Name: מציאה RNAi בתיווך זוגית גין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש ( אפיס mellifera) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T08:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: למד שיטות RNAi לנוקאאוט זוגי של גנים בדבורי דבש Apis mellifera ומדידת תפיסת טעם באמצעות מבחן PER. פרוטוקול זה מאפשר חקר הרשתות הרגולטוריות הגנטיות המשפיעות על התנהגות הדבורים ומנגנוני הדבורה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לארין Fennern לסיוע לניסוי. עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר של נורבגיה (180,504, 185,306 ו191,699), קרן הצדקה PEW, ומכון הלאומי להזדקנות (NIA P01 AG22500).

חלק 1: מציאה גן כפולה RNAi בתיווך 1. הסינתזה dsRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים עיצוב של dsRNAs מיקוד VG, USP וחלבון בקרה גנטי קידוד ירוק הקרינה (GFP) שהוא לא בדבש דבורי הגנום: Primers תוכננו באמצעות תוכנה החופשית באינטרנט Primer3 <a href="http://frodo.wi.mit.edu/" target="_blank">(http://frodo.wi.mit.edu/)</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינתזת dsRNA לVG, USP ו-GFP: להשתמש במערכת RiboMax T7-RNA ייצור מPromega לשעתוק במבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור dsRNA: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Denaturation וrenaturation: חום dsRNA עד 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולתת לו להתקרר בטמפרטורת חדר במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול אני DNase: להוסיף 1 μl DNase אני לכל תגובת dsRNA ולערבב אותם על ידי מצליף את הצינורות. דגירה במשך 15 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מי nuclease μl 150 ו750 Trizol μl - LS לכל תגובה, ולערבב בעדינות אותם על ידי inverting הצינור. דגירה הדגימות למשך 5 דקות בשעה 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 כלורופורם μl לכל דגימה. מערבבים נמרצות במשך 20 שניות. צנטריפוגה הדגימות במשך 15 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את שלב supernatant לצינור אחד חדש ולהוסיף 500 אלכוהול איזופרופיל μl לתוך צינור אחד. לערבב אותם על ידי צינור היפוך. דגירה את התערובת במשך 20 דקות ב -20 ° C. צנטריפוגה אותו למשך 10 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהשתמש 1,000 75% אתנול לμl לשטוף את הכדור. לאחר centrifuging הצינור במשך 5 דקות ב 7500 XG ב 4 מעלות צלזיוס, אוויר יבש גלולה dsRNA, ולהשתמש במים ללא nuclease לפזר את גלולה. על מנת להבטיח את יעילותו של הגן למטה רגולציה, ריכוז dsRNA צריך להיות בסביבות 9 -10 מיקרוגרם / μl. </li></ol></li></ol> 2. הזרקת בטן dsRNA למציאת גן כפולה, יש שתי אסטרטגיות: 1) זריקה אחת: dsRNA שילוב של שני גנים וinjeCT התערובת, 2) שני ימי הזרקה: להזריק dsRNA הראשונה מיקוד גן אחד ביום הראשון, ולהזריק לתוך dsRNA השני את אותן הדבורים ביום השני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינה שזה עתה יצאה דבורים במקרר 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 דקות. כאשר הדבורים הם משותקים, הר דבורים 3-4 במקביל על צלחות פטרי מלאות בשעווה מוצקה עם סיכות חרקים חצו בין הבטן וthoraces. