RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (

Este protocolo em vídeo demonstra técnicas inovadoras para silenciar simultaneamente dois genes em abelhas adultas e, em seguida, realizar um ensaio de resposta de extensão do probóscide ou teste PER para medir o efeito do silenciamento duplo de genes na percepção gustativa de abelhas. Isso é realizado primeiramente pela síntese de RNAs de fita dupla, direcionados aos genes que codificam três proteínas: vitelina, genina, ultrasférica e proteína verde fluorescente.

Como o gene que codifica a GFP não é encontrado no genoma da abelha melífera, o RNA de dupla fita da GFP atua como controle negativo. O segundo passo é injetar o RNA de dupla fita em abelhas melíferas utilizando quatro estratégias de tratamento. Injeção com RNA de dupla fita da GFP, RNA isolado, uma única injeção com uma mistura de RNA de dupla fita de VG e USP, injeção com RNA de dupla fita de vg no primeiro dia, seguida por injeção com RNA de dupla fita de USP no segundo dia, e injeção com RNA de dupla fita de USP no primeiro dia, seguida por injeção com RNA de dupla fita de VG no segundo dia; após as injeções, as abelhas foram marcadas com pontos de tinta coloridos correspondentes aos tratamentos e devolvidas a uma colmeia.

Seis dias depois, a silenciamento dos genes VG e USP nas abelhas tratadas é validado por PCR em tempo real e o efeito do silenciamento duplo de VG e USP na percepção gustativa é determinado pelo ensaio PER. Em última análise, demonstra-se que abelhas com silenciamento duplo apresentam reduções significativas na expressão dos genes VG e USP e aumentos significativos na percepção gustativa à sacarose. Nossa interferência é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para revelar funções gênicas.

É normalmente utilizado para direcionar um único gene. No entanto, os genes fazem parte de uma rede reguladora complexa. Uma maneira de compreender melhor qualquer processo biológico é aprender como os genes interagem com a rede gênica.

Para fazer isso, precisamos manipular múltiplos genes ao mesmo tempo. Até agora, só havíamos conseguido silenciar um gene por vez em insetos; aqui, pela primeira vez, queremos mostrar como silenciar dois genes em abelhas melíferas ao invés de apenas um. O reflexo de extensão do ferrão (PER, na sigla em inglês) é uma técnica muito útil para medir a percepção gustativa, que é um indicador comportamental do comportamento social das abelhas melíferas.

Por exemplo, abelhas operárias com alta percepção gustativa amadurecem cedo em termos de comportamento, iniciam a forrageamento precocemente na vida e têm preferência por coletar pólen. Para iniciar este procedimento, projete primers de RNAs de fita dupla que visem os genes para silenciamento gênico utilizando o software livre Primer.Three. Neste experimento, os dois genes visados para silenciamento são vitelina, genina ou VG e ultrasférico ou USP.

Além do VG e do desenho do USP, os iniciadores de RNA de fita dupla direcionados a um gene controle que codifica a proteína verde fluorescente, ou GFP, que não está presente no genoma da abelha melífera. Posteriormente, a síntese de RNA de fita dupla para VG, USP e GFP é realizada por transcrição in vitro utilizando o sistema de produção de RNA T sete rib max da Promega.

Após purificar os RNAs de dupla fita utilizando procedimentos padrão, dissolva cada pellet de RNA de dupla fita em água livre de nucleases para garantir a eficácia da subregulação gênica; a concentração de RNA de dupla fita deve ser de cerca de nove a 10 microgramas por microlitro. Para preparar as abelhas para injeção, resfrie abelhas recém-emergidas em uma geladeira a quatro graus Celsius por um a dois minutos. Uma vez imobilizadas, monte três a quatro abelhas em paralelo em placas de Petri cheias de cera sólida, utilizando pinos entomológicos cruzados entre seus abdômenes e tórax.

Resfrie novamente as abelhas em uma geladeira de quatro graus Celsius por cerca de um a dois minutos. Certifique-se de que as abelhas estejam completamente imóveis. As abelhas devem parecer soltas, sem estar encolhidas ou contorcidas.

A imobilização completa é importante, pois qualquer movimento pode aumentar o tamanho da ferida e a mortalidade. Abelhas que estejam encolhidas ou contorcidas foram resfriadas por tempo excessivo e não devem ser utilizadas devido à alta mortalidade. Coloque uma agulha descartável de calibre 30 em uma seringa microfinas de Hamilton.

Encha a seringa com três microlitros de RNA de fita dupla e certifique-se de que não haja bolhas de ar na seringa. Se for utilizada uma estratégia de injeção única, a seringa é preenchida com uma mistura dos RNAs de fita dupla dos dois genes. Se for utilizada uma estratégia de injeção em dois dias, a seringa é preenchida com um dos dois RNAs de fita dupla.

Insira a agulha em um lado do abdômen. Para evitar danos aos órgãos internos, pressione lentamente o êmbolo da seringa para permitir que o RNA de fita dupla seja absorvido. Como o RNA de fita dupla é muito viscoso, leva de dois a três segundos para expeli-lo completamente da seringa.

Após empurrar completamente o êmbolo, mantenha a agulha no ferimento por quatro a cinco segundos. Observe as abelhas por três a cinco segundos após as injeções. Se uma gota de hemolinfa vazar do ferimento, descarte a abelha e marque o tórax das abelhas com cores diferentes correspondentes aos diferentes tratamentos.

