Name: 4D Multimodalidade de imagens de Citrobacter rodentium Infecções em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Aprenda a monitorar o ciclo de infecção por Citrobacter rodentium em camundongos usando imagem 4D multimodal com DLI e μCT. Este método permite visualizar a colonização bacteriana em tempo real.

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A facilidade de imagem in vivo no Imperial College foi financiado pelo MRC.

1. Ratos Preparação <ol><li> Comprar ou produzir o suficiente 18-20 g camundongos C57BL/6J necessários para o estudo. </li><li> Se os ratos são comprados de um fornecedor externo, seguindo o transporte para a instalação, habituar camundongos por 1 semana em comida autoclavado e água para estabilizar a microbiota intestinal. </li><li> Pesam-se, orelha de gama, e separar o número necessário de ratinhos por gaiola. </li><li> No dia anterior à infecção, antes de executar qualquer anestesia, verificar se existe isoflurano e oxigénio adequado para a duração do processo. Se necessário, adicione mais isofluorano ou substituir o cilindro de oxigênio. Em seguida, verifique o peso dos catadores anestésicos, se eles ganharam mais de 50 g desde a sua primeira utilização, descartá-las e substituir com catadores frescos. </li><li> Anestesiar ratos utilizando 3% isoflurano na XGI-8 Sistema de Anestesia e depilar usando Veet para 7 min. </li><li> Notas: <ul><li> Depilação completa é essencial, especialmente emcamundongos negros como melanina na pele atenua significativamente o sinal bioluminescente 3,15. </li><li> Depilação de ratos geralmente dura 8-10 dias antes da pele começa a regredir. Para realizar imagem multimodalidade 4D durante períodos mais longos, depilar ratinhos quando necessário de modo a que a área de interesse está nu para as sessões de imagem. </li><li> Ratos estão alojados em um Nível de Biossegurança 2 (NB-2) instalação de confinamento. </li></ul></li></ol> 2. Preparação celular bacteriana <ol><li> Prepara suficiente Burtani caldo Luria e placas de agar suplementadas com canamicina [50 ug mL-1] necessária para o estudo e armazenar a 4 ° C até ser necessário. </li><li> O dia antes da infecção descongelar um criotubo de C. rodentium estirpe ICC180 e imediatamente adicionar um cryobead para 15 ml de caldo LB suplementado com canamicina [50 ug mL-1] e cultura durante a noite a 220 rpm, 37 ° C. Como controle de contaminação médio, preparar um adicionalinocular 15 ml de caldo LB suplementado com canamicina [50 ug mL-1] e da cultura a 220 rpm, 37 ° C. </li><li> Na manhã seguinte (~ 16 horas), verifique o controlo do meio para turbidez como um sinal de crescimento bacteriano. Se o controle é clara, transferir a cultura ICC180 para um tubo falcon e centrifugar a 4.000 rpm. Subsequentemente, lavar o sedimento bacteriano em PBS. Em seguida, ressuspender em 1,5 mL de PBS (1/10 th do volume original de LB suplementado com canamicina) e misturar completamente para criar o inoculo bacteriano. </li><li> Para verificar se ICC180 foi cultivado de forma adequada e é bioluminescente antes da infecção dos camundongos, a imagem do inóculo no IVIS Spectrum CT usando BLI ea configuração automática do assistente Viver 4.3.1 Imagem como descrito anteriormente 1. Nota: <ul><li> Strain ICC180 é um derivado bioluminescente do tipo selvagem C. rodentium ICC169 2. Esta estirpe bacteriana tem o operão lux CDABE incluindo um Kgene de resistência anamycin inserido um pseudogene de xylE no cromossoma 2. </li><li> Realizar todas cultura bacteriana utilizando técnicas assépticas standard e, se necessário ou comprar consumíveis / reagentes estéreis ou autoclave antes de usar. </li><li> No passo 2.4, a leitura de bioluminescência (p / s / cm 2 / SR) pode ser utilizado para estimar o número de bactérias antes da infecção dos ratinhos. </li></ul></li></ol> 3. Infecção de camundongos com Bioluminiscente C. rodentium e Avaliação da colonização bacteriana <ol><li> Antes da infecção, verificar se existe isoflurano e oxigénio adequado para a duração do processo. Se necessário, adicione mais isofluorano ou substituir o cilindro de oxigênio. Em seguida, verifique o peso dos catadores anestésicos, se eles ganharam mais de 50 g desde a sua primeira utilização, descartá-las e substituir com catadores frescos. </li><li> Camundongos anestesiar com 3% isoflurano usando um XGI-8 AnaestheSistema sia para proporcionar retenção humano. </li><li> Misture o inoculo bacteriano e desenhar cuidadosamente 0,2 ml (aproximadamente 5 x 10 9 ufc ICC180) para dentro da seringa. </li><li> Remover camundongos do sistema de anestesia um de cada vez e nuca deles, segurando firmemente a pele atrás do pescoço com o polegar eo indicador. </li><li> Empurrar a agulha de gavagem para o telhado da boca, sobre