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצנן את הדבורים שוב ב4 ° C מקרר. ודא שהדבורים הם נייחים לגמרי. זה לוקח בערך 1-2 דקות. הדבורים צריכים להיראות רפויים. אם הדבורים הפכו מסולסלים או מעוותת, זה אומר שהם הקפיאו יותר מדי זמן שיש להימנע. מצמרר יותר מדי גורם לתמותה גבוהה, אבל חוסר תנועה מוחלטת היא חשובה כמו כל תנועה מגבירה את גודל הפצע והתמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים 30 G פנויה מחט (BD) במזרק מייקר המילטון. קח 3 dsRNA μl ולוודא שאין בועת אוויר במזרק. המחט מוחדרת לצד של הבטן, כדי למנוע Damaגינג איברים פנימיים. לחץ על בוכנת המזרק באיטיות כדי לאפשר dsRNA להיקלט. מאז dsRNA הוא צמיג מאוד, זה לוקח 2-3 שניות להיות מגורש לחלוטין מהמזרק. לאחר הלחיצה למטה לחלוטין את הבוכנה, להשאיר את המחט בפצע עבור 4-5 שניות. שים לב לדבורים במשך 3-5 שניות לאחר זריקות. אם hemolymph הדלפות רביב מהפצע, לבטל את הדבורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצבעים שונים כדי לסמן thoraces המתאים לטיפולים שונים. בשלב זה, אם הייתה בשימוש באסטרטגית הזריקה אחת, ניתן להציב בחזרה את הדבורים למושבה לאחר תצפית 1 שעה. עם זאת, אם נעשה שימוש באסטרטגית ההזרקה של יומיים, לאחר שהזריק dsRNA הראשון, הדבורים צריכים להיות ממוקמים בכלוב רשת גליל עם דבש סיפקה בצד ולהיות כל הזמן באינקובטור ב 34 ° C ו 80% לחות . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום השני, בצע את השלבים 2.2 ו 2.3 לצנן את הדבורים בכלובי הרשת ולעלות אותם על צלחות שעווה. לבצע זריקות עם dsRNA השנייה כפי שהוא descriמיטה בשלב 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן לדבורים להחלים בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 ולהציג אותם למושבה. </li></ol> הערה: ניתן לאתר השפעות על ידי מציאה כמותי RT-PCR (qRT-PCR) ומערבי סופג. באופן כללי, יעילות מציאה משתנה ותלויה בגורמים רבים. במחקר שלנו, ניתן לאתר במציאת הגן הכפולה 7 ימים לאחר זריקות בודדות וזריקות של ימים. חלק 2: תגובת assay הארכת החוטם (PER) 1. איסוף דבורים מהכוורת ביום 6 לאחר הזריקות, לאסוף דבורים שטופלו מהמושבה ללא שימוש מעשן. איסוף דבורים בכלובי צילינדר רשת מתכת. שמור על 3 דבורים בכל כלוב. 2. דבורי הרכבת PER לצנן את הדבורים על 4 מעלות צלזיוס עד שהם משותקים לחלוטין. הר דבורה כל אחד בצורה אנכית לתוך צינור פלסטיק שתוכנן במיוחד לPER. שמור על הבטן בתוך הצינור על ידי מנצליםשתי חתיכות קטנות של קלטת גרם, ולשמור את הראש המבצבץ של הצינור. לשים את הצינורות על מדף עם שתי שורות עמודי פלסטיק קטנים, ולהקצות לכל צינור (דבורה) עם מספר תעודת זהות. ואז לשים את הדבורים שטופלו על המדפים לתוך אינקובטור (34 מעלות צלזיוס ולחות% 80) ולשמור אותם בחממה במשך שעה 2. 3. הכנת סדרה של פתרונות מים סוכרוז הכן 0%, 0.1%, 0.3%, 1%, 3%, 10% ופתרונות מים סוכרוז 30% ולטעון את פתרונות למזרקים עם מחטי G 15-20. 4. PER Assay לגעת באנטנה של הדבורה עם טיפה של פתרון 0% (מים) ואחריו 0.1%, 0.3%, 1%, 3%, 10% ופתרונות מים סוכרוז 30%. לבדוק את כל הדבורים עם מים הראשון ולאפשר משמש לפחות שתי דקות בפרק הזמן שבין כל פתרון. לכן, בדרך כלל יש לנו לפחות 20 דבורים לכל ניסוי. אם דבורה משתרעת במלוא חוטמה, תגובה חיובית נספר. 5.ניהול נתונים לסכם את התגובות החיוביות הכולל עבור כל אחד ואחד לציון התגובה התעורר אצלם (GRS). בצע ניתוח סטטיסטי מתאים על הנתונים. חלק 3. אימות מציאה גן גופי שומן הם גזורים מקבוצה נוספת של דבורים שטופלו ישנים 7 ימים. הליך Trizol סטנדרטי משמש להפקת RNA, אשר מלווה DNase טיפול אני 24. VG וביטוי גני USP מנותח על ידי qRT-PCR. אקטין שני שלבים משמש כגן התייחסות מאז יש לו ביטויים יציבים ברקמות שונות של דבורי דבש. primers PCR בזמן אמת פורסם לVG וUSP גן משמש בניסוי הזה 24. הנתונים נותחו באמצעות שיטת דלתא דלתא-CT 25.

