uma vez que um neurônio adequado tenha sido localizado, mude para uma objetiva de ampliação mais baixa e localize o neurônio alvo. Em seguida, use o micro posicionador para mover a fibra óptica até que a ponta esteja próxima ao neurônio alvo nos planos horizontal e vertical.

Volte para a objetiva de alta ampliação e posicione a ponta da fibra óptica na posição pretendida ao lado do neurônio. Ao ajustar a posição vertical da fibra, é importante que a borda inferior da fibra fique apoiada no lábio da tampa. Para minimizar a incerteza na localização da fibra, o ponto de contato pode ser identificado a partir de pistas visuais na imagem do microscópio.

Uma vez que a fibra esteja em posição, mova-a para fora por quantidade conhecida ao longo de seu eixo longitudinal para não afetar o posicionamento da micropipeta. A micropipeta deve ser preenchida com solução intracelular e encaixada com segurança no estágio da cabeça do amplificador. Usando um tubo preso na lateral do suporte do microeletrodo, aplique uma pequena quantidade de pressão positiva para evitar o entupimento da micropipeta.

Usando um manipulador microm, mova a micropipeta para a posição logo acima do neurônio alvo e prossiga com a confecção de um selo de giga ohm. Faça um registro da resistência em série da capacitância da membrana e da resistência de entrada, conforme determinado a partir da curva exponencial ajustada à corrente. Durante o pulso de teste de vedação.

Minimize o transiente de capacitância ajustando os controles CP rápido e CP lento no amplificador. Em seguida, mude o amplificador para o modo de célula inteira e modifique a compensação de capacitância e resistência até que uma corrente plana seja observada durante o teste SEAL. Em seguida, aplique a compensação de resistência em série com cerca de 70% de correção, 70% de previsão, ajustando os controles de compensação de capacitância e resistência para manter uma resposta de vedação de teste plana.

Em seguida, mude o amplificador para o modo de pinça de corrente. Observe o potencial de membrana em repouso na ausência de injeção de corrente. Agora defina uma corrente de retenção para estabilizar o potencial da membrana no nível desejado.

Neutralize a capacitância da pipeta e ajuste o equilíbrio da ponte para equilibrar a queda de tensão. Verifique as propriedades de disparo do neurônio estimulando com corrente despolarizante. Neste ponto, mova a fibra óptica de volta para a posição ao lado do neurônio usando um software de imagem acoplado a uma câmera CCD para capturar imagens focadas no plano do neurônio inicialmente e depois focadas na borda superior da fibra óptica.

Analise as imagens para determinar o valor delta, que é a posição da borda superior da fibra óptica em relação ao centro do neurônio alvo. É muito importante saber com precisão a posição da fibra óptica. Isso ocorre porque a energia por unidade, área ou exposição de radiância fornecida à célula-alvo é um parâmetro crítico para a estimulação neural infravermelha, e isso pode ser significativamente afetado pela posição da fibra em relação à célula.

Este laser é a potência óptica é controlada por computador através de uma entrada direta para o laser e pode ser especificada manualmente antes de cada gravação. O comprimento do pulso e a taxa de repetição podem ser controlados através do gerador de funções conforme descrito anteriormente, certifique-se de que os dados sejam registrados tanto do patch clamp canal quanto do canal de disparo do laser de meio a 15 milissegundos pulsos de laser de 0,25 a cinco. Milijoules normalmente produzem respostas elétricas mensuráveis. Inicialmente.

Pode ser útil definir a taxa de repetição de pulsos de laser para um hertz ou menos para minimizar efeitos indesejáveis. Uma vez que todos os parâmetros do laser tenham sido definidos. Prossiga com a coleta de dados.

Os neurônios do gânglio espiral respondem à iluminação do laser com formas de onda repetíveis em ambas as configurações de gravação de grampo de tensão e corrente em resposta a pulsos de laser de 2,5 milissegundos e 0,8 milijoules. Uma célula típica produz uma corrente interna líquida em vários potenciais de retenção. Os registros de pinça de corrente mostram uma despolarização constante da membrana ao longo desses pulsos de laser, seguida por uma diminuição aproximadamente exponencial em direção ao potencial de membrana em repouso após o pulso.

Em alguns casos, há também uma pequena despolarização adicional da membrana após o pulso do laser. Iluminar com energia excessiva ou exposição a grandes aumentos de temperatura pode resultar em danos celulares observados por meio da deterioração das propriedades elétricas celulares ou morte celular instantânea. Seguindo este procedimento, uma série de parâmetros ambientais, como temperatura da solução ou fatores químicos, podem ser variados para testar o efeito destes na atividade elétrica induzida por laser.

Não se esqueça de que trabalhar com lasers pode ser perigoso e as precauções de segurança padrão devem ser implementadas. Isso inclui o uso de óculos de segurança a laser, sinais de alerta e garantir que o feixe não se cruze involuntariamente com superfícies altamente reflexivas.