Name: Todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural Infrared (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda a técnica de patch clamp em células inteiras para investigar a estimulação neural por laser infravermelho em neurônios auditivos primários cultivados. Este método permite analisar respostas elétricas e avançar na neurociência.

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Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa Australiano sob Linkage Projeto concessão LP120100264.

1. Cultura de neurônios do gânglio espiral <ol><li> Esterilizar redonda pequena (por exemplo, 10 mm de diâmetro) lamínulas de vidro e uma pinça curva em uma autoclave. Transferir as lamelas esterilizadas em poços individuais de uma solução estéril de 4 anéis placa de petri de 35 milímetros ou placa de 4 poços, utilizando as pinças esterilizadas. Aplicar 150 ul de poli-L-ornitina (500 ug / ml) e laminina rato (0,01 mg / ml) para a superfície superior da lamela e colocar numa incubadora (37 ° C) durante até 48 horas. Assegurar que as lamelas não flutuem a partir do fundo do poço. </li><li> Preparar 50 ml de meio Neurobasal estéreis (NBM) de cada cultura neural: 47,5 ml neurobasal A, 0,5 ml de N 2 suplemento, 1 ml de suplemento de B27, de 0,5 ml de L-glutamina, e 0,5 ml de penicilina-estreptomicina. Nota: Os suplementos podem ser congelado, armazenado a -20 ° C e adicionado ao meio no dia necessária. </li><li> Dissociar neurônios do gânglio espiral de pós-natais dias 4-7 filhotes de rato, como descrito anteriormente 20,21, nosção enzimáticas (0,025% de tripsina e 0.001% de DNase I) e técnicas mecânicas. Consulte Whitlon et al. 22 e Vieira et al. 23 para os procedimentos detalhados de neurônios do gânglio espiral da cultura, ou Parker et al. 24 para uma demonstração de isolamento modiolus. </li><li> Aspirar qualquer solução poly-L-ornithine/laminin restante das lamelas e lave brevemente com NBM. </li><li> Adicionar 150-200 ul da suspensão de neurónios do gânglio espiral dissociado para as lamelas e colocar numa incubadora (37 ° C, 10% de CO 2). Nota: até 20 lamelas pode ser preparado a partir de uma ninhada média de oito filhotes de ratos. </li><li> Quatro horas depois do chapeamento neurónios, aspirar a solução para remover os detritos celulares e substituir com 150-200 ul aquecido NBM fresco. Nota: A mídia pode exigir a reposição diária para evitar a desidratação. </li><li> Retorno lamelas à incubadora até ser necessário para registos electrofisiolicos. Nota: espiral dissociadaculturas de neurónios do gânglio pode ser utilizado para experiências electrofisiológicas e quatro horas após a dissociação e por até dois dias depois. Tempo in vitro, deve ser tido em conta durante a análise dos resultados. Reabastecer NBM cada 24-48 horas. </li></ol> 2. Preparação para o patch Recordings Grampo <ol><li> Preparar soluções <ol><li> Solução intracelular (micropipeta): 115 mM de K-gluconato, 7 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 0,05 mM de EGTA, 2 mM de Na 2 ATP, 2 mM de MgATP, 0,5 mM Na 2 GTP (ajustar para pH 7,3 com KOH, ajustar a 295 mOsmol / kg, com sacarose). Filtrar a solução através de um filtro estéril (0,2 um) e dividem-se em alíquotas de 200 ul de ser armazenado a -20 ° C até ao dia da gravação. </li><li> Solução extracelular (banho): NaCl 137 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 10 mM, glucose 10 mM (ajustado a pH 7,4 com NaOH; ajustar a 300-310 mOsmol / kg, com sacarose) . Esta solução é feita no dia da gravação. </li></ol></li><li> Prepare gravação micropipetas com uma resistência de 2-6 mohms. Nós usamos um laser de CO 2 extrator (P-2000; Sutter Instruments) e vidro de borosilicato (1,0 mm de diâmetro externo, 0,58 milímetros de diâmetro interno e 75 mm de comprimento). </li><li> Prepare o laser. Este protocolo destina-se a utilização com um laser de fibra de acoplamento, tal como a 1870 nm, a partir de Infravermelhos neuroestimulador Optotech P / L. A fibra óptica utilizado para entrega de luz nas nossas experiências é uma fibra de sílica diâmetro 200/220 mM de núcleo / revestimento, com uma abertura numérica de 0,22 e conectores FC-PC em ambas as extremidades (AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C -0,22). Os cordões foram cortadas ao meio para produzir duas tranças de fibras (isto é, conectorizada numa extremidade e clivada no outro). Os efeitos do diâmetro do núcleo da fibra e a abertura numérica em mudanças de temperatura induzidas a laser têm sido discutidas em detalhe por Thompson et ai 25. <ol><li> Cleave a ponta da fibra de entrega de luz, utilizando técnicas convencionaise assegurar que a ponta resultante é de alta qualidade por meio de observação com um microscópio óptico (isto é, a ponta deve ser perpendicular ao eixo da fibra e aparecem plana sobre a inspecção visual). Ligar o fornecimento de luz de fibra para a fibra de saída acoplado do laser utilizando um estímulo adequado, através do conector (por exemplo, Thorlabs ADAFC2). </li><li> Medir a potência do laser de saída da ponta clivada da fibra de entrega de luz, utilizando um instrumento adequado (por exemplo, Fieldmate Coerente com LM-3 cabeça do detector). Recomenda-se verificar a potência do laser cada vez que a fibra de entrega luz é clivada ou um ajuste significativo é feito para o laser (por exemplo, o transporte de um laboratório para outro). </li><li> Insira fibra entrega a luz em uma bucha de fibra ou dispositivo equivalente e apor o mandril ao microposicionador apropriado. É importante ser capaz de determinar com precisão o ângulo θ que a fibra óptica faz com a lamela. Este anglE pode ser medido tomando uma fotografia do arranjo