<ol><li>Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+Argonaute+proteins+in+small+RNA-directed+RNA+cleavage+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways.</a> Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+RNAi+for+the+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Mammalian RNAi for the masses.</a> Trends Genet. 19, 9-12 (2003).</li>
<li>Huvenne, H., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+dsRNA+uptake+in+insects+and+potential+of+RNAi+for+pest+control%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review.</a> J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).</li>
<li>Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+developmental+gene+silencing+in+the+honey+bee+using+a+homeobox+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif.</a> Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).</li>
<li>Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+vitellogenin+gene+function+in+adult+honeybees+by+intra-abdominal+injection+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA.</a> BMC Biotechnol. 3, 1(2003).</li>
<li>Patel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+a+queen%3A+TOR+pathway+governs+diphenic+caste+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development.</a> PLoS ONE. 6, e509(2007).</li>
<li>Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+vitellogenin+gene+activity+increases+the+gustatory+responsiveness+of+honey+bee+workers+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera).</a> Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+honey+bee+IRS+gene+biases+behavior+toward+food+rich+in+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein.</a> PLoS Genet. 6, e1000896(2010).</li>
<li>Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+perception+and+fat+body+energy+metabolism+are+jointly+affected+by+vitellogenin+and+juvenile+hormone+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees.</a> PLoS Genet. 8, e1002779(2012).</li>
<li>Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+dsRNA+into+Female+A.+aegypti+Mosquitos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos.</a> J. Vis. Exp. (5), e215(2007).</li>
<li>Mussig, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+disruption+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR1+in+the+honeybee+brain+selectively+impairs+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation.</a> J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).</li>
<li>Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+gene+knock-down+by+a+single+lentiviral+vector+expressing+an+array+of+short+hairpin+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs.</a> Electron J. Biotechnol. 19, 13(2006).</li>
<li>Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-miRNA+hairpin+method+that+improves+gene+knockdown+efficiency+and+provides+linked+multi-gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech%22%5BJournal%5D)">Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown.</a> Biotech. 41, 59-63 (2006).</li>
<li>Ament, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+ultraspiracle+influences+honey+bee+social+behavior+and+behavior-related+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression.</a> PLoS Genet. 8, e1002596(2012).</li>
<li>Amdam, G. V., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hive+bee+to+forager+transition+in+honeybee+colonies%3A+the+double+repressor+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis.</a> J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).</li>
<li>Pankiw, T., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+to+sucrose+predict+foraging+division+of+labor+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Ecol.+Sociobiol%22%5BJournal%5D)">Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).</li>
<li>Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+communal+crop%3A+modulation+of+sucrose+response+thresholds+of+pre-foraging+honey+bees+with+incoming+nectar+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Ecol.+Sociobiol%22%5BJournal%5D)">The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).</li>
<li>Jaycox, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Changes+in+Worker+Honey+Bees+%28Apis+mellifera+L.%29+after+Injection+with+Synthetic+Juvenile+Hormone+%28Hymenoptera%3A+Apidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Kan.+Entomol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae).</a> J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).</li>
<li>Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+changes+in+worker+honey+bees+%28Apis+mellifera%29+induced+by+injections+of+a+juvenile+hormone+mimic%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic.</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).</li>
<li>Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+pharmacology+of+octopamine%2C+tyramine+and+dopamine+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees.</a> Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).</li>
<li>Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+juvenile+hormone+analogue+on+honey+bee+foraging+behaviour+and+alarm+pheromone+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production.</a> J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).</li>
<li>Giurfa, M., Malun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+mechanosensory+conditioning+of+the+proboscis+extension+reflex+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Lear+Memory%22%5BJournal%5D)">Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees.</a> Lear Memory. 11, 294-302 (2004).</li>
<li>Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+genotype%2C+foraging+role%2C+and+sucrose+responsiveness+on+the+tactile+learning+performance+of+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.).</a> Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDK1+and+HR46+gene+homologs+tie+social+behavior+to+ovary+signals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals.</a> PLoS ONE. 4, e4899(2009).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+behaviorally+associated+gene+networks+in+worker+honey+bee+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries.</a> J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).</li>
<li>Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+social+behaviour+derived+from+maternal+reproductive+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits.</a> Nature. 439, 76-78 (2006).</li>
<li>Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmdam%2C+GV+%22Hormones%2C+Brain+and+Behavio%22">Hormones, Brain and Behavio</a>. Pfaff, D., et al. , Elsevier Academic Press. (2009).</li>
<li>Guidugli, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitellogenin+regulates+hormonal+dynamics+in+the+worker+caste+of+a+eusocial+insect%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect.</a> FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).</li>
<li>Corona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((juvenile+hormone%2C+insulin+signaling%2C+and+queen+honey+bee+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).</li>
<li>Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+scan+for+cis-regulatory+DNA+motifs+associated+with+social+behavior+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).</li>
<li>Amdam, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+control+of+the+yolk+precursor+vitellogenin+regulates+immune+function+and+longevity+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees.</a> Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).</li>
<li>Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+antiviral+weapon+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">RNA interference: antiviral weapon and beyond.</a> World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).</li>
<li>Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Argonaute+family%3A+tentacles+that+reach+into+RNAi%2C+developmental+control%2C+stem+cell+maintenance%2C+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis.</a> Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).</li>
<li>Hunt, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genomics+of+honeybee+foraging+and+nest+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense.</a> Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).</li>
<li>Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+sucrose+response+thresholds+in+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%3A+influence+of+genotype%2C+feeding%2C+and+foraging+experience%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience.</a> J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).</li>
<li>Pankiw, T., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pheromones%2C+hormones%2C+and+handling+on+sucrose+response+thresholds+of+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A.+Neuroethol.+Sens.+Neural.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).</li>
</ol>