a lingueta, e para baixo do esófago e injectar o inoculo bacteriano para o estômago. </li><li> Após sonda oral dos ratos, acompanhar a sua marcha e respiração por sinais de sofrimento que pode ser um sinal de que o inóculo bacteriano foi entregue para os pulmões. Eutanásia quaisquer ratinhos que foram inoculados nos pulmões. </li><li> Ratinhos não infectados gavagem com 200 ul de PBS como um controle de veículos, tal como descrito nos passos de 3,1-3,6. </li><li> Para confirmar que a sonda oral foi realizada corretamente, imagem camundongos infectados infectados e simulada no IVIS Spectrum CT usando BLI ea configuração automática no the LivingAssistente 4.3.1 imagem como descrito anteriormente 1. </li><li> Determinar os números de bactérias viáveis ​​no inoculo por diluição em série em PBS e manchas em triplicado em agar LB suplementado com canamicina [50 ug mL-1]. </li><li> Calcular a quantidade de ICC180 ufc / mL, encontrando uma diluição onde existem aproximadamente 5-50 colónias e contar o número de colónias a partir de cada ponto de diluição em que a diluição e registar que as colónias foram contadas no. Subsequentemente, calcular o número médio de ufc (a partir de três pontos) e multiplicando este valor pelo factor de diluição de 50 (cada ponto é de 20 ul de 1 ml da amostra original) e à diluição das colónias foram contadas no, dando ufc / ml. </li><li> Monitorar a colonização dos ratinhos diariamente, recolhendo as fezes de cada ratinho, para um tubo de Eppendorf de pré-pesado (pesado num equilíbrio fino) e dilui-se de 1/10 em PBS com base no peso da amostra (0,1 g ml -1). </li><li> Determinar os números de bactérias viáveis ​​emas fezes por diluição em série em PBS e manchas em triplicado em placas de agar LB suplementado com canamicina [50 ug mL-1]. </li><li> Calcular o número de bactérias viáveis ​​por grama de fezes seguindo o passo 3.9, em seguida, multiplicar o número de ufc / mL pelo factor de diluição fecal em PBS (passo 3.10) de 0,1 g ml -1 para dar ufc / g. </li><li> Para determinar se os ratinhos foram inoculados com uma cultura pura ICC180 e que todas as colónias são bioluminescente. Tome as placas de ágar da Etapa 3.8, avaliar a morfologia da colônia bacteriana ou por olho ou escolher uma colônia representante da chapa e analisar por microscopia de luz. Se necessário, a identificação de bactérias pode ser realizada pela tensão de colónias de PCR específico para avaliar a pureza da cultura. Subsequentemente, as placas de imagem no IVIS Espectro de CT utilizando BLI como descrito no passo 3.7 e verificar que 100% das colónias na placa são bioluminescente. Notas: <ul><li> No passo 3.4, ao inserir a agulha gavage, Se você sentir resistência, não forçar a agulha gavage, pois isso faz com que o inóculo para ir para os pulmões. Em vez disso, volte a inserir a agulha e tente novamente suavemente. </li><li> Passo 3.1 é opcional e camundongos pode ser oral gavaged sem anestesia, dependendo da política de bem-estar animal institutos. </li><li> Fezes devem ser semeadas no dia em que eles são coletados. C. rodentium vai crescer até se deixado a 4 ° C durante a noite em PBS, e fará com que a quantificação de CFU / g de fezes de estar incorrecta. </li></ul></li></ol> 4. Diário Composite luz difusa tomografia 3D com μCT Imagem (DLIT-μCT) de camundongos infectados Considerações de bem-estar animal: DLIT-μCT envolve imageamento óptico DLIT integrado com um rápido, de baixo dose de radiação μCT digitalização (~ 23 mGy para uma varredura duas mouse, ~ 53 mGy para uma única varredura mouse) de um animal imobilizado. Esta dose acumula com cada sessão de imagem, de modo que o objectivo é manter a dose como low quanto possível (e sempre bem abaixo da DL 50/30) enquanto ainda a realização do estudo. Em alguns casos, se não houver nenhum sinal de infecção num BLI analise convencional de ratos, a verificação μCT pode ser evitada para minimizar ainda mais a dose. Embora a dose é mantida tão baixa quanto possível, de prolongados estudos se houver alguma preocupação com a exposição à radiação, os ratos serão sacrificados ao primeiro sinal de sintomas prejudiciais ou no final do período de imagiologia μCT. <ol><li> Antes de imagem, inicializar o IVIS Spectrum CT e verifique se as travas de segurança de raios-X estão funcionando e que o estágio é aquecida na temperatura correta (37 ° C) para a imagem latente. Posteriormente, a verificar o nível de isoflourane no sistema de anestesia e o peso dos captadores anestésicos. Se necessário, adicione mais isofluorano e se os catadores ganharam mais de 50 g desde a sua primeira utilização, descartá-las e substituir com catadores frescos. </li><li> Configure o Spectrum CT para que os parâmetros de imagem queexecutar o recurso de exposição automática