experimental e utilizando software de processamento de imagem (por exemplo ImageJ) para se obter o ângulo. O ângulo θ (ou intervalo de ângulos possíveis) é limitado principalmente por limitações espaciais do arranjo experimental - em particular o microscópio. Os valores típicos de θ nas nossas experiências (com base em um microscópio vertical) são cerca de 36 °, no entanto, o ângulo ideal pode diferir significativamente para configurações alternativas (por exemplo, aqueles que utilizam um microscópio invertido). </li><li> Fazer as ligações entre o laser e o sistema de aquisição de dados de patch clamp (Digidata 1440A, por exemplo, Molecular Devices), conforme mostrado na Figura 2. A saída digital a partir do sistema de aquisição de dados de patch clamp deve ser ligado ao laser através de um gerador de função externa, tornando-se possível especificar parâmetros de pulso de laser independentes do sistema de aquisição de dados. Alternativamente, esta saída pode ser conectado diretamente aoo motorista do laser (que exige a duração de pulso e taxa de repetição para ser definido pelo software de aquisição de dados). Em qualquer caso, o sinal utilizado para disparar o laser deve ser ligada de volta para uma entrada do sistema de aquisição de dados, para assegurar que a temporização e duração dos pulsos de laser pode ser registada concorrentemente com o sinal electrofisiológico. </li></ol></li></ol> 3. Remendo Recordings Grampo para investigação de INS <ol><li> Encher o contentor apropriado do sistema de perfusão com uma solução extracelular e ajustar a taxa de fluxo para proporcionar perfusão do banho a uma taxa de 1-2 ml / min. Usamos um sistema (frasco aspirador, de válvula de estrangulamento, e tubagem PE) alimentada por gravidade com um aquecedor em linha, para permitir um aquecimento rápido da solução, e uma bomba peristáltica, para remover a solução passou por sucção. </li><li> Coloque uma lamela com a cultura de células para a câmara de registo (de banho) de um microscópio vertical. Utilizando uma objetiva de imersão em água de alta ampliação (e. G. 40X) e de contraste de fase (por exemplo, contraste de interferência diferencial ou contraste gradiente Dodt), localizar visualmente os neurônios do gânglio espiral dentro da cultura. Um neurónio típico gânglio espiral é de fase brilhante, redondos e cerca de 15 um de diâmetro, com um núcleo proeminente, como mostrado na figura 1a. </li><li> Uma vez que um neurônio foi localizado, mudar para um objetivo de ampliação menor (por exemplo, 10x) e localize o neurônio alvo dentro do campo visual. </li><li> Mover o fornecimento de luz de fibra óptica em posição usando o seguinte procedimento (ou equivalente): <ol><li> Utilizar a microposicionador para mover a fibra de saída até que a ponta fica perto do neurónio alvo nos planos horizontal e vertical. A posição vertical da ponta da fibra pode ser verificada por meio de mover o objectivo cima e para baixo (a digitalização da focagem). </li><li> Retornar ao objectivo alta ampliação e posicionar a ponta da fibra óptica na sua posição destinada ao lado de tele neurônio (ver Figura 2 inset). Ao ajustar a posição vertical da fibra, é importante que o bordo inferior da fibra está assente sobre (isto é, apenas tocando) da lamela, para minimizar a incerteza na localização da fibra. O alinhamento óptimo, no plano horizontal irão depender do ângulo θ que faz com que a fibra com a lamela e o raio r da fibra. A fim de posicionar as fibras de modo que o centro do neurónio-alvo se situa ao longo do eixo da fibra, a distância horizontal entre o bordo superior da fibra e da célula alvo deve ser Δ target = r (θ Cosec - 2 sin θ), em que os valores negativos indicam que as saliências de fibras ópticas da célula. Quando o alinhamento da fibra, uma distância de alvo Δ entre a borda superior da fibra e do centro do neurónio pode ser conseguida por cerca de uma inspecção visual. No entanto alvo Δ é projetado paraservir como uma orientação aproximada só. Posicionamento da fibra de tal modo que a distância real Δ entre o bordo superior da fibra e do centro do neurónio difere de forma mensurável a partir Δ alvo (como mostrado na Figura 1) pode fornecer informações sobre o efeito de ambos deslocamento radial (ou seja, a partir do centro da feixe) e deslocamento axial (isto é, ao longo do eixo da fibra) do feixe em relação ao neurónio alvo. Por exemplo, configurando Δ ≈ 0 seria esperado um aumento da temperatura local na vizinhança da célula - ou seja, uma vez que o perfil do feixe de fibras multimodo típicos é bem aproximada pela distribuição de um chapéu de topo 26, a diminuição na energia absorvida localmente (temperatura) devido ao deslocamento a partir do centro do feixe é mínima em comparação com o aumento da energia absorvida a partir de mover a face da extremidade da fibra mais perto da célula. Enquanto cuidados devem ser tomados para posicionar a fibra com a maior precisão e repetidamente como possible usando sinais visuais, medições precisas da localização da fibra em relação ao alvo neurônio (por exemplo, Δ) é de maior importância do que posicionando-o a uma distância pré-determinada distância. Δ pode ser determinado (com um grau de incerteza máxima estimada de ± 3 mm) por análise de imagem tal como descrito no passo 3.8.2 do protocolo. Em algumas experiências a 5,8, fontes de luz branca foram acoplados através da fibra, a fim de atingir a célula desejada. Esta abordagem foi encontrado para ser ineficaz na configuração microscópio vertical, conforme a intensidade da luz difundida a partir da região alvo foi relativamente baixo a estes ângulos rasos (θ). </li><li> Uma vez que a fibra está em posição, a