אין לנו מה לחשוף.

המחקר שלנו הוא המאמץ הראשון לדפוק בו זמנית במורד שני גנים בחרקים בוגרים. התוצאות שלנו מראות כי שתי האסטרטגיות של dsRNA זריקות (זריקה אחת וזריקה של יומיים) הן יעילות לדיכוי הגן הכפול, והשתקת גנים בו זמנית של VG וUSP ניתן לבדוק 6 ימים לאחר הזריקות לתוך dsRNA דבורים 8,9. עם זאת, יעילות מציאה הגן משתנה במינים חרקים שונים בהתאם לרמת תעתיק של גן המטרה, שיעורי מחזור החלבון ויעילות ספיגה dsRNA על ידי תאים או איברים. בנוסף, ההשפעה של RNAi היא תלויה במינון. מצאנו דבורה ש...

התערבות RNA (RNAi) היא השתקת RNA המבוסס לאחר תעתיק גן, אשר מתרחשת במגוון רחב של אורגניזמים אוקריוטים. התהליך של RNAi מופעל על ידי אנדוגני או אקסוגני RNA (dsRNA) מבשרי פעמיים תקועים. DsRNA מפעילה דייסר חלבון ribonuclease אשר נקשר ודבק dsRNA לרסיסים קטנים (20-25 נקודות בסיס). ואז את שברים הקטנים של מדריך dsRNA הכרה ומחשוף של mRNAs משלימה על ידי חלבוני argonaute, מרכיב הקטליטי של RNA-Induced השתקה מורכב (RISC) 1. ביונקים, dsRNAs ארוכה יותר מ -30 NT, להפעיל תגובה אנטי (תגובת אינטרפרון, IFN) שמובילה להשפלה ספציפיות של RNA תעתיקים 2. עם זאת, dsRNAs הארוך הוכיח להיות יעיל וספציפי בחרקים שכן יש חוסר של IFN זה 3. dsRNAs ארוך היה בשימוש במשך downregulation של גני המטרה במינים חרקים שונים. דבורי דבש הם אחד Pionאורגניזמים חרקים EER שבו פונקציות של גנים רבים וחשובים בהתפתחות וההתנהגות נחשפו באמצעות dsRNA 4,5. שיטות משלוח dsRNA כמה בוצעו בדבורי דבש: האכלת dsRNA יעילות downregulates ביטוי גן המטרה בדבש זחלי דבורה 6, ואילו הזרקת dsRNA היא גישה יעילה למציאת גן בעוברי דבורת דבש ודבורים 4 מבוגרים 7,8. השפעות מציאה הגן הוצגו על ידי יישום dsRNA לחרקים הן זמניות ומקומיות. מחקרים הראו כי שתי זריקות dsRNA בטן וזריקות dsRNA בית חזה בצורה יעילה לדכא את ביטוי גן המטרה בתאי גוף שומן בבטן של חרקים 9,10. DsRNA מוזרק לתוך חללי בטן ובית החזה ותאי שומן בגוף הם מסוגל לקחת את dsRNA מhemolymph שבו התאים הם רחצו 10. עם זאת, לא יכולים להיות ממוקדים הגנים באיברים אחרים, כגון השחלות ומוח, או על ידיזריקות בטן או בית החזה. על מנת למקד את גנים במוח דבורת דבש, הזרקת המוח של dsRNA יש גם ביצע, אשר למעשה משפיע על ביטוי גני היעד באזורים במוח מקומי 11. כאן, אנו לתעד הזרקת dsRNA בטן שהיא נפוצה יותר בדבורי דבש למבוגרים בלבד. RNAi כבר משמש בעיקר כדי למקד את גן יחיד וכבר כלי רב עוצמה כדי לחשוף את תפקוד הגן. עם זאת, כל גן אינו מבודד מאחרים, הוא ברשתות רגולציה מורכבות. מפתח להבנת תהליך ביולוגי הוא לנתח כיצד גנים לתקשר אחד עם השני, שדורש מניפולציות בו זמניות של מספר רב של גנים ולא במציאת גן יחידה. בשורות תאי יונקים, מדענים הצליחו בגנים של שניים או שלושה בו זמנית על ידי שימוש בעיכוב אספקת מערכות 12 או עיצובים חדים רב microRNA (מירנה) 13. אבל בחרקים, knockdowns גנים מרובים עדיין לא נבדק. כאן, אנו presenאסטרטגיות שונות להזרקת t אשר יכול להשיג מציאה גן כפולה. אנחנו למקד שני גנים: vitellogenin (טוב מאוד) אשר מקודד חלבון מקדים חלמון, וultraspiracle (USP) אשר מקודד קולט משוער להורמון נעורים (JH) ועשויה לשמש כגורם שעתוק מתווך תגובות לJH 14 בדבורי דבש. VG וJH לווסת את זה בלולאת משוב 15 ומעורבים בדבש דבורים התנהגותי בתקנה 9. באמצעות מציאה הגן הכפולה, אנחנו להפריע גם מסלולי JH VG ו, ולגלות כיצד הם משפיעים על התנהגות במשותף דבש דבורים ופיזיולוגיה ואיך VG, USP וJH אינטראקציה 9. בחוש הטעם הוא מנבא התנהגות לדבורת דבש התנהגות חברתית 16. במונחים של פיתוח, דבורים התנהגותיות קן עם בחוש טעם גבוה התנהגותית מהירה הבוגר, ובדרך כלל מספוא השלב מוקדם בחיים ומעדיפים לאסוף אבקה 16,17. למרות מ &#39;לתקנותechanisms העומד בבסיס תפיסה התעוררה אצלם עדיין אינו ברור, מחקרים הראו כי תפיסה התעוררה אצלם קשורה לחילוף החומרים פנימיים אנרגיה 9, פרשה הורמונלית 18,19 וbiogenetic אמין מסלולי 20. שניהם VG וJH הם רגולטורים הורמונליים חשובים תפיסה 7,21 ויסות התעוררה אצלם. במעבדה, וריאציה של תפיסה התעוררה אצלם בדבורי דבש יכולה להיות מוערכת על ידי בדיקת תגובת הארכה חוטם (PER) לסוכרוז פתרונות שונים. כל דבורה היא נבדק על ידי נגיעה גם האנטנות שלה עם טיפה של מים ואחריו סדרה עולה ריכוז של 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30% סוכרוז. תגובה חיובית יצוין אם דבורה משתרעת במלוא חוטמה, כאשר טיפה של מים או סוכרוז היא נגעה לכל אנטנה. בהתבסס על המספר של תגובות חיוביות לפתרונים, ניתן לקבוע את רמת בחוש טעמו של כל אדם 16. עם זאת, היישום של PER אינו מוגבל למדידה גרםתפיסת ustatory. PER הוא גם שיטה יעילה כדי לבחון את המצב מטבולי של דבורים כגון שובע לעומת רעב. את הדבורים בתגובה חזק יותר לסוכרוז הם רעבים יותר באופן כללי (וואנג וAmdam, נתונים שלא פורסמו). יתר על כן, הפרדיגמה לכל יכולה לשמש גם בלמידה ובזיכרון אסוציאטיביים בדבורי דבש. במקרה זה דבורים יוכשרו לשייך את הנוכחות של המים סוכרוז עם ריח. כאשר הדבורים ללמוד עמותה, רק הנוכחות של הריח יכולה לעורר תגובה חיובית חוטם בלי לתגמל אותם עם סוכרוז 22,23. בסרטון הזה, אנו מראים כיצד לבצע PER להעריך בחוש טעם אשר כבר מחובר עם מציאה כפולה VG וUSP במחקר קודם 9.

