Name: Extração de prostaglandina e Análise em Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a extrair e analisar prostaglandinas e eicosanoides em Caenorhabditis elegans usando cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem. Este método otimizado oferece alta sensibilidade e especificidade para estudos de metabolismo lipídico.

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Agradecemos aos Metabolomics alvo UAB e Laboratório de Proteômica, que foi apoiado em parte pela pele Disease Research Center UAB (P30 AR050948 a C. Elmets), a O&#39;Brien Centro de lesão renal aguda UAB-UCSD (P30 DK079337 para A. Agarwal ) eo Lung Health Center UAB (HL114439 R01, R01 HL110950 para JE Blalock). Suporte para o espectrômetro de massa era de um NCRR Shared Instrumentação subvenção (S10 RR19261 para S. Barnes). Agradecemos também a Ray Moore para suporte técnico. C. cepas elegans foram fornecidos pelo Caenorhabditis Genetics Center, que é financiado pelo NIH. Este trabalho foi financiado pelo NIH (R01GM085105 ao MAM, incluindo um suplemento administrativa ARRA).

O protocolo como descrito abaixo está dividido em três secções: a cultura sem fim, extracção de prostaglandina, e análise de prostaglandina. Como observado, existem vários pontos quando as amostras podem ser armazenadas temporariamente a -80 ° C ou -20 ° C. 1. Worm Cultura Recomendamos cerca de 6 g de vermes estágio mistos para LC-MS/MS abrangentes. Isto deve proporcionar material suficiente para a detecção de pelo menos seis injecções separadas. Para a quantificação das PGs conhecidos por MRM numa única injecção ou dois, 1-2 g são suficientes. A análise dos extractos de culturas sincronizadas constituídos por um estágio específico também é possível. Até quatro diferentes linhagens podem ser cultivadas em simultâneo. Por exemplo, um tipo selvagem de controlo e três estirpes mutantes diferentes. <ol><li> Prepare 65 X-grandes (16 cm) placas NGM e bactérias concentrados para alimentação suplementar. Use NA22 bactérias para a semeadura. Para fazer com que as bactérias concentrados para alimentação suplementar, grow pelo menos quatro litros de NA22 em meio LB por 16-24 h. Girar, remover o sobrenadante e ressuspender as bactérias em 100 ml de tampão M9. 200 a 400 ml desta solução bacteriana concentrada pode ser necessário para cada uma das estirpes de vermes. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Comece culturas vermes em 5 X-grandes placas. Cresça vermes durante aproximadamente 3 a 4 gerações até placas estão cheios de adultos grávidos. Concentrados bactérias devem ser adicionadas a placas para evitar a fome, conforme necessário (~ 1 ml / placa e deixar secar completamente, antes da tampa). </li><li> Lave hermafroditas grávidas off placas com tampão M9 e recolher os vermes em um tubo de polipropileno ml cônico de 50. </li><li> Permitir hermafroditas grávidas para liquidar o fundo (geralmente cerca de 3-5 min). Remover o sobrenadante, incluindo bactérias, ovos e vermes fase larval. Ressuspender em 15 ml de tampão M9 e misture delicadamente. </li><li> Transferir 200 ul da suspensão para cada verme de 60 placas NGM semeadas. Dispersar vermes entre as placas. Mantenha solução minhoca misturadoassim até que todas as placas foram semeadas para assegurar que eles recebem números aproximadamente iguais de vermes. </li><li> Complemente com bactérias concentradas, conforme necessário (~ 1 ml/plate/12 para período de 24 horas) para evitar a fome. Permitir placas secar ao ar antes de substituir pálpebras. Cresça vermes para 2-4 gerações, dependendo do número original de grainhas vermes, ou até as placas estão cheios de adultos grávidos. </li><li> Placas verme colheita uma cepa de cada vez. Lave os vermes fora as placas com tampão M9 e recolher, em 50 ml tubos de polipropileno (por exemplo, 6 tubos). Utilize uma solução tampão M9 para lavar um prato, em seguida, transferir o buffer cheio de verme para o próximo prato. Depois de lavar um número (por exemplo,. 10 º) de placas, transferir o buffer cheio de verme para o tubo de 50 ml. Encha o tubo até o topo com tampão M9. Repetir a lavagem para o resto das placas. </li><li> Como os adultos, grávidas para liquidar o fundo em 5-6 min, remover o sobrenadante (~ 35 ml) e consolidar em um ou dois tubos. Encher os tubos de 50 ml com fresh M9 buffer, deixe repousar por 3-5 min, e remover o sobrenadante deixando adultos grávidas. Repita 3 vezes ou até que o sobrenadante é transparente. </li><li> Utilizando um grande furo pipeta Pasteur, transferir tantos vermes quanto possível para dois tubos de polipropileno de 15 mL cónicos. Girar a 1000 RCF (~ 3500 rpm em CentraSL2) durante 5 minutos numa centrífuga clínica. Remover o sobrenadante e repetir até que todos os vermes são transferidas e sedimentadas no mesmo tubo. Remover tanto sobrenadante quanto possível, e armazenar vermes a -80 ° C. Repita o procedimento para todas as cepas. </li></ol> 2. Extração de prostaglandina Os reagentes necessários para a extracção são apresentados abaixo. O método que é modificada