movê-lo para fora de uma quantidade conhecida para permitir o posicionamento simples da micropipeta. A fibra pode então ser devolvida à sua posição original quando a gravação é conseguida neural. </li></ol></li><li> Encha a micropipeta com solução intracelular e segura se encaixar nas cabeçastagem do amplificador (por exemplo, Multiclamp 700B, Molecular Devices). Usando o tubo ligado ao lado do suporte de microeléctrodos, aplicar uma pequena quantidade de pressão positiva para evitar o entupimento da micropipeta. </li><li> Usando um micromanipulador, mova o micropipeta na posição logo acima do neurônio-alvo. </li><li> Protocolo para gravações de células inteiras: <ol><li> Aplicar a 10 mseg, 10 mV pulso de onda quadrada (por exemplo, selo de teste) no modo de fixação de tensão do amplificador e ajustar o potencial micropipeta (offset pipeta) do sinal de linha de base para 0 nA. O ensaio de vedação deve também ser usada para determinar se a resistência dos microeléctrodos está dentro da gama desejada (por exemplo, 2-6 mohms). </li><li> Enquanto monitoriza a resistência, usados ​​ajustes finos da micromanipulador para posicionar cuidadosamente a micropipeta sobre a superfície do neurónio alvo. Quando a micropipeta está em contacto com o neurónio, irá aumentar a resistência (por ~ 0,5 a 1 mohms). Eummediately seguindo o aumento da resistência, remover a pressão de fluido positiva e aplicar uma pequena pressão negativa. Uma vez que a resistência passou 10-20 mohms, corrigir o potencial para um nível de retenção (por exemplo, em torno de -60 mV) membrana. </li><li> A resistência do eléctrodo deve continuar a aumentar até exceder um GÊ, o que significa que uma vedação eficaz (denominado «gigaseal &#39;) foi formado entre a membrana celular e micropipeta. Neste ponto, remove toda a pressão do fluido a partir da micropipeta. </li><li> Uma vez que o gigaseal tenha sido formado, o uso de impulsos de corrente de curta duração (25 a 100 ms; +1 V) ou breves impulsos de pressão de fluido negativa a ruptura da membrana celular e obter uma configuração de célula total. </li><li> Gravar a capacitância de membrana, a resistência em série e resistência de entrada, conforme determinado a partir da curva exponencial montado na corrente durante o impulso de teste de vedação. Minimizar os transientes de capacitância, ajustando os controles CpFast e CpSlow no amplificador, então switch no amplificador em modo de células inteiras, e compensar a capacitância e resistência até que uma corrente fixa é observada durante o ensaio de vedação. Aplicar a compensação de resistência em série (~ correção de 70%, a previsão de 70%), o ajuste de capacitância e resistência controles para manter uma resposta selo teste plana. </li><li> Alternar para o modo atual-clamp no amplificador. Tome nota do potencial de repouso (na ausência de injeção de corrente). Ajustar a corrente que prende a estabilizar o potencial da membrana no nível desejado (por exemplo, -60 mV). Neutralizar a capacitância pipeta e ajustar o equilíbrio da ponte para equilibrar a queda de tensão. </li><li> Verifique as propriedades de disparo do neurônio, estimulando com despolarização atual (10-200 pA pA em 10 etapas, 300 ms de duração). </li></ol></li><li><ol><li> Mova a volta de fibra óptica para a posição ao lado do neurônio. Utilizando o software de imagem acoplado a uma câmara CCD captar imagens da posição da fibra em relação ao alvo neuron, incidindo sobre o plano do neurónio, inicialmente, e, em seguida, sobre a borda superior da fibra óptica (ver Figura 1). </li><li> Por análise subsequente das imagens resultantes (por exemplo, Figuras 1B e 1C) é possível determinar com exactidão Δ (a posição do bordo superior da fibra óptica em relação ao centro do neurónio alvo). Depois Δ é conhecido, os parâmetros tais como a distância entre a face da extremidade da fibra para o neurónio alvo (ao longo do eixo da fibra) z e o deslocamento no sentido radial do neurónio a partir do centro do feixe de δ r pode ser calculada usando as relações trigonométricas simples: z = r sin 2θ + Δ cos θ δ r = ((r cos 2θ - Δ sin θ) Ay 2 + 2) 1/2, Ay onde é a distância entre o eixo da fibra e do centro do neurónio, como visto a partir de cima (por exemplo, sie Figura 1). A análise deve levar em conta as variações de posicionamento de célula para célula, como conhecimento exato desses parâmetros de localização pode ser necessária para resolver as possíveis diferenças entre os processos de estimulação 25. </li></ol></li></ol> 4. Experimentos INS <ol><li> Durante a gravação de dados eletrofisiológicos em qualquer pinça de corrente ou configurações braçadeira de tensão, execute o laser de estimulação para os parâmetros desejados (por exemplo, energia, comprimento de pulso, taxa de repetição, etc.) Com a nossa laser, a potência óptica é controlado através de uma entrada direta para o motorista laser e é especificada manualmente antes de cada gravação. Duração do impulso e frequência de repetição pode ser controlada por qualquer um gerador de sinal externo ou o software de aquisição de dados (tal como descrito no passo 2.3.4). Assegure-se que os dados são registados a partir de tanto o canal de fixação de membranas e o canal de gatilho laser. </li></ol> Pulsos de laser com comprimentos que variamde cerca de 500 ms a 15 ms e energias de ~ 0,25-5 mJ por impulso normalmente produzem respostas elétricas mensuráveis. Definindo a taxa de repetição de pulsos de laser para ser 1 Hz ou menos pode ser útil para as experiências iniciais, uma vez que irá minimizar os efeitos deste parâmetro. Os resultados típicos que mostram a variação do sinal gravado é apresentado no seguinte ponto.