na Vida 4.3.1 Imagem são otimizados para luciferase bacteriana imagem. Selecione Editar&gt; Preferências&gt; Aquisição e janela de exposição automática. Em seguida, selecione&gt; Faixa de Valores&gt; Exp. Tempo (em segundos) e definir a&gt; Max. para 300s. Por fim, selecione&gt; Alvo Count (mínimo)&gt; luminescente e definido para 10.000 pontos. </li><li> Insira a uma plataforma de imagem mouse na Spectrum CT e prumo lo na anestesia. </li><li> Ligue o raio-X de segurança de bloqueio e inicializar os IVIS. </li><li> Uma vez que o IVIS Spectrum CT foi inicializado, anestesiar os ratos com 3% de isofluorano usando um XGI-8 Anestesia sistema para proporcionar retenção humano. </li><li> Para determinar se é necessário realizar uma varredura DLIT-μCT, pré-imagem dos camundongos usando BLI como descrito anteriormente 1, em uma plataforma de imagem mouse. Se um sinal robusto é obtido o mouse é adequado para imagens DLIT. Deixe o rato anestesiado em um rato imagem plataform após a verificação BLI pronto para DLIT-μCT. </li><li> Use o Assistente de Imagem na imagem viva 4.3.1 software para configurar a digitalização DLIT-μCT. O Assistente de Imagem determina automaticamente o FOV, tempo de exposição, F-stop e binning para o DLIT eo FOV, tempo de exposição, conjuntos de filtros e binning para a imagem μCT para dar a melhor relação sinal-ruído. Quando solicitado pelo Assistente Imaging, incluir apenas a 560, 580, 600 e 620 nm filtros de emissão e selecionar o rato varredura μCT. Em seguida, clique&gt; Adquirir para iniciar a imagem. </li><li> Retorne o rato anestesiado para sua jaula depois de imagem, remover o plataforma de imagem do rato do Spectrum CT e desinfectar com 1% Tri-gene. Se necessário, substituir a almofada de espuma que o rato é posicionado sobre a minimizar o risco de contaminação cruzada entre os ratos. </li><li> Imagem de ratinhos diariamente até ao dia 8 pós-infecção (PI) utilizando DLIT-μCT, como descrito nos passos 4,1-4,8, para gerar os dados de imagem longitudinais necessárias para fazer uma 4D movie de infecção. Nota: <ul><li> No passo 4.7, recomendamos o uso dos filtros de emissão de 560-620 nm para a bioluminescência bacteriana imagem. Embora o pico de bioluminescência é de cerca de 485 nm, devido à óptica de tecidos (a atenuação significativa do azul / verde fótons por tecidos de murino), que é importante para usar os fotões de laranja / vermelho para reconstruções 3D como facilitar o cálculo do sinal de profundidade . </li><li> As configurações de &#39;auto&#39; exposição em Viver 4.3.1 imagem para DLIT precisa ser ajustado para otimizar a quantidade de fótons capturados eo tempo máximo de imagem usado para cada conjunto de filtros. </li><li> É apenas necessário para realizar a pré-BLI imagiologia descrito no passo 4.6, quando o pesquisador não é certo se existe um sinal detectável bioluminescente, por exemplo, quando se utiliza um novo modelo de infecção. </li></ul></li></ol> 5. Reconstrução 3D de DLIT-μCT de imagem de dados <ol><li> Estar aberta 4.3.1 software de imagem e selecione&gt;, Navegar e abra a pasta que contém os arquivos DLIT-μCT. </li><li> Abra o arquivo DLIT-μCT em the Living Image Browser, por exemplo C. rodentium Dia 1 PI clicando em Load. </li><li> Na paleta de ferramentas selecione&gt; Superfície Topografia&gt; rato Nude, ajustar o limite, e, em seguida, clique em&gt; Gerar Superfície. Se a reconstrução da superfície é bem sucedido, um contorno da superfície será exibido na janela de visualização em 3D. </li><li> Para ver o scan μCT prestados na janela de visualização em 3D, esconder o contorno da superfície (Clique&gt; Ferramentas de óptica 3D e desmarque&gt; Tela objeto de superfície), ou diminuir a opacidade da superfície (Clique&gt; Ferramentas de óptica 3D e ajustar a&gt; opacidade barra deslizante). </li><li> Para fornecer a localização anatómica detalhada do DLIT reconstrução 3D, é necessário alterar os dados volumétricos μCT 3D (scan) de modo que apenas o esqueleto do rato é visível e que tem o contraste óptimo. Clique&gt; Ferramentas de multimodalidade 3D eo histograma select&gt; logarítmica, Gradient Iluminação, Qualidade e Denoise. Finalmente, ajuste o controle deslizante de Histograma para a direita e ver o 3D volumétrica de dados de alteração de contraste. Continue ajustando os dados até que apenas os ossos são claramente visíveis. Se desejar, altere a cor para os pontos de função de transferência no histograma. </li><li> Em seguida, selecione&gt; DLIT Reconstrução 3D na paleta de ferramentas e certifique-se de que apenas o 560, 580, 600 e 620 nm conjuntos de filtros, que são necessários para a luciferase bacteriana imagem in vivo, foram selecionados. Clique em&gt; Iniciar. O menu Janela de visualização de dados irá aparecer