a partir da Golovko e Murphy 17 e inclui extracção com acetona seguido de purificação de líquido-líquido, o que aumenta a sensibilidade de LC-MS/MS. Uma bala homogeneizador misturador 5 é utilizado no processo, embora os resultados semelhantes podem ser obtidos com um homogeneizador de Dounce. Hydroxytolue Butylatedne (BHT) e evaporação sob atmosfera de azoto (N 2) de gás são utilizadas para evitar a oxidação. Todos os artigos de vidro devem ser siliconizado (Sigmacote) para reduzir a ligação de lípidos. A extracção com solventes orgânicos devem ser realizados numa câmara de química. <ol><li> Pesar um tubo cônico de 50 ml de polipropileno. Transferir aproximadamente 6,0 g de vermes congelados do tubo cónico de 15 ml armazenadas a -80 ° C por meio de corte do tubo com uma lâmina de barbear a quente perto da marca de 6,5 ml. Uma espátula de mistura de metanol e limpa pode ser usada para remover o verme sedimento congelado a partir do fundo do tubo. Ao cortar através do sedimento para recuperar a porção inferior, vermes larvais menos densas e bactérias residuais a partir do topo do sedimento são deixados para trás. </li><li> Transfira os vermes congelados até ao tubo de 50 ml pré-pesados. Se várias amostras estão sendo processadas, use a mesma quantidade (6,0 g) de tecido para estudos comparativos. Como o descongelamento vermes em uma pasta, adicionar ou remover vermes com a espátula para se obter a massa desejada. Opcional: add 1,00 ng de padrão PGF 2α-d4 como um controle interno para a eficiência da extração. </li><li> Adicionar 12 ml de gelado 02:01 acetona / solução salina com 0,005% BHT à suspensão verme e misturar bem em vórtice. Distribuir 1,5 ml da suspensão de minhoca a cada um dos doze 5 ml tubos de plástico auto-standing para uso no Blender bala. </li><li> Adicionar 0,7-0,8 ml de 0,5 mm de diâmetro Ceria esferas de óxido de zircónio estabilizado a cada tubo de 5 ml. Feche as tampas hermeticamente e carregar os 12 tubos na bala Blender 5 homogeneizador. Executar o misturador durante 3 minutos a velocidade de 8-9 e coloque os tubos em gelo. Certifique-se de fechar as tampas muito bem ou o conteúdo pode derramar. Entrada 10 ul de homogeneizado de um tubo numa lâmina através de um estereoscópio. Deve haver muito poucos intactos vermes restantes. Repita a mesma velocidade por mais um minuto, se for necessário. </li><li> Uniformemente transferir os homogeneizados para quatro tubos de vidro de 10 ml usando uma cónicas &quot;pipeta Pasteur 9. Evitar a transferência de grânulos. Lavar as pérolas a partir de três tubos Sequentially com 1 ml de 1:2 de acetona / solução salina contendo BHT. Repetir para outros tubos até que todas as esferas são lavadas. Transferir a solução restante (~ 4 ml) para tubos de vidro de 10 ml e os colocar em gelo. </li><li> Centrifugar os tubos de vidro de 10 ml, a 4 ° C numa centrífuga clínica a ~ 1000 xg durante 10 min. Transferir o sobrenadante de cada tubo para um tubo cónico de 10 ml de vidro limpo. </li><li> Num capuz química, adicionar um volume igual de hexano a cada tubo de vidro de 10 ml. Por exemplo, adicionar 3,5 ml de hexano e 3,5 ml de acetona / solução salina. Vortex à velocidade máxima durante 30 segundos. </li><li> Centrifugar os tubos de vidro de 10 ml, a 4 ° C numa centrífuga clínica a ~ 1000 xg durante 10 min. Descartar a fase superior contendo hexano e lipídios carga neutra. </li><li> Acidifica-se a fase inferior a pH 3,5 com 2 M de ácido fórmico (cerca de 100 - 150 ul). Teste de pH utilizando tiras de pH. </li><li> Adicionar um volume igual de clorofórmio a cada tubo. Vortex à velocidade máxima durante 30 segundos e centrifugar os tubos à temperatura de 4 ° C icentrífuga clínica nd a ~ 1000 xg durante 10 min. </li><li> Remover e descartar a fase aquosa superior. Insira uma ponteira por meio de qualquer interfase leitoso residual para a fase de clorofórmio inferior, evitando a interfase. Recolher a fase inferior de cada um dos quatro tubos de 15 ml para um tubo de vidro cónico limpo. Incubar a -20 ° C durante pelo menos 24 horas. Neste ponto, o extracto pode ser armazenada a -20 ° C durante até duas semanas. </li><li> Leve o extrato do freezer e descartar a camada superior aquosa leitosa remanescente, se houver. Transferir a fase clorofórmio a um frasco de vidro de ½ Dram marcado revestido a teflon usando um novo pipeta de Pasteur. Num capuz química, evapora-se a fracção solúvel em clorofórmio até à secura sob uma corrente suave de N 2 de gás. O extracto seco pode ser armazenado a -20 ° C durante até 2 semanas. Um esquema geral utilizado para a extracção e análise de PG é mostrado na Figura 1. </li></ol> 3. Análise de prostaglandina <ol><li> Prepare estoqueAs soluções de referência individuais prostaglandinas, tais como PGF 2α ou PGF 2 α-d4 (1 ug / ml) em metanol e dilui-se com metanol: água (8:2 v / v) para obter uma solução de trabalho. Prepara-se uma série de diluições (100, 10, 1, 0,1, 0,01 ng / ml) para gerar uma curva padrão. </li><li> Adicionar 200 uL de metanol: água (8:2 v / v) para a seco C. extrato