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<li>Snyder, A. W., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSnyder%2C+AW+%22Optical+Waveguide+Theory%22">Optical Waveguide Theory</a>. , Chapman and Hall. (1983).</li>
<li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+temporal+effects+of+heating+during+infrared+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).</li>
<li>Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+temperature+jump+by+infrared+diode+laser+irradiation+for+patch-clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies.</a> Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Utilizando os protocolos descritos neste documento, é possível extrair e cultura de neurônios do gânglio espiral e investigar evocadas laser de atividade elétrica através da realização de experimentos de patch clamp de células inteiras. Quando usado in vitro, a técnica de fixação de membranas oferece um nível de controlo sobre os parâmetros experimentais, que não é alcançável in vivo. Parâmetros de estimulação a laser, tais como comprimento de onda, a energia de pulso, comprimento de pulso, a forma de ...

Os campos da neurofisiologia e biônica médica dependem fortemente de técnicas que permitem a estimulação controlável de respostas elétricas no tecido neural. Enquanto a estimulação elétrica continua sendo o padrão ouro em excitação neural, sofre de uma série de inconvenientes, tais como a presença de artefatos de estímulo durante a gravação de respostas neurais, e uma falta de especificidade estimulação devido à propagação de corrente em um tecido circundante. As duas últimas décadas têm visto o desenvolvimento de técnicas de estimulação opticamente mediadas 2. Várias destas técnicas requerem a modificação do tecido-alvo, quer através da adição de uma molécula em particular (por exemplo, moléculas em gaiolas) 3 ou alguma forma de manipulação genética (por exemplo, Optogenetics) 4, nenhum dos quais são fáceis de aplicar do lado de fora de um ambiente de pesquisa. De particular interesse é, por conseguinte, a estimulação neural por infravermelhos (INS), whereby tecido neural é excitado por luz pulsada de laser infravermelho. INS tem o potencial para ultrapassar muitos dos problemas da estimulação eléctrica, permitindo altamente específico, a estimulação não-contacto do tecido neural 2. No entanto, enquanto que o INS tem sido demonstrado com sucesso numa variedade de configurações, in vivo, o mecanismo exacto de excitação permanece incerto. Algumas publicações recentes têm mostrado progresso para desvendar o mecanismo por trás INS 5-7. Aquecimento rápido devido à absorção da luz do laser por água parece desempenhar um papel fundamental. No entanto, para além deste consenso ainda está para ser atingido. Shapiro et ai. 7 propor um mecanismo geral pelo qual altamente rápido aquecimento provoca uma perturbação na distribuição de partículas carregadas adjacentes à membrana celular, conduzindo a uma alteração na capacitância da membrana celular e subsequente despolarização. Além disso, Albert et al. Cinco afirmar que laser aquecimento induzido activa uma classe específica de canais de iões sensíveis à temperatura (receptor de potencial transiente canais vanilóides), permitindo que os iões passam através da membrana celular. Nesta fase, ainda não está claro como esses mecanismos se combinam, ou mesmo se existem outros factores que estão ainda a ser identificado. Apesar de um pequeno número de publicações (Referências 5,7-9) investigaram INS in vitro, a grande maioria dos trabalhos publicados neste campo foi realizado in vivo (por exemplo, as referências 1,6,10-18). Estimulação dos neurônios auditivos infravermelho tem sido uma área de interesse particular, devido às potenciais aplicações em implantes cocleares 10,14-18. Enquanto experimentos in vivo são importantes para verificar a eficácia da técnica em diversas configurações, o aumento do nível de controle oferecido por estudos in vitro deverá levar a uma compreensão mais detalhada do mechnismo responsável pelo INS. Este relatório descreve a preparação de culturas de neurônios do gânglio espiral para as investigações patch clamp, pois estes podem ser usados ​​para estudar os mecanismos fundamentais e ao mesmo tempo ligando para a grande massa de dados existentes no sistema auditivo. A técnica de patch clamp é uma excelente ferramenta para investigações de fenômenos eletrofisiológicos, proporcionando um meio de registrar a atividade elétrica das células individuais e estudar a contribuição das correntes subjacentes individuais 19. Quando esta técnica é aplicada a uma preparação estável na in vitro de neurónios primárias, tais como culturas de neurónios do gânglio espiral, oferece a oportunidade de estudar em profundidade os mecanismos pelos quais a actividade neural é controlada e manipulada. Os protocolos especificados neste trabalho métodos esboço para investigar o efeito da estimulação a laser sobre as propriedades elétricas dos neurônios do gânglio espiral através de patch clampgravações. A abordagem baseia-se um laser de fibra de acoplamento, em vez de um laser de espaço livre, permitindo uma operação mais segura bem como mais fácil e reproduzível de alinhamento sem a necessidade de modificar a configuração do microscópio padrão. Com base nestes protocolos, deverá ser possível realizar uma vasta gama de ensaios de modo a determinar de forma mais clara o mecanismo ou os mecanismos por detrás do INS.