Preparação do Mgm101 recombinação de proteínas por Estratégia Tagging baseado MBP

O objetivo geral deste procedimento é preparar proteínas oligoméricas grandes que se ligam ao DNA, como a MGM 1 0 1, utilizando a estratégia de marcação com proteína ligadora de maltose ou marcador MVP. Isso é realizado primeiramente clonando o quadro de leitura aberto da MGM 1 0 1 a jusante do MVP no vetor PMLC dois E para expressão em e coli. A proteína de fusão M-V-P-M-G-M 1 0 1 é então purificada a partir de e coli por cromatografia de afinidade com AMLO.

O MGM 1 0 1 é então liberado do MVP por clivagem proteolítica e separado do MVP por cromatografia de troca catiônica. Por fim, os anéis de MGM 1 0 1 são purificados até a homogeneidade por cromatografia de exclusão por tamanho. No final, cerca de 0,8 miligramas de MGM 1 0 1 solúvel.

A partir de um litro de cultura bacteriana, pode-se obter a caracterização bioquímica e estrutural desta proteína, que é importante para o reparo do DNA em mitocôndrias. A principal vantagem do uso de uma versão marcada de proteína ligante mortal de MGM101 é que essa versão é menos tóxica, mais solúvel e mais estável do que a versão não marcada. Como resultado, podemos obter uma expressão elevada da proteína nativa MGM101 em *E. coli*.

Olá, meu nome é Sarah Vicki. Sou especialista sênior em suporte à pesquisa no laboratório da Dra. Jji TEN na SUNY Upstate Medical University. Meu colega, Wan Wong, e eu demonstraremos agora a expressão e purificação da MGM 1 0 1. Comece a gerar a proteína de fusão utilizando PCR para amplificar a sequência madura de revestimento da MGM 1 0 1.

Não inclua os primeiros 22 resíduos amino terminais de MGM 1 0 1, que são conhecidos por serem clivados. Após a importação para as mitocôndrias, o MGM 1 0 1 amplificado é então colocado a jusante da sequência MAL E, que codifica a proteína de ligação à maltose ou MVP em uma versão modificada do vetor de expressão PM MAL C dois E. Isso gera a fusão M-V-P-M-G-M 1 0 1 com um ligador contendo um sítio de clivagem para a protease de precisão. O plasmídeo é inicialmente construído mediante seleção de transformantes de e coli sem a seleção azul-branca.

O plasmídeo resultante PLC dois E, MGM 1 0 1 é então introduzido na linhagem de e coli BL dois um codon plus DE três RIL e cultivado em placas de LB contendo ampicilina e cloranfenicol. Comece inoculando um fresco de 10 mililitros de meio LB suplementado com os transformantes de e coli incubados a 37 graus Celsius durante a noite com agitação a 200 RPM. No dia seguinte, inocule dois litros do meio LB suplementado com 10 mililitros da pré-cultura.

Cultive as células a 37 graus Celsius com agitação. Quando a DO 600 atingir 0,5, induza a expressão da proteína de fusão M-B-P-M-G-M 1 0 1 pela adição de IPTG numa concentração final de 0,3 milimolar, cultivando as células com agitação a 30 graus Celsius durante cinco horas. Após decorridas cinco horas, transfira as culturas para garrafas de centrífuga de 500 mililitros e recolha as células por centrifugação.

Após descartar o sobrenatante, adicione 30 mililitros de tampão de lise contendo inibidores de protease e re-suspenda o pellet celular pipetando para cima e para baixo. Em seguida, sonique a suspensão celular em gelo por 20 segundos. Utilizando um processador ultrassônico com ciclo de trabalho de 50%, deixe as células esfriarem em gelo por 30 segundos.

Em seguida, repita as etapas de sonicação e resfriamento mais duas vezes adicionais. Mantendo a suspensão em gelo. Adicione um mililitro de dois miligramas por mililitro.

DNA: mantenha uma alíquota do lisado celular a quatro graus Celsius por duas horas. Após decorridas duas horas, ajuste a concentração final de sal para 500 milimolar adicionando quatro mililitros de cloreto de sódio cinco molar a 36 mililitros de lisado.

Em seguida, para remover os detritos celulares, centrifugue a 10.000 × g a quatro graus Celsius por 30 minutos. Transfira o sobrenadante para um tubo novo. Neste ponto, uma alíquota de 20 microlitros pode ser usada para monitorar a eficiência da lise por sonicação.