<table><tbody><tr><td>GE Healthcare PCR חרוזים בצלחת 96 באר</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9557-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR ערכת טיהור</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>RiboMax T7 מערכת ייצור RNA</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם: אלכוהול איזואמיל 24: 1</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>המילטון מיקרו מזרק</td><td>המילטון</td><td>80301</td><td></td></tr><tr><td>30 גרם BD מחטים חד פעמיות</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>BD Biosciences</td><td>30960</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה סטריאו</td><td>Leica Microsystems</td>סיכות חרקים <td>S6D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>צלחת</td><td></td><td></td><td></td> שעווה</tr></tbody></table>

מציאה rnai בתיווך זוגית ג&#39;ין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש (<em&gt; אפיס mellifera</em&gt;)

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

וידאו זה מדגים טכניקות חדשניות של התערבות RNA (RNAi) אשר downregulate שני גנים בו זמנית בשימוש בדבורי דבש פעמיים התקועות RNA (dsRNA) זריקות. הוא גם מציג פרוטוקול של הארכת תגובת חוטם (PER) assay למדידת בחוש טעם. מציאה גן RNAi בתיווך היא טכניקה יעילה downregulating ביטוי יעד גן. טכניקה זו משמשת בדרך כלל למניפולצית גן יחידה, אך יש לו מגבלות לזהות אינטראקציות והשפעות משותפות בין גנים. בחלקו הראשון של הסרטון הזה, אנו מציגים שתי אסטרטגיות כדי להפיל בו זמנית שני גנים (הנקרא מציאה גן כפולה). אנחנו מראים את שתי האסטרטגיות מסוגלים לדכא ביעילות שני גנים, vitellogenin (טוב מאוד) וultraspiracle (USP), הנמצאים בלולאת משוב רגולטורים. גישת מציאה הגן הכפולה הזה יכול לשמש כדי לנתח יחסי גומלין בין הגנים ויכולה להיות מיושמת בקלות במיני חרקים שונים. בחלקו השני של הסרטון הזה הוא הפגנה של תגובת assay הארכת חוטם (PER) בדבורי דבש לאחר הטיפול במציאת גן כפול. Assay PER הוא מבחן סטנדרטי למדידת בחוש טעם בדבורי דבש, אשר הוא מנבא מפתח עבור כמה מהר התבגרות ההתנהגות של דבורת דבש היא. בחוש טעם גדול יותר של דבורי קינון מצביע על התפתחות התנהגותית שעלתה קשורה לעתים קרובות עם גיל מוקדם יותר בתחילתו של חיפוש אחר מזון וליקוט התמחות באבקת פרחים. בנוסף, יכול להיות מיושם לכל assay לזהות מדינות המטבולית של שובע או רעב בדבורי דבש. לבסוף, לכל assay בשילוב עם זיווג גירויי ריח שונים למיזוג הדבורים גם בשימוש נרחב ללמידה ולזכרון מחקרים בדבורי דבש.

<html> שתי יום הזרקת אסטרטגיות שניהם ההזרקה חד והקטינו VG (כיוון אחד ANOVA, p &lt;0.001) (איור 2 א) וUSP (כיוון אחד ANOVA, p &lt;0.001) (איור 2) באופן משמעותי את רמות תמליל בדבורי דבש שישה ימים לאחר שהוזרק dsRNA. דיכוי תמליל USP באמצעות זריקה אחת עם תערובת dsRNA וההזרקה של יומיים עם VG הראשון וUSP השני (טוב מאוד / USP) היה נמוך באופן משמעותי מההזרקה של יומיים עם USP הראשון והשנ...

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שתי אסטרטגיות שבו זמנית לדכא שני גנים (מציאה גן כפולה) בדבורי דבש. לאחר מכן אנו מציגים כיצד להשתמש בסיומת תגובת חוטם (PER) assay כדי לחקור את ההשפעה של מציאה גן כפולה על תפיסה התעוררה אצל דבורת דבש.

מציאה RNAi בתיווך זוגית ג&#39;ין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש (<em&gt; אפיס mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