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiais e equipamentos de cultura de células </td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Lomb Scientific</td><td>CSC 10 1 GP</td><td></td></tr><tr><td>4-ring cell culture plate </td><td>VWR International</td><td>82050-542</td><td></td></tr><tr><td>Solução de poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Curvo pinça</td><td>WPI</td><td>14101</td><td>Dumont #5 (ponta angular de 45&deg)</td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>ThermoScientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Materiais e equipamentos para cultura de células.</td></tr><tr><td colspan="4">Meios neurobasais</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>N-2 suplemento</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento sem soro</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Solução intracelularCloreto de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>D-gluconato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>LabServ</td><td>BSPPL738.500</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Solução extracelular</forte> </td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>310166</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>383147</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>LabServ</td><td>BSPSL740.500</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2. Soluções para cultura de células e patch clamp. a) Meios neurobasais. b) Solução intracelular. c) Solução extracelular.</td></tr><tr><td>Microscópio vertical</td><td>Zeiss</td><td>AxioExaminerD1</td><td>Equipado com contraste Dodt </td></tr><tr><td>Objetiva de imersão em água</td><td>Zeiss</td><td>W Plan-APOCHROMAT 40x/0,75</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma e estágio X-Y </td><td>ThorLabs</td><td>Burleigh Gibraltar</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de gravação</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de isolamento de vibração</td><td>TMC</td><td>Micro-g 63-532</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos de diagnóstico</td> <td>de câmera</td><td>CCD RT1200</td><td></td></tr><tr><td>Software da câmera</td><td>Instrumentos de diagnóstico</td><td>SPOT Basic</td><td></td></tr><tr><td>In-line solução aquecedor</td> Warner <td></td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Patch braçadeira amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp sistema de aquisição de dados</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-325</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de micropipeta</td><td>Sutter Instruments</td><td>GBF100-58-15</td><td>Vidro de borosilicato com filamento</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Sutter Instruments</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Software de gravação</td><td>AxoGraph</td><td></td><td>Lab pack e ferramentas de eletrofisiologia</td></tr><tr><td>Frasco aspirador</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS12201L</td><td>1 L Frasco aspirador Pyrex, com saída para tubulação</td></tr><tr><td>Tubo PE</td><td>Harvard</td><td>PolyE #340</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica Masterflex</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-07554-85</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 3.Patch clamp equipment.</td></tr><tr><td>1.870 nm diodo laser</td><td>Optotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200/220 &mu; Cabo de remendo de fibra óptica multimodo de diâmetro m (FC/PC)</td><td>AFW Technologies</td><td>MM1-FC2-200/220-5-C-0.22</td><td>Fibra óptica de entrega leve, núcleo de sílica e revestimento, 0,22 NA</td></tr><tr><td>Fibra óptica através do conector (FC/PC)</td><td>Thorlabs</td><td>ADAFC2</td><td></td></tr><tr><td>Cutelo de fibra óptica</td><td>EREM</td><td>FO1</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de decapagem de fibra óptica (0,25 - 0,6 mm) </td><td>Siemens</td><td></td><td>Para remover o revestimento de fibra óptica</td></tr><tr><td>Ferramenta de decapagem de fibra óptica (0,6 - 1,0 mm)</td><td>Siemens</td><td></td><td>Para remover o revestimento externo do patch cord</td></tr><tr><td>Gerador</td><td></td><td></td> de sinal <td>Qualquer gerador de sinal que possa produzir as formas de pulso necessárias e seja capaz de ser acionado externamente</td></tr><tr><td>Posicionador de fibra óptica Posicionador</td><td></td><td></td><td>feito sob medida. Pode substituir o microposicionador padrão usado para experimentos de patch clamp</td></tr><tr><td>Mandril de fibra óptica</td><td>Newport</td><td>FPH-DJ</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de potência a laser e cabeça do detector</td><td>Coherent</td><td>FieldMate (medidor de potência) com LM-3 (cabeça do detector)</td><td></td></tr> <tr><td colspan = "4 ">Tabela 4. Equipamento a laser.< / forte></td></tr></tbody></table>

todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural infrared

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Demonstrou-se em anos recentes que pulsado, o laser de infravermelhos podem ser utilizadas para induzir respostas eléctricas em tecido neural, independente de qualquer outra modificação do tecido alvo. Estimulação neural de infravermelho foi relatada numa variedade de tecido neural periférico e sensorial in vivo, com particular interesse mostrado na estimulação de neurónios do nervo auditivo. No entanto, enquanto que o INS foi mostrado para trabalhar nestas configurações, o mecanismo (ou os mecanismos) pelo qual a luz infravermelha provoca excitação neuronal não é actualmente bem compreendido. O protocolo aqui apresentado descreve um método de fixação de membranas de células inteiras concebido para facilitar a investigação de estimulação neural infravermelhos em cultura neurónios auditivos primários. Por caracterizar completamente a resposta destas células a iluminação laser infravermelho, in vitro, sob condições controladas, pode ser possível obter uma melhor compreensão da physica fundamentaisl e os processos bioquímicos subjacentes estimulação neural por infravermelhos.

Neurónios do gânglio espiral respondem à iluminação laser com formas de onda repetíveis em ambos tensão braçadeira e configurações de gravação actual-clamp. Figura 3a mostra alterações típicas na corrente de fluxo através de uma membrana celular, em resposta a um 2,5 ms, 0,8 mJ impulso laser (de resposta média de 6 pulsos de laser, repetido a intervalos de 1 segundo), com o potencial de membrana realizada a -70 mV, -60 mV e -50 mV. Correntes internas líquidas são constantemente evocadas em resposta a pu...