Em um gel de página com SDS. Em seguida, o lisado celular é passado por uma coluna de amilose. Para purificar a proteína de fusão MVP MGM 1 0 1, comece adicionando 1,5 mililitros de uma suspensão a 50% da resina AMLO a um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, para equilibrá-lo, adicione 13 mililitros do tampão de lise e centrifugue a 2000 ×g por cinco minutos. Repita esta lavagem mais quatro vezes, depois reconstitua a resina em 0,75 mililitros de tampão de lise. Adicione a suspensão equilibrada de AMLO ao lisado celular e agite suavemente a 4 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, carregue a mistura de lisado e resina de amilose em uma coluna de cromatografia econo instalada em câmara fria. Abra a torneira para permitir que as proteínas não ligadas passem para um tubo de coleta por filtração gravitacional. Em seguida, lave a resina AMLO adicionando 300 mililitros do tampão de lavagem um.

Após a passagem, repita a lavagem com 150 mililitros do tampão de lavagem dois. Após adicionar o tampão Ellucian e coletar o EIT conforme descrito no protocolo textual, determine o rendimento e a pureza do M-V-P-M-G-M 1 0 1 carregando uma alíquota do EIT em um gel de eletroforese SDS-PAGE.

Após a corrida do gel, realize a coloração com kumasi; uma única faixa principal de aproximadamente 70 quilodaltons deverá ser visível. Adicione 50 unidades de protease de precisão aos M-V-P-M-G-M 1 0 1 EITs e coloque em um tubo de diálise com tampão de diálise. Deixe a clivagem prosseguir durante a noite a quatro graus Celsius.

Realize um gel de SDS-PAGE como antes. Para avaliar a eficiência da clivagem, uma clivagem completa deve gerar duas bandas de 42 e 28 quilodaltons, que correspondem a MVP e MGM101, respectivamente. Carregue o MVP-MGM101 clivado por meio de múltiplas injeções em uma coluna high S em escala bio, mini e macro preparativa, conectada a um sistema FPLC BioRad Biologic DUO.

Inicie a cromatografia de troca catiônica aplicando um gradiente salino em etapas de cinco milimolar 300, milimolar 500, milimolar 750 e 1000 milimolar de cloreto de sódio. Isso é obtido pela mistura do tampão A e do tampão B. Ajuste a vazão para 0,5 mililitros por minuto. Colete frações de dois mililitros em um coletor de frações, sendo que tipicamente o MGM 1 0 1 é eluído a 500 milimolar de sal.

Combine as frações do pico MGM 1 0 1 e verifique a pureza da proteína em um gel de eletroforese SDS-PAGE. O pico MGM 1 0 1 deve apresentar uma única banda de aproximadamente 28 kilodaltons após a combinação das frações proteicas provenientes da cromatografia de troca catiônica, seguida pela diálise da proteína no tampão de equilíbrio para cromatografia de filtração em gel, mantida a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, transfira a proteína para uma coluna de ultrafiltração centrífuga Aveva Spin 15 R e centrifugue a 3000 ×g a quatro graus Celsius para concentrar a proteína.

Uma vez que o volume seja reduzido a aproximadamente um mililitro, carregue o MGM 1 0 1 em uma coluna calibrada de graduação preparativa Supra Six equilibrada com o tampão de cromatografia; inicie a exclusão por tamanho utilizando o tampão de cromatografia, com uma vazão de 0,5 mililitros por minuto. As proteínas oligoméricas grandes eluem nas frações iniciais, enquanto as proteínas pequenas eluem nas frações finais. Os anéis do MGM 1 0 1 eluem em aproximadamente 400 quilodaltons.

Colete as frações dos picos purificados de MGM 1 0 1 usando um coletor de frações; carregue alíquotas das frações em um gel de SDS-PAGE 12% para verificar a qualidade final da proteína. Em seguida, concentre a proteína com Aveva. Centrifugue seis vezes a 3000 × g a quatro graus Celsius.

Em seguida, congele rapidamente as alíquotas de proteína em tubos de microcentrífuge submergindo-os em nitrogênio líquido por dois minutos. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius por seis a doze meses. Utilize as amostras MGM 1 0 1 para ensaio de ligação ao DNA de fita simples e para visualização estrutural por microscopia eletrônica de transmissão.

Os resultados do ensaio de mobilidade eletroforética demonstram que o MGM 1 0 1 purificado possui uma atividade de ligação robusta ao DNA de fita simples. A sonda de DNA de fita simples é retida de forma crescente nos poços de um gel nativo de poliacrilamida pelo MGM 1 0 1 oligomérico.

Como o MGM101 é adicionado em uma concentração superior a 400 nanomolar. Esses micrografos eletrônicos mostram a organização estrutural de ordem superior do MGM101. O MGM101 recém-preparado existe como anéis distintos com um diâmetro de 20 nanômetros, que podem ser revelados por microscopia de transmissão com contraste negativo.

Após várias semanas de armazenamento a quatro graus Celsius, o MGM 1 0 1 forma filamentos helicoidais supramoleculares. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em até uma semana.

Obrigado por assistir.