lipídico elegans (s) e misture bem. Se menos do que 6 g de tecido sem-fim foi extraída, o extracto seco, deve ser ressuspenso em menos volume de metanol: solução aquosa. </li><li> Preparar a fase móvel consistindo de 0,1% de ácido fórmico em água de [A] e acetonitrilo contendo 0,1% de ácido fórmico, [B]. </li><li> Configure o autosampler a 4 ° C e coloque os frascos de amostra em um 70 de contagem de 1,5 ml cremalheira frasco. </li><li> Equilibrar a coluna de RP-C18 Sinergia hidro com 0,1% de ácido fórmico com um caudal de 0,2 ml / min durante cerca de 5 min. </li><li> Injectar a amostra (20-50 uL) na coluna. Realize gradiente início eluiçãoção com 10% de B e indo até 80% de B, 0-11 min, 80-100% de B, 11-14 min, e voltando a 10% de B em 16 min. O tempo total de execução é de 20 min. Os tempos de retenção dos padrões autênticos 13 são mostrados na Tabela 1 3 para referência. </li><li> Introduzir o efluente da coluna no espectrómetro de massa utilizando uma interface ESI operam no modo de ião negativo. O azoto é utilizado como nebulizador e gases cortina (CUR = 10). O gás de colisão, a energia de colisão, ea temperatura está fixada em 10, -35 eV e 600 ° C, respectivamente. Declustering potencial (DP), a energia de colisão (CE), e do potencial de saída da célula (CXP) são fixados em -90, -35 e -10, respectivamente. </li><li> Para varreduras (scans de pesquisa Q1), use o modo de íons negativos na faixa de massa de m / z 315-360 para a maioria das PGs (Figura 2). O intervalo pode ser alterado, dependendo da massa do composto (s) de interesse. Extrato de íons de corrente de íons totais (TIC) dos cromatogramas de íons LC-MS e determinar se a extraçãoiões ted correspondem aos iões ou desprotonados aduto, ou para iões fragmentados. </li><li> Para as experiências de MRM, transição de massa m / z 355/311 é utilizado para detectar a classe F1, m / z 353/193 é utilizada para a classe F2, e m / z 351/193 ou 351/191 é utilizada para a classe F3 (Figura 3). MRM também é usado para detectar o padrão interno (por exemplo, m / z 357/197 para PGF 2α-d4) e para gerar a curva padrão. Veja Murphy et al. Para mais informações sobre as transições de massa PG 18. </li><li> Para as experiências de MS / MS, usar m / z 355 para classe F1, m / z 353for classe F2, e m / z 351for PGs classe F3. C. elegans dados MS / MS para a série F PGs está disponível na Figura 4 e Tabela 2 3,16. Dados do MS / MS para eicosanoids mamíferos está disponível em <a href="http://www.lipidmaps.org" target="_blank">www.lipidmaps.org</a> . </li><li> Processar os dados analíticos utilizando Analyst software (versão 1.4.2, a Applied Biosystems). </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

Nós descrevemos um procedimento para extração e análise de eicosanóides, com foco em PGs F-series. Existem várias partes do procedimento que pode ser problemático. Em primeiro lugar, é essencial que as culturas sem-fim não ocupem, como a fome pode alterar o metabolismo de PG. Para uma alimentação suplementar, NA22 bactérias são recomendados em vez dos mais comumente usados ​​OP50 bactérias porque NA22 atinge maior densidade. No entanto, a estirpe NA22 carece de resistência aos antibióticos, e é mais susceptível de contaminação. Em segundo lugar, vermes sintetizar isômeros PG individuais em baixa abundância relativa de tecidos de mamíferos. Isto pode ser devido, em parte, à redundância entre os numerosos isómeros. Recomendamos cerca de 6 g de tecido para análise abrangente e sinais mais fortes. Menos de tecido (1-2 g), pode ser usado, se o extracto seco é ressuspenso em menos de metanol: solução de água para aumentar a concentração do PG. No entanto, apenas uma a duas injecções podem ser realizadas. O limite de detecção do nosso sistema LC-MS/MS é de cerca de 10 pgPGF 2α / ml. Um ml de densamente vermes estágio mistos (cerca de 1 g) produz cerca de 25-50 pg de CePGF2. Sistemas de espectrometria de massa mais sensíveis, pode reduzir a quantidade de tecido sem-fim utilizado para análise. Em terceiro lugar, as diferenças na eficiência de extracção PG entre as amostras podem causar resultados variáveis. Verificou-se que a eficiência da extracção é muito semelhante, quando os tecidos são extraídos em paralelo. Para determinar a eficiência, adicionar 1,0 ng de PGF 2α-d 4, no passo de homogeneização, como um controlo interno. Transição MRM utilizando massa m / z 357/197 é utilizado para medir a concentração de PGF 2α-d4 em relação a uma de 1 ng / ml de solução-padrão. É, então, calculado o valor de PGF 2α-d 4 perdida durante a extracção. Os parâmetros de cromatografia e transições de massa que podem ser alterados incluem detectar outras PGs e eicosanóides. Apesar de um esforço considerável, não temos sido capazes de identificar série D ou E-sers PGS nos extratos 17. Além disso, não ter detectado 8-iso PGF 2α e 8-iso PGE 2, que são característicos de livre peroxidação radical iniciado, o que gera uma mistura não selectiva de PG estereoisômeros 19. Se vermes sintetizar outros tipos de PG não é conhecido. Endocanabinóides e vários