A estimulação do nervo infravermelho tem sido proposto como uma alternativa para a estimulação eléctrica em uma variedade de tipos de nervos, incluindo os que estão associados ao sistema auditivo. Este protocolo descreve um método de patch clamp para estudar o mecanismo da estimulação do nervo no infravermelho de uma cultura de neurónios auditivos primários.

Todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural Infrared

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

O objetivo geral do experimento a seguir é produzir um sistema modelo para estudar os efeitos da iluminação com laser de infravermelho sobre neurônios auditivos in vitro. Isso é alcançado por meio da técnica de patch clamp, utilizando neurônios auditivos cultivados na configuração de célula inteira, a fim de explorar suas características elétricas. Posteriormente, expor os neurônios à irradiação com laser pode provocar respostas elétricas na célula exposta, as quais podem ser medidas com um arranjo de patch clamp.Os parâmetros de iluminação e as variáveis ambientais podem então ser variados para observar seus efeitos nas respostas elétricas induzidas por laser. Os neurônios auditivos expostos à luz laser exibirão atividade elétrica repetível em resposta a cada pulso laser para análise posterior. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre os mecanismos subjacentes à estimulação infravermelha dos neurônios do gânglio espiral.Embora este método possa fornecer informações sobre a estimulação no infravermelho de células ganglionares espirais especificamente, ele também pode ser estendido a outros tipos celulares ou modelos simplificados, como bicamadas lipídicas, para elucidar ainda mais os processos físicos envolvidos. A demonstração visual deste método é importante para garantir o posicionamento preciso da fibra óptica de entrega de luz, pois a exposição à radiantância resultante é um parâmetro crítico. Prepararam-se micropipetas de gravação com uma resistência de dois a seis megaohms. Elas podem ser puxadas a partir de vidro borossilicato com um puxador a laser de CO2.Prepare o laser com acoplamento por fibra. Uma grande variedade de fibras ópticas pode ser utilizada. Cortar ao meio um cabo de conexão com conectores FCPC produz dois segmentos de fibra, cada um com um conector em uma extremidade e a fibra exposta na outra extremidade.Estas são as cordas. Prepare a ponta da corda removendo a jaqueta da fibra, limpando com etanol e clivando com uma ferramenta apropriada sob um microscópio. Verifique se a ponta é perpendicular ao eixo da fibra e se apresenta uma superfície plana.Conecte a outra extremidade do pigtail de fibra à saída do laser de estimulação utilizando um conector passante apropriado, se necessário. Neste momento, certifique-se sempre de medir a potência do laser na saída da fibra. Faça isso também após quaisquer manipulações adicionais na ponta.Agora, insira a fibra em uma porta-ferramenta e fixe-a ao micro posicionador apropriado. Em seguida, determine o ângulo que a fibra óptica forma com uma lamínula. Tire uma fotografia do arranjo e calcule o ângulo utilizando o ImageJ. Agora, fixe as conexões que sincronizam o laser com o sistema de aquisição de dados do patch clamp.A saída digital do sistema de aquisição de dados do patch clamp deve ser conectada ao laser por meio de um gerador de funções externo, o que permite especificar os parâmetros do pulso de laser independentemente do sistema de aquisição de dados; o sinal usado para disparar o laser deve ser conectado de volta a uma entrada do sistema de aquisição de dados, garantindo que o tempo e a duração dos pulsos de laser possam ser registrados simultaneamente com o sinal eletrofisiológico. Ajuste a taxa de fluxo do sistema de perfusão entre um e dois mililitros por minuto. Um sistema alimentado por gravidade, com um aquecedor em linha para aquecimento rápido da solução e uma bomba peristáltica para remover a solução usada por sucção, funcionará bem. Coloque um lamínula com células cultivadas na câmara de gravação de um microscópio ereto equipado com uma objetiva de imersão em água de alta magnificação e contraste de fase e localize um neurônio do gânglio espiral.Um neurônio típico do gânglio espiral apresenta brilho em fase, formato arredondado e diâmetro aproximado de 15 mícrons, com um núcleo proeminente. Após localizar um neurônio adequado, mude para uma objetiva de menor aumento e localize o neurônio-alvo. Em seguida, utilize o microposicionador para mover a fibra óptica até que a ponta esteja próxima ao neurônio-alvo nos planos horizontal e vertical.Retorne ao objetivo de alta magnificação e posicione a ponta da fibra óptica na posição pretendida ao lado do neurônio. Ao ajustar a posição vertical da fibra, é importante que a borda inferior da fibra repouse sobre a borda da lamínula. Para minimizar a incerteza na localização da fibra, o ponto de contato pode ser identificado a partir de sinais visuais na imagem do microscópio.Uma vez que a fibra esteja posicionada, mova-a para fora por uma quantidade conhecida ao longo de seu eixo longitudinal, de modo a não afetar o posicionamento da micropipeta. A micropipeta deve ser preenchida com solução intracelular e firmemente fixada no suporte do amplificador. Utilizando um tubo conectado ao lado do suporte da microeletrodo, aplique