פרוטוקול וידאו זה מדגים טכניקות חדשניות להשקתה (knock down) סימולטנית של שני גנים בדבורי דבש בוגרות, ולאחר מכן ביצוע בדיקת תגובת פריסת חוטם (PER assay) למדידת ההשפעה של השהקתת הגנים הכפולה על התפיסה הטעמית של דבורי הדבש. דבר זה מושג תחילה על ידי סינתזה של RNAs רב-גדיליים, המכוונים לגנים של שלושה חלבונים: vitelli, genin, ultras, spherical, וחלבון פלואורסצנציה ירוק.כיוון שהגן המקודד ל-GFP אינו נמצא בגנום של דבורת הדבש, ה-RNA דו-גדילי של GFP משמש כביקורת שלילית. השלב השני הוא הזרקת RNA דו-גדילי לדבורי דבש באמצעות ארבע אסטרטגיות טיפול: הזרקה של RNA דו-גדילי של GFP בלבד; הזרקה בודדת של תערובת RNA דו-גדילי של VG ו-USP; הזרקה של RNA דו-גדילי של vg ביום הראשון, ולאחריה הזרקה של RNA דו-גדילי של USP ביום השני; והזרקה של RNA דו-גדילי של USP ביום הראשון, ולאחריה הזרקה של RNA דו-גדילי של VG ביום השני. לאחר ההזרקות, סומנו הדבורים בנקודות צבע מקודדות בהתאם לטיפולים והוחזרו לכוורת.שישה ימים לאחר מכן, השהיית הביטוי (knockdown) של הגנים VG ו-USP בדבורים המטופלות מאומתת באמצעות real-time PCR, והשפעתו של knockdown כפול של VG ו-USP על התפיסה הטעמית נקבעת באמצעות בדיקת PER. לבסוף, נמצא כי לדבורים עם knockdown כפול יש ירידה משמעותית בביטוי של הגנים VG ו-USP ועלייה משמעותית בתפיסה הטעמית לסוכרוז. ההשבשה שביצענו היא כלי רב עוצמה שבו אנו יכולים להשתמש כדי לחשוף תפקודי גנים.בדרך כלל משתמשים בשיטה זו כדי להתמקד בגן בודד. עם זאת, גנים הם חלק מרשת רגולטורית מורכבת. דרך אחת שבה נוכל להבין טוב יותר כל תהליך ביולוגי היא ללמוד כיצד גנים מקיימים אינטראקציה עם רשת גנים.כדי לעשות זאת, עלינו לבצע מניפולציה של מספר גנים בו-זמנית. עד כה, יכולנו להשתיק גן אחד בלבד בכל פעם בחרקים; כאן, בפעם הראשונה, אנו רוצים להראות לכם כיצד לבצע knockdown לשני גנים בדבורי דבש במקום לאחד. רפלקס הרחקה של ה-SCU, או PER, הוא טכניקה שימושית מאוד למדידת תפיסה טעמית, המהווה מנבא התנהגותי להתנהגות חברתית של דבורי דבש.לדוגמה, דבורי קן בעלות תפיסה טעמית גבוהה, מבשילות מבחינה התנהגותית במהירות, יוצאות לאסוף מזון בשלב מוקדם של חייהן, ומעדיפות לאסוף אבקה. כדי להתחיל בהליך זה, תכננו פריימרים של RNAs דו-גדיליים המכוונים לגנים המיועדים להשתקה (knockdown) באמצעות התוכנה החינמית primer.Three. בניסוי זה, שני הגנים המיועדים להשתקה הם vitelli, genin, או VG ו-ultras spherical או USP.בנוסף לעיצוב של VG ו-USP, תוכננו פריימרים עבור RNA דו-גדילי המכוון לגן בקרה המקודד לחלבון פלואורסצנציה ירוקה, או GFP, אשר אינו קיים בגנום של דבורת הדבש. לאחר מכן, סינתזת ה-RNA הדו-גדילי עבור VG, USP ו-GFP בוצעה באמצעות תמלול in vitro תוך שימוש במערכת RibMax T7 לייצור RNA מבית Promega.לאחר טיהור ה-RNAs בעלי הגדיל הכפול באמצעות פרוצדורות סטנדרטיות, המיסו כל משקע של RNA דו-גדילי במים נטולי נוקלאז. כדי להבטיח את יעילות ההשתקה של הגן, ריכוז ה-RNA הדו-גדילי צריך להיות סביב 9 עד 10 µg/µL. כדי להכין את הדבורים להזרקה, קררו דבורים שזה עתה בקעו במקרר בטמפרטורה של 4 °C למשך דקה אחת עד שתיים. ברגע שהדבורים מקובעות, הצמידו שלוש עד ארבע דבורים במקביל על צלחות פטרי מלאות בשעווה מוצקה, כאשר סיכות לחרקים חוצות בין הבטן לחזה שלהן.קררו שוב את הדבורים במקרר בטמפרטורה של 4 °C למשך כדקה עד שתיים. ודאו שהדבורים אינן נעות כלל. הדבורים צריכות להיראות רפויות, ולא מכווצות או מעוותות.קיבוע מלא הוא חשוב, כיוון שכל תנועה עלולה להגדיל את גודל הפצע ואת התמותה. דבורים שהן מכופפות או מעוותות קוררו למשך זמן רב מדי ואין להשתמש בהן בשל שיעור תמותה גבוה. הרכיבו מחט חד-פעמית במידה 30 gauge על מזרק מיקרו של Hamilton.מלאו את המזרק ב-3 µL של RNA דו-גדילי וודאו שאין בועות אוויר במזרק. אם נעשה שימוש באסטרטגיית הזרקה בודדת, מלאו את המזרק בתערובת של ה-RNA הדו-גדילי של שני הגנים. אם נעשה שימוש באסטרטגיית הזרקה של יומיים, מלאו את המזרק באחד משני סוגי ה-RNA הדו-גדילי.החדירו את המחט לצד הבטן. כדי למנוע נזק לאיברים פנימיים, לחצו על בוכנת המזרק לאט כדי לאפשר את ספיגת ה-double stranded RNA. מכיוון ש-double stranded RNA הוא צמיגי מאוד, נדרשות שתי עד שלוש שניות כדי להוציא אותו לחלוטין מהמזרק.לאחר לחיצה מלאה על הבוכנה, השאירו את המחט בפצע למשך ארבעה עד חמישה שניות. עקבו אחר הדבורים למשך שלוש עד חמש שניות לאחר ההזרקות. אם דליפת טיפת המולימפה מהפצע, השליכו את הדבורה; סמנו את התורקס של הדבורים בצבעים שונים התואמים לטיפולים השונים.