Neste momento, se a estratégia de injeção única estiver sendo utilizada, observe as abelhas por uma hora em um recipiente com mel fornecido, e então devolva-as à colônia. No entanto, se a estratégia de injeção de dois dias for utilizada e apenas o primeiro RNA de fita dupla tiver sido injetado, coloque as abelhas em uma gaiola de malha cilíndrica com mel fornecido lateralmente. Mantenha as abelhas em uma incubadora a 34 graus Celsius e 80% de umidade durante a noite no dia seguinte.

Injete as mesmas abelhas com o segundo RNA de fita dupla, utilizando o mesmo procedimento empregado para o primeiro RNA de fita dupla. Deixe as abelhas se recuperarem por uma hora à temperatura ambiente em um recipiente com mel fornecido, e então as introduza em uma colônia. Seis dias após as injeções, colete as abelhas tratadas da colônia sem utilizar um fumacê para abrir a colmeia.

A fumaça não é utilizada porque poderia afetar a percepção gustativa das abelhas, que será testada neste procedimento. Colete abelhas em gaiolas de cilindros de malha metálica usando pinças macias, com não mais do que três abelhas por gaiola, para montar as abelhas. Para o ensaio PER.

Resfrie as abelhas a quatro graus Celsius até que fiquem completamente imobilizadas. Posicione cada abelha verticalmente em um tubo plástico, especialmente projetado para PER. Use fita para manter o abdômen dentro do tubo e deixar a cabeça projetada para fora do tubo.

Coloque os tubos em uma grade com duas fileiras de colunas plásticas pequenas. Uma das fileiras é numerada para que as abelhas montadas possam receber um número de identificação. Coloque as grades com as abelhas tratadas em uma incubadora a 34 graus Celsius e 80% de umidade por duas horas enquanto as abelhas estão em incubação.

Prepare uma série de soluções aquosas de sacarose. Carregue as soluções em seringas com agulhas de 15 a 20 polegadas para o ensaio PER.

As abelhas são testadas em grupos. Primeiro, toque a antena de cada abelha com uma gota de solução a 0%, que é água, depois teste com sacarose a 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 0% e 30%. Use soluções aquosas, mantendo um intervalo de pelo menos dois minutos entre cada solução.

Normalmente, leva cerca de dois minutos para testar 20 abelhas usando uma concentração de sacarose. Portanto, deve haver sempre mais de 20 abelhas em cada grupo. Se uma abelha estender completamente seu probóscide, uma resposta positiva é registrada em tempo real.

A análise de PCR confirmou que tanto a estratégia de injeção única quanto a de injeção em dois dias reduziram significativamente os níveis de transcritos de Fiji e USP em abelhas. Seis dias após a injeção do RNA de fita dupla nestes gráficos, a RQ indica o nível de quantificação relativa dos transcritos do gene-alvo e as diferentes letras acima das barras denotam diferenças significativas entre os grupos tratados. A análise pós-teste revelou que a supressão do transcrito de USP utilizando a injeção única com uma mistura de RNA de fita dupla e a injeção em dois dias com VG primeiro e USP depois foi significativamente menor do que a injeção em dois dias com USP primeiro e VG depois.

Isso indica que a VG pode ser um regulador primário no circuito regulatório entre a VG e o hormônio juvenil. Os escores de resposta à GUA ou EGR para as abelhas tratadas foram calculados a partir dos resultados do ensaio de resposta de extensão do probóscide ou REP, conforme mostrado aqui. O EGR nas abelhas que foram injetadas com uma mistura de RNA de fita dupla de VG e USP foi significativamente maior do que o EGR nas abelhas controle GFP, indicando que as abelhas com duplo silenciamento foram mais sensíveis à sacarose.

As diferentes letras acima das barras indicam diferenças significativas entre os grupos tratados. É mostrada aqui uma possível rede regulatória entre vi genin ultras, esférico e hormônio juvenil revelada pela supressão simultânea dos genes VG e USP. Enquanto um silenciamento único de USP não induz qualquer alteração no hormônio juvenil, um duplo silenciamento de VG e USP provoca um aumento maior no hormônio juvenil do que o silenciamento único de VG.

Isso sugere que vitelli não apenas inibe a produção do hormônio juvenil, mas também inibe uma resposta de feedback do hormônio juvenil ao silenciamento de USP. Em silenciamentos duplos, o aumento acentuado da produção do hormônio juvenil resulta de uma inibição reduzida por VI genin causada pelo silenciamento de VG e de uma resposta compensatória a uma transdução reduzida do hormônio juvenil causada pelo silenciamento de USP. Uma discussão mais detalhada dessa rede regulatória encontra-se no texto do protocolo correspondente.

Ao utilizar uma abordagem de silenciamento gênico duplo, revelamos uma relação detalhada entre os genes vitais genic, ultras, spherical e o hormônio juvenil, que não teríamos descoberto ao suprimir apenas um gene. Agora, ao usar esta técnica, os pesquisadores podem explorar a inter-relação entre genes dentro de redes regulatórias. A RP é um método padrão usado para medir a percepção gustativa em abelhas melíferas; no entanto, é muito sensível ao manejo, de modo que é necessário ter muito cuidado para manter a consistência entre o ambiente e o manejo dos animais.

Além disso, se o ensaio for realizado ao longo de vários dias, é recomendável manter uma linha do tempo curta e observar atentamente para garantir que o clima e o ambiente não mudem.