uma pequena quantidade de pressão positiva para prevenir o entupimento da micropipeta.Usando um micromanipulador, mova a micropipeta para a posição logo acima do neurônio-alvo e prossiga com a realização de um selo giga ohm. Registre a capacitância da membrana, resistência em série e resistência de entrada conforme determinado pela curva exponencial ajustada à corrente durante o pulso de teste de selo.Minimize o transitório de capacitância ajustando os controles CP rápido e CP lento no amplificador. Em seguida, mude o amplificador para o modo de célula inteira e modifique a compensação de capacitância e resistência até que uma corrente plana seja observada durante o teste de SELAGEM. A seguir, aplique compensação de resistência série com cerca de 70% de correção e 70% de predição, ajustando os controles de compensação de capacitância e resistência para manter uma resposta plana no teste de selagem.Em seguida, mude o amplificador para o modo de fixação de corrente. Observe o potencial de membrana de repouso na ausência de injeção de corrente. Agora, ajuste uma corrente de sustentação para estabilizar o potencial de membrana no nível desejado.Neutralize a capacitância da pipeta e ajuste o equilíbrio da ponte para compensar a queda de tensão. Verifique as propriedades de disparo do neurônio estimulando com corrente despolarizante. Neste momento, reposicione a fibra óptica de volta à posição ao lado do neurônio utilizando software de imagem acoplado a uma câmera CCD, capturando imagens focadas inicialmente no plano do neurônio e, em seguida, na borda superior da fibra óptica.Analise as imagens para determinar o valor delta, que é a posição da borda superior da fibra óptica em relação ao centro do neurônio-alvo. É muito importante conhecer com precisão a posição da fibra óptica. Isso porque a energia por unidade, área ou exposição à irradiância entregue à célula-alvo é um parâmetro crítico para a estimulação neural por infravermelho, e isso pode ser significativamente afetado pela posição da fibra em relação à célula.Essa potência óptica do laser é controlada por computador por meio de uma entrada direta no laser e pode ser especificada manualmente antes de cada registro. O comprimento do pulso e a taxa de repetição podem ser controlados por meio do gerador de funções conforme descrito anteriormente; certifique-se de que os dados sejam registrados tanto do canal do clamp de patch quanto do canal de disparo do laser, com pulsos de laser de meio a 15 milissegundos e de 0,25 a cinco milijoules. Normalmente, esses parâmetros produzem respostas elétricas mensuráveis. Inicialmente.Pode ser útil definir a taxa de repetição dos pulsos a laser em um hertz ou menos para minimizar efeitos indesejáveis. Após todos os parâmetros do laser terem sido ajustados, prossiga com a coleta de dados.Os neurônios do gânglio espiral respondem à iluminação com laser com formas de onda repetíveis tanto em configurações de gravação com clamp de tensão quanto com clamp de corrente, em resposta a pulsos a laser de 2,5 milissegundos e 0,8 milijoules. Uma célula típica produz uma corrente líquida para dentro em diversos potenciais de retenção. Gravações com clamp de corrente mostram uma despolarização da membrana estável ao longo desses pulsos a laser, seguida por uma diminuição aproximadamente exponencial em direção ao potencial de repouso da membrana após o pulso.Em alguns casos, também há uma pequena despolarização da membrana adicional após o pulso a laser. Iluminar com energia excessiva ou exposição a grandes aumentos de temperatura pode resultar em danos celulares observados por meio da deterioração das propriedades elétricas da célula ou morte celular instantânea. Ao seguir este procedimento, uma variedade de parâmetros ambientais, como temperatura da solução ou fatores químicos, pode ser variada para testar o efeito desses parâmetros na atividade elétrica induzida por laser.Não se esqueça de que trabalhar com lasers pode ser perigoso e que precauções padrão de segurança devem ser adotadas. Essas precauções incluem o uso de óculos de proteção para laser, sinais de advertência e a verificação de que o feixe não intersecte acidentalmente superfícies altamente reflexivas.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Fotoestimulação e gravações de grampo de remendo de células inteiras de neurônios em fatias de hipocampo de camundongos

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Gravações de grampo de remendo de células inteiras em gânglios intactos da raiz dorsal de ratos

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

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Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

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Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

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Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina

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Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro

Aprenda a técnica de patch clamp em células inteiras para investigar a estimulação neural por laser infravermelho em neurônios auditivos primários cultivados. Este método permite analisar respostas elétricas e avançar na neurociência.

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