epoxi e hidroxilo metabolitos de araquidónico e ácidos eicosapentanóico foram encontradas em C. elegans extrai 5,7,20,21. Recomendamos o uso de ambos MRM e MS / MS em comparação com padrões autênticos para a quantificação e identificação, respectivamente. Para novos eicosanóides, estas análises deve ser combinada com um estudo comparativo dos mutantes de gordura, que são deficientes na síntese de AGPI de 22 enzimas, bem como um ensaio funcional, se possível. A ressalva a analisar os mutantes de gordura é que pequenas quantidades de ácidos graxos poliinsaturados presentes em vermes são suficientes para a síntese de PG. Por exemplo, as gorduras-2 (wa17) mutantestêm uma pequena quantidade de actividade de dessaturase D12 (~ 5% de tipo selvagem 22), e estes mutantes ainda produzem PGs 6. gordura-3 (WA22) e gordura-4 (WA14) mutantes não conseguem sintetizar PGs derivadas araquidónico e ácidos eicosapentanóico 16 . Descobrimos também que os mutantes de gordura para compensar a perda de aulas PUFA por up-regulação da síntese de PG restantes aulas. Por exemplo, a gordura-3 (WA22) mutantes não conseguem sintetizar a maioria das PGs derivadas de PUFAs 20 carbono. Em vez disso, eles parecem-regulam novos PGs derivadas de 18 carbonos PUFAs 16. Até o momento, não temos conhecimento de um C. elegans estirpe que é completamente deficiente na síntese de PG. É possível que PGs são essenciais para o crescimento ou desenvolvimento.

As prostaglandinas (PGs) são uma classe importante de hormonas de lípidos que têm sido amplamente investigados e envolvido na regulação da reprodução, imunidade, e desenvolvimento de uma ampla variedade de organismos de 12-14. PGs são idealmente adequados para análises de biologia de sistemas completos, porque eles compreendem uma série de lípidos derivadas de um precursor comum (s). O nemátodo C. elegans é um dos organismos modelo mais utilizados para tratar de questões fundamentais em genética e biologia de sistemas. Nós demonstramos que o C. elegans sintetiza PGs F-série que guia espermatozóides móveis para oócitos 3,6,16. As PGs F-series derivados de PUFA de 20 carbono com três, quatro e cinco ligações duplas, compreendendo o F1, F2, F3, e as classes, respectivamente, foram identificadas 3,16. Tais PGs são sintetizados independente das enzimas ciclo-oxigenase, ainda PGF estereoisómeros 2α 1α e PGF ainda são generated. Para as análises qualitativas e quantitativas de C. elegans PGs, LC-MS/MS é uma técnica analítica poderosa e sensível. Antes de realizar esta análise, é importante desenvolver um método de extracção optimizado porque o desempenho do processo analítico depende fortemente da qualidade do extracto. A cromatografia líquida e espectrometria de massa pode apenas fornecer a massa prevista para cobrar razão (m / z), bem como a forma de pico desejável, e o tempo de retenção do ião progenitor PG. Perfil metabólico de PGs em C. elegans é uma tarefa desafiadora que exige várias estratégias de aquisição de MS. LC-MS verificação completa ou pesquisa de varredura (Q1 scanning) tem a vantagem de garantir que os PGs mais ionizáveis ​​irá gerar uma resposta por espectrometria de massa. Enquanto a digitalização levantamento fornece informações úteis sobre o perfil do total de PGs no que diz respeito ao tipo selvagem e mutante C. elegans, a detecção de pequenos PGs está comprometida devido à baixa sensibilidade. Neverthemenos, LC-MS digitalização levantamento pode dar uma visão global das PGs e é particularmente útil para análise de mutantes preditos de afectar o metabolismo de uma grande população de PG. Na identificação de metabolito, a análise dos padrões de LC-MS/MS PG sintetizados quimicamente é realizada pela primeira vez obter os seus espectros de ião do produto como compostos de referência. Estes espectros pode ser comparado com o espectro de um metabolito desconhecido. Modo de monitoramento de reação múltipla (MRM) é utilizado para maior sensibilidade e especificidade. Um experimento MRM é conseguido através da especificação do ião progenitor / produto de massa de iões de transição de um composto. Ao conhecer a massa e estrutura dos analitos alvo, é possível prever as transições MRM teóricos para diversos metabolitos desconhecidos. Um método LC-MS/MS optimizado para perfilar PGs isoméricos em C. elegans não foi avaliado. Aqui nós descrevemos uma abordagem integrada de extração e espectrometria de massa composta por LC-MS e LC-MS / MS métodos para detectar, quantificar e investigar C. elegans PG metabólitos. Esta abordagem pode ser aplicada a outros eicosanóides.