בשלב זה, אם נעשה שימוש באסטרטגיית הזרקה בודדת, יש להשגיח על הדבורים במשך שעה אחת בתוך מיכל שסופק בו דבש, ולאחר מכן להחזירן למושבה. עם זאת, אם נעשה שימוש באסטרטגיית הזרקה של יומיים ורק ה-double stranded RNA הראשון הוזרק, יש להניח את הדבורים בכלוב רשת גלילי שסופק בו דבש בצד. יש לשמור את הדבורים באינקובטור בטמפרטורה של 34 °C ובלחות של 80% למשך הלילה ועד ליום המחרת.הזריקו לדבורים את ה-RNA דו-גדילי השני, תוך שימוש באותו נוהל שבו נעשה שימוש עבור ה-RNA דו-גדילי הראשון. אפשרו לדבורים להתאושש בטמפרטורת החדר למשך שעה בתוך מיכל עם דבש זמין, ולאחר מכן החזירו אותן למושבה. שישה ימים לאחר ההזרקות, אספו את הדבורים המטופלות מהמושבה, ללא שימוש במכשיר עישון לפתיחת הכוורת.לא נעשה שימוש בעשן מכיוון שהוא עלול להשפיע על התפיסה הגסטטורית (טעם) של הדבורים, אשר תיבדק בהליך זה. אספו דבורים לתוך כלובים בצורת גליל מרשת מתכת באמצעות פינצטה רכה, תוך השמה של לא יותר משלוש דבורים לכל כלוב, לצורך ביצוע בדיקת ה-PER.קררו את הדבורים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עד שיהיו מוטמעות לחלוטין. הצמידו כל דבורה בצורה אנכית לתוך פרובטת פלסטיק, שתוכננה במיוחד עבור PER. השתמשו בסרט דבק כדי להחזיק את הבטן בתוך הפרובטה ולהשאיר את הראש בולט ממנה.הניחו את המבחנות על מתאם בעל שתי שורות של עמודי פלסטיק קטנים. אחת השורות ממוספרת כדי שניתן יהיה להקצות מספר זיהוי לדבורים המורכבות. הכניסו את המתאמים עם הדבורים שעברו טיפול לאינקובטור בטמפרטורה של 34 °C ובלחות של 80% למשך שעתיים בזמן שהדבורים עוברות אינקובציה.הכינו סדרה של תמיסות סוכרוז במים. העבירו את התמיסות למזרקים עם מחטים בכיול 15 עד 20 gauge עבור בדיקת ה-PER.הדבורים נבדקות בקבוצות. ראשית, נגעו במחוש של כל דבורה עם טיפה של תמיסת 0%, שהיא מים, ולאחר מכן בצעו בדיקה עם תמיסות סוכרוז בריכוזים של 0.1%, 0.3%, 1%, 3%, 10% ו-30%. השאירו לפחות שתי דקות של מרווח בין כל תמיסת מים.בדרך כלל נדרשות כשתי דקות לבדיקת 20 דבורים באמצעות ריכוז אחד של סוכרוז. לכן, תמיד צריכות להיות יותר מ-20 דבורים בכל קבוצה. אם דבורה פולשת את ה-proboscis שלה במלואה, הדבר נספר כתגובה חיובית. בזמן אמת.ניתוח PCR אישש כי הן אסטרטגיית ההזרקה הבודדת והן אסטרטגיית ההזרקה ביומיים הפחיתו באופן משמעותי את רמות התעתוק של Fiji ו-USP בדבורי דבש. שישה ימים לאחר ההזרקה של ה-RNA דו-גדילי, בגרפים אלה, ה-RQ מציין את רמת הכימות היחסי של תעתוקי הגן המטרה, והאותיות השונות מעל העמודות מציינות הבדלים מובהקים בין קבוצות הטיפול. ניתוח post-hoc גילה כי דיכוי תעתוק USP באמצעות הזרקה בודדת של תערובת RNA דו-גדילי והזרקה ביומיים שבה VG הוזרק ראשון ו-USP שני, היה נמוך באופן משמעותי מהזרקה ביומיים שבה USP הוזרק ראשון ו-VG שני.דבר זה מעיד על כך ש-VG עשוי להיות ווסת מרכזי בלולאת הבקרה של VG והורמון הנעורים. מדדי התגובה של GUA או ה-GRS עבור הדבורים שעברו טיפול חושבו מתוצאות של מבחן תגובת פרישת השפה (proboscis extension response) או מבחן PER כפי שמוצג כאן. ה-GRS בדבורים שהוזרקו תערובת של RNA דו-גדילי עבור VG ו-USP היה גבוה משמעותית מה-GRS בדבורי הביקורת שקיבלו GFP, מה שמעיד על כך שהדבורים עם ה-double knockdown היו רגישות יותר לסוכרוז.האותיות השונות מעל העמודות מצביעות על הבדלים מובהקים בין קבוצות הטיפול. מוצגת כאן רשת רגולטורית אפשרית בין vi genin ultras, spherical, ו-juvenile hormone שנחשפה על ידי השתקה סימולטנית של הגנים VG ו-USP. בעוד ש-knockdown בודד של USP אינו גורם לשינוי כלשהו ב-juvenile hormone, double knockdown של VG ו-USP גורם לעלייה גדולה יותר ב-juvenile hormone מאשר knockdown בודד של VG.דבר זה מרמז כי vitelli לא רק מעכב את ייצור ההורמון הגדילתי (juvenile hormone), אלא מעכב תגובת משוב של ההורמון הגדילתי ל-knockdown של USP. ב-double knockdowns, העלייה הדרמטית בייצור ההורמון הגדילתי נובעת מעיכוב מופחת של VI genin הנגרם על ידי knockdown של VG, ומתגובה מפיתה להפחתה בהעברת המסר של ההורמון הגדילתי הנגרמת על ידי knockdown של USP. דיון מפורט יותר ברשת בקרה זו מופיע בטקסט של הפרוטוקול הנלווה.באמצעות שימוש בגישה של השתקה כפולה של גנים, חשפנו קשר מפורט בין הגנים vital, ultras, spherical ו-juvenile hormone, קשר שלא היינו מגלים לו היינו מדכאים גן אחד בלבד. כעת, באמצעות שימוש בטכניקה זו, חוקרים יכולים לבחון את יחסי הגומלין בין גנים בתוך רשתות בקרה. PR היא שיטה סטנדרטית המשמשת למדידת תפיסה טעמית בדבורי דבש, עם זאת, היא רגישה מאוד לאופן הטיפול, ולכן יש לנקוט זהירות רבה בשמירה על עקביות בין הסביבה לבין הטיפול בבעלי החיים.בנוסף, אם הניסוי יבוצע לאורך מספר ימים, מומלץ לנהל לוח זמנים קצר ולעקוב כדי לוודא שהמזג האוויר והסביבה אינם משתנים.

rnai-mediated-double-gene-knockdown-gustatory-perception-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מדגימים כיצד להשתמש בטכניקת RNAi ההאכלה להפיל גני המטרה ופנוטיפ גודל גוף...

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

בעוד dsRNA ההאכלה בג elegans הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך את תפקוד גן, פרוטוקולים הנוכחיים למסכי האכלה בקנה מידה גדולה יביאו ליעילות מציאה משתנה. אנו מתארים פרוטוקול משופר לביצוע מסכי האכלת RNAi בקנה מידה גדולה, כי תוצאות במציאה יעילה ולשעתקו מאוד של ביטוי גנים.

מציאה גן בקנה מידה גדולה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; שימוש בספריות האכלת dsRNA ליצור פנוטיפים הפסד של הפונקציה חזקות

טכניקות גן מציאה מבוססות התערבות RNA (RNAi) נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. כאן, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בcastaneum Tribolium. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה המספקת גישה מהירה לפנוטיפים פסד של פונקציה, המאפשר לחוקרים ללמוד פונקציות גן בהקשרים מגוונים.

התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח, Tribolium castaneum

באמצעות שתי שיטות להערכת ביטוי גנים בנספחים התעוררו אצל הגדולים של Aedes aegypti, זיהינו הקבוצה של גני putatively בסיס התגובות עצביות לתרכובות מרות ודוחות, כפי שנקבע על ידי בדיקת אלקטרו.

הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti

כאן אנו מתארים הפרוטוקול המפורט שלנו לעריכת מושבות דבורים חד עוקבה - כלי שימושי לניתוח הפיסיולוגיה עובדת הקשורים התפקיד. כמו כן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לטיפול עובדים עם הורמון נעורי ecdysone להעריך את המעורבות של הורמונים אלה בויסות התנהגות עובד ו / או פיזיולוגיה.

הכנת מושבות אחת-עוקבה טיפול הורמונלי של דבורי הדבש Worker לנתח Associated פיזיולוגיה עם תפקיד ו / או המערכת האנדוקרינית

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגידול חיפושית ביניים-נבט, Dermestes maculatus (ד maculatus) במעבדה. בנוסף, אנחנו משתפים פרוטוקולי RNAi ושיטות עובריים וההורי לניתוח פנוטיפים עובריים ללמוד לתפקד גני מין זה.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, Dermestes maculatus

מאמר זה מדגים טכניקות הרומן שפותחו עבור משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) דרך הרקמות וסקולריים הצמחים עבור התערבות RNA (RNAi) מהצינורות האכלה חרקים.

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

מוצג כאן הוא פרוטוקול להשתמש במערכת CRISPR-Cas9 להפחתת הייצור של חלבון במוח דבורת דבש למבוגרים כדי לבדוק ספציפיות נוגדנים.

Anti-RDL ו Anti-mGlutR1 קולטנים נוגדן בדיקות בסעיפים המוח הונאיבי באמצעות CRISPR-Cas9

הפרעות RNA היא טכניקה ישימה ורבת עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בשלבים התפתחותיים ספציפיים. כאן, אנו מתארים את הצעדים הדרושים ליישום טכניקה זו חיפושית הצלילה הימית תרמונקטוס מרמורטוס, מרכישת רצפי גנים ועד לחיסול גנים המשפיעים על מבנה או התנהגות.

הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

כאן, אנו מתארים שיטות להזרקות יעילות של פופלים ומבוגרים בנסוניה ויטריפניס כחלופות נגישות למיקרו-אינטרנציקציה של עוברים, המאפשרות ניתוח פונקציונלי של גנים בעלי עניין באמצעות השתקת RNA באמצעות הפרעת RNA (RNAi) או נוקאאוט גנים באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

פרוטוקול זה פותח כדי לשפר את ההבנה כיצד אגרוכימיקלים משפיעים על דבורת הדבש (Apis mellifera) רבייה על ידי יצירת שיטות לחשוף מלכות דבורי דבש ומטפלים העובדים שלהם אגרוכימיקלים בפיקוח, הגדרה מעבדה וניטור קפדני של התגובות הרלוונטיות שלהם.

הערכת הסיכון האגרוכימי למלכות דבורת הדבש המויזות

למד שיטות RNAi לנוקאאוט זוגי של גנים בדבורי דבש Apis mellifera ומדידת תפיסת טעם באמצעות מבחן PER. פרוטוקול זה מאפשר חקר הרשתות הרגולטוריות הגנטיות המשפיעות על התנהגות הדבורים ומנגנוני הדבורה.

מציאה RNAi בתיווך זוגית ג'ין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש (

גלה סרטונים נוספים