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>X-large (16 cm) placas</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875714</td><td></td></tr><tr><td>E. coli cepa NA22</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>NA22</td><td><a href="http://www.cgc.cbs.umn.edu" target="_blank">http://www.cgc.cbs.umn.edu</a></td></tr><tr><td>Acetona, 399,5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A928-4</td><td></td></tr><tr><td>Hidroxitolueno Butilado</td><td>MP Biomedicals</td><td>101162</td><td></td></tr><tr><td>Hexano, grau HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico, 399%</td><td>Acros</td><td>AC27048-0010</td><td>Disponível através do</td></tr><tr><td>Clorofórmio Fisher Scientific, grau HPLC</td><td>Acros</td><td>AC26832-0010</td><td>Disponível através da Fisher PGF2</td></tr><tr><td>&alpha; Científico -d4</td><td>Cayman Chemicals</td><td>316010</td><td>Cayman tem uma ampla gama de padrões disponíveis para compra</td></tr><tr><td>Tampa de rosca estéril autoportante tubo de 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-651</td><td>Para uso com</td></tr><tr><td>contas de óxido de zircônio de 0,5 mm</td><td>Bullet Blender Próximo > > > Advance</td><td>ZrOB05</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga graduados de alta resistência cônicos de vidro de 10 ml</td><td>Kimble Kimax</td><td>45200-10</td><td>Disponível através de Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Tubos cônicos de vidro de 15 ml</td><td>Corning Pyrex</td><td>8082-15</td><td>Disponível através de Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sigmacote (reagente de siliconização)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro de 1/2 Dram com tampa de Teflon</td><td>Fisher Scientific</td><td>V1235C-TFE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>CentraSL2 Centrífuga Clínica</td><td>Thomas Scientific</td><td>2517N92-TS</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender 5 homogeneizador azul</td><td>Próximo > > > Advance</td><td>BBY5MB</td><td>Um homogeneizador Dounce de 40 ml pode ser usado como alternativa</td></tr><tr><td>Synergi 4 &mu; m Hydro-RP 80 &#197; Coluna LC 250 x 2,0 mm</td><td>Phenomenenex</td><td>00G-4375-B0</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>Coluna SecurityGuard Cartuchos AQ C18 4 x 2,0 mm</td><td>Phenomenenex</td><td>AJ0-7510</td><td></td></tr><tr><td>SecurityGuard Kit de cartuchos</td><td>Phenomenenex</td><td>KJ0-4282</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu Proeminência HPLC com amostrador automático refrigerado</td><td>Shimadzu Scientific Instruments, Inc.</td><td></td><td>Qualquer sistema de HPLC padrão acoplado a um espectrômetro de massa triplo quadrupolo deve ser suficiente</td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa triplo quadrupolo API 4000</td><td>Applied Biosystems/MDS SCIEX</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">M9 buffer recipe (4 litros)</td> </tr> <tr> <td>12 g</td> <td> KH2PO4</td> </tr> <tr> <td>24 g</td> <td>Na2HPO4</td> </tr> <tr> <td>20 g</td> <td>NaCl</td> </tr> <tr> <td>Até 4 litros</td> <td>Água deionizada</td> </tr> <tr> <td colspan="2">Alíquota para oito garrafas de 1 litro. Autoclave e refrigeração.</td> </tr> <tr> <td>0,5 ml/frasco</td> <td>1 M MgSO4</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

extração de prostaglandina e análise em<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans está emergindo como um modelo animal poderoso para estudar a biologia de lipídios 1-9. As prostaglandinas são uma importante classe dos eicosanóides, os quais são sinais de lípidos derivados de ácidos gordos poliinsaturados (PUFAs) 10-14. Estas moléculas de sinalização são difíceis de estudar por causa de sua baixa abundância e natureza reativa. A principal característica das prostaglandinas é uma estrutura em anel ciclopentano localizado dentro da espinha dorsal do ácido gordo. Nos mamíferos, as prostaglandinas podem ser formados através da enzima ciclo-oxigenase-vias dependentes e independentes de 10,15. C. elegans sintetiza um vasto leque de prostaglandinas independentes de cyclooxygenases 6,16,17. A grande classe das prostaglandinas da série F foi identificado, mas o estudo de eicosanóides está em um estágio inicial, com amplo espaço para novas descobertas. Aqui nós descrevemos um método de extracção e análise de prostaglandinas e outros eicosanóides. Lipídico cobrados são extraídas a partir de culturas de vermes em massa utilizando uma técnica de extracção líquido-líquido e analisadas por cromatografia líquida acoplada à tandem com ionização por electrospray, espectrometria de massa (LC-ESI-MS/MS). A inclusão de análogos deuterados de prostaglandinas, tais como PGF 2 α-d 4, como um padrão interno, é recomendado para a análise quantitativa. Monitorização de reacção múltipla ou MRM pode ser utilizado para quantificar e comparar os tipos específicos de prostaglandinas entre os animais do tipo selvagem e mutante. Decomposição induzida por colisão ou MS / MS pode ser utilizada para obter informação sobre as características estruturais importantes. Espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) varreduras de levantamento de uma gama de massa seleccionada, como por exemplo m / z 315-360 pode ser utilizado para avaliar as alterações globais nos níveis de prostaglandinas. Nós fornecemos exemplos de todas as três análises. Esses métodos irão fornecer aos pesquisadores um conjunto de ferramentas para a descoberta de novos eicosanóides e delinear suas vias metabólicas.

A preparação das amostras foi efectuada por extracção líquido-líquido, adaptado de Golovko e Murphy 17. Ele forneceu excelente recuperação do padrão interno (PGF 2α-d4). O regime geral para a extração de PG C. elegans é mostrado na Figura 1. Condições cromatográficas foram otimizadas para fornecer separação inicial&gt; 30 padrões de eicosanóides (Tabela 1 mostra 13 normas). Uma coluna de Hidro-RP (250 x 2,0 mm di) com água e acetonitrilo contendo 0,1% de ácido fórmico desde a melhor separação e sensibilidade. Verificações da pesquisa de extratos de mutantes do tipo selvagem e de gordura 3 mostrada na Figura 2 os níveis globais de documentos de iões dentro do intervalo de massas de 315-360 unidades de massa atómica. Gordo-3 (WA22) mutantes carecem de PUFA mais de 20 carbono. Uma classe de PG F3 é realçado. Na Figura 3, as análises de MRM de um extracto de tipo selvagem mostram vários isómeros de PG de F1 (Figura 3A </stro<html> ng&gt;), F2 (Figura 3B) e F3 (Figuras 3C e 3D) aulas. A classe F3 pode ser detectado com qualquer uma das duas transições de massa, m / z 351/193 ou m / z 351/191. CePGF2 é predominantemente constituída pelo PGF 2α enantiómero. CePGF1 passível PGF 1α ou o seu enantiómero. Figura 4 mostra a decomposição induzida por colisão de CePGF2 (RT = 11,8) comparada com o padrão α PGF2 (RT = 11,8). As pequenas diferenças de íons produtos são provavelmente devido a baixa abundância CePGF2 e compostos co-eluição no extrato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático do C. elegans PGs extração e análise de LC-MS. Note-se que a acetona / solução salina e clorofórmio ambos têm 0,005% de BHT para minimizar a oxidação lipídica. Consulte o texto para mais detalhes.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver a figura maior. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2.jpg" /> Figura 2. Verificações da pesquisa de m / z 315-360 extractos de mutantes do tipo selvagem e de gordura-3 (WA22). Tempo de retenção de cromatograf ia líquida (RT) é mostrada no painel de [A]. Iões extraídos a RT = 11,3 são mostradas para o tipo selvagem [B] e gordura-3 (WA22) [C] extractos. Uma PG classe F3 com massa m / z 351 é realçado. Cps, contagens / seg; amu, unidade de massa atômica. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3.jpg" /> Figora 3. MRM análises de extractos do tipo selvagem da classe F1. PGs são detectadas com a transição de massa m / z 355/311 [A]. Note-se que vários compostos hidrofóbicos (RT&gt; 14 min), que são susceptíveis de ser PGs, também são detectadas com esta transição. PGs classe F2 são detectadas com a transição de massa m / z 353/193 [B]. Classe F3 PGs são detectados com qualquer transição de massa m / z 351/193 [C] ou m / z 351/191 [D]. Note-se que os extratos contêm vários isômeros PG de cada classe. Os números correspondem aos agrupamentos mostrados na Tabela 2. A concentração de CePGF2 é de 1,8 ng / ml. TA, tempo de retenção; cps, contagens / seg. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4.jpg" /> Figura 4. Decomposição induzida por colisão de synth quimicamenteesized PGF 2α e CePGF2. setas no painel [A] indicam íons produtos ou fragmentação compartilhados entre PGF 2α e CePGF2 (RT = 11,8). Os iões dos produtos a m / z 309 e m / z 193 são gerados a partir de locais de clivagem indicados (realçado a e b), correspondem às estruturas mostradas, e são característicos da série F PGs [B]. Cps, contagens / seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Padrão </td><td> RT (min) </td><td> [MH] - m / z </td><td> Íons de produtos-chave em MS / MS </td></tr><tr><td> 20-hidroxi PGE2 </td><td> 9.43 </td><td> 367 </td><td> 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 </td></tr&gt; <tr><td> PGF 3 - </td><td> 11.26 </td><td> 351 </td><td> 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> O tromboxano B 2 </td><td> 11,66 </td><td> 369 </td><td> 289, 191, 177, 169, 151 </td></tr><tr><td> PGF 2 - </td><td> 11.80 </td><td> 353 </td><td> 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> PGF 1 - </td><td> 11.79 </td><td> 355 </td><td> 337, 319,311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 </td></tr><tr><td> B 4 Lipoxina </td><td> 12.38 </td><td> 351 </td><td> 201, 191,189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 </td></tr><tr><td> PGD ​​2 </td><td> 12.56 </td><td> 351 </td><td> 315, 271,203, 189 </td></tr><tr><td> 5 (S), 6 (R) - Lipoxina A 4 </td><td> 12.83 </td><td> 351 </td><td> 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 </td></tr><tr><td> PGA 2 </td><td> 14.02 </td><td> 333 </td><td> 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 </td></tr><tr><td> Δ12-PGJ 2 </td><td> 14.20 </td><td> 333 </td><td> 271, 189, 123 </td></tr><tr><td> Leucotrieno B 4 </td><td> 14.73 </td><td> 335 </td><td> 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 </td></tr><tr><td> 15d-Δ 12,14 PGJ-2 </td><td> 16,80 </td><td> 315 </td><td> 297, 271, 217, 203, 158 </td></tr><tr><td> 5 (S)-HPETE </td><td> 17.88 </td><td> 335 </td><td> 97, 83, 81, 57 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Os tempos de retenção e íons principais produtos de 13 normas eicosanóides do método LC-MS/MS 3. Mais de 30 padrões foram utilizados para desenvolver o programa de LC-MS/MS. Os tempos de retenção cromatográficos (RTs) diferem, mesmo entre os PGs muito semelhantes. Uma exceção é 2α 1α e PGF PGF. No entanto, estes são PGs distinguished pelas suas massas ião progenitor ([MH] - m / z) e induzida por colisão espectros de decomposição (MS / MS). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Classe das prostaglandinas </td><td> No. na Figura 3 </td><td> [MH] - m / z </td><td> Íons de produtos-chave em MS / MS </td></tr><tr><td> F1 (CePGF1) </td><td> 1 </td><td> 355 </td><td> 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 2 </td><td> 355 </td><td> 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 </td></tr><tr><td> F2 (CePGF2) </td><td> 3 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 4 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 5 </td><td> 351 </td><td> 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 6 </td><td> 351 </td><td> 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Íons de produtos de decomposição induzida por colisão de vários grandes C. elegans F1, F2 e F3 PGs mostrado na Figura 3. MS / MS de outros isómeros menos abundantes não são mostrados. Estes dados estão de análises múltiplas e nem todos os iões dos produtos pode ser visível num determinado prazo. Dada a complexidade dos extractos, alguns iões dos produtos menos abundantes podem derivar de um outro ião progenitor com o tempo de retenção similar ou resultam da interferência. Peak 2 é provavelmente um estereoisômero de CePGF1 e pico de 4 é provavelmente um estereoisômero de CePGF2. Veja Edmonds, et al. (2010) para dados adicionais 3.

Neste artigo, descrevemos um procedimento otimizado para a extração e análise de prostaglandinas e outros eicosanóides de<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizando LC-MS/MS.

Extração de prostaglandina e Análise em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Este procedimento tem como objetivo identificar e quantificar prostaglandinas e outros eicosanoides em extratos de *Elegia do mar*. Primeiro, cultive os vermes em culturas de grande escala. Em seguida, utilizando uma técnica de extração líquido-líquido, extraia os lipídios hidrofílicos do tecido dos vermes e injete os extratos lipídicos em uma coluna de CLAE acoplada a um espectrômetro de massas.Em seguida, analise os dados da cromatografia líquida em espectrometria de massas em tandem. Em última análise, essa abordagem de CL-EM/EM a extratos quentes purificados pode identificar novos metabólitos e também quantificar metabólitos conhecidos, como as prostaglandinas da série S. Assim, a principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como os ensaios imunoenzimáticos, é que ela é altamente sensível e específica, sendo ao mesmo tempo abrangente e flexível. A demonstração desta técnica será realizada por Hugh Hong, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para alimentação suplementar dos vermes, use pellet e NA 22.Cultive bactérias por centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet bacteriano em 100 mililitros de tampão M nove. Armazene a solução bacteriana concentrada a quatro graus Celsius. Inicie os cultivos de vermes em cinco placas NGM extragrandes.Continue a propagar os vermes por três a quatro gerações até que as placas estejam cheias de vermes. Adicione adultos para prevenir a inanição, adicionando aproximadamente um mililitro das bactérias concentradas às placas de vermes conforme necessário. Deixe secar completamente ao ar antes de colocar a tampa.Em seguida, lave os vermes hermafroditas das placas com tampão M nove. Recolha os vermes em um tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros. Em seguida, deixe os vermes sedimentarem no fundo.Descarte o sobrenadante contendo ovos de bactérias e vermes em estágio larval. Agora, ressuspenda os vermes remanescentes em 15 mililitros de tampão M nove e misture suavemente. Distribua 200 microlitros da suspensão de vermes para cada uma das 60 placas N GM semeada.Mantenha a solução de vermes bem misturada até que todas as placas tenham sido semeadas, para garantir que recebam números aproximadamente iguais de vermes. Distribua os vermes pelas placas. Cultive os vermes por duas a quatro gerações, suplementando com um mililitro de bactérias concentradas por placa a cada período de 12 a 24 horas.Quando as placas estiverem cheias de adultos GR, colete os vermes uma linhagem por vez. Lave os vermes das placas com tampão M nine e transfira-os para seis tubos de polipropileno de 50 mililitros. Complete o volume dos tubos com tampão M nine para lavar os vermes.Quando os adultos grávidos assentarem no fundo, remova cerca de 35 mililitros do sobrenadante. Em seguida, transfira os vermes para um ou dois tubos. Repita a lavagem com M nove três vezes ou até que o sobrenadante fique transparente, utilizando uma pipeta Pasteur de grande diâmetro.Transfira o maior número possível de vermes para um tubo cônico de polipropileno de 15 mililitros. Centrifugue a 1000 RCF durante cinco minutos e descarte o sobrenadante. Repita as etapas de coleta, lavagem e consolidação para as outras linhagens.Armazene os estoques das linhagens de vermes colhidos a menos 80 graus Celsius. Anote o peso de um tubo cônico de polipropileno utilizando uma lâmina de barbear vermelha e aquecida. Corte um tubo de polipropileno congelado contendo vermes colhidos próximo à marca de seis mililitros.Em condições estéreis, transfira cerca de seis gramas de pellet de vermes congelado para a amostra em questão. Adicione um nanograma do padrão interno e 12 mililitros de solução de acetona salina gelada.Com a mistura de BHT, distribua bem 1,5 mililitros da suspensão de vermes em 12 tubos plásticos autoportantes de cinco mililitros, adicionando a cada tubo. Adicione 0,7 mililitros das microesferas estabilizadas de óxido de zircônio. Homogeneíze a suspensão de vermes, se necessário.Repita o processo por mais um minuto para obter menos de 10% de vermes intactos, utilizando uma pipeta de pasteur de nove polegadas. Transfira cuidadosamente o homogenato, mas não as esferas, para quatro tubos cônicos de vidro de 10 mililitros. Combine as esferas de três tubos e lave com um mililitro de solução salina de acetona contendo BHT.Repita esta lavagem para os tubos restantes contendo as esferas. Transfira a solução de lavagem para os tubos de vidro sobre gelo. Em seguida, centrifugue o homogenato a 1000 Gs por 10 minutos.A quatro graus Celsius, transfira o sobrenadante de cada tubo para um tubo cônico de vidro limpo de 10 mililitros. Em seguida, em uma capela química, adicione volume igual de hexano a cada tubo e vortexe na velocidade máxima por 30 segundos. Após centrifugação a quatro graus Celsius a 1000 Gs por 10 minutos.Descarte a fase superior contendo a hexano e os lipídios neutramente carregados em ácido fórmico a dois milimolares para acidificar a fase aquosa inferior. Teste com tiras de pH para obter um pH de 3,5. Agora, adicione volumes iguais de clorofórmio a cada tubo e vortexe na velocidade máxima por 30 segundos.Centrifugue as amostras a quatro graus Celsius a cerca de 1000 ×g por 10 minutos. Insira a ponta de uma pipeta de vidro na fase inferior de clorofórmio e tente evitar a interface sólida inclinando o tubo. Recolha os extratos de quatro tubos em um único tubo cônico de vidro de 15 mililitros.Elimine o ar no tubo de vidro com gás nitrogênio e incube a menos 20 graus Celsius por 24 horas a duas semanas. Após o descongelamento do extrato, descarte a camada aquosa superior esbranquiçada remanescente, se presente. Usando uma pipeta Pasteur nova.Transfira o clorofórmio para um frasco de vidro DRM meio com revestimento de Teflon rotulado em uma capela química. Evapore o solvente orgânico com um fluxo suave de gás nitrogênio e armazene as amostras a menos 20 graus Celsius por até duas semanas. Primeiro, prepare soluções estoque de prostaglandinas de referência individuais em metanol.Agora, gere uma curva padrão por diluição seriada em metanol 80%. Em seguida, dissolva os extratos lipídicos secos de *sea elegance* em 200 microlitros de metanol 80% para análise. Injete de 20 a 50 microlitros da amostra na coluna de fase reversa e realize a análise em gradiente conforme detalhado no protocolo textual, utilizando a interface ESI em modo de íons negativos.Introduza o efluente da coluna no espectrômetro de massas. Ajuste o gás de colisão em 10 elétron-volts. A energia de colisão em menos 35 elétron-volts.A temperatura em 600 graus Celsius. Os potenciais de desobstrução em menos 90 e de saída celular em menos 11 geram uma curva padrão para analisar as diferentes classes de prostaglandinas presentes nas amostras extraídas utilizando o software Analyst. Processe os dados para identificar as prostaglandinas presentes nos extratos de vermes.As varreduras de levantamento dos extratos de vermes selvagens e mutantes fat three mostram os níveis globais de íons dentro da faixa de massa de 315 a 360 unidades de massa atômica. Em comparação com os vermes selvagens, os mutantes fat three apresentam ausência da maioria dos PFAS de 20 carbonos, exemplificados por uma prostaglandina da classe F three. Com a razão de carga mestre 3 51 destacada em cinza, análises MRM podem identificar as diferentes classes de prostaglandinas.Por exemplo, as prostaglandinas da classe F1 estão presentes em extratos do tipo selvagem, bem como em vários outros compostos hidrofóbicos com tempos de retenção maiores; a variação na transição de massa permite uma análise adicional das prostaglandinas das classes F2 e F3, indicando que os extratos de vermes contêm múltiplos isômeros de prostaglandinas em cada classe. A comparação da decomposição induzida por colisão da prostaglandina de *C. elegans* com a prostaglandina padrão pode ser utilizada para mapear os íons produtos provenientes de locais de clivagem esperados. A fim de prevenir a oxidação lipídica.Lembre-se de tomar as precauções apropriadas. Por exemplo, adicione o antioxidante VHT à solução indicada e purgue o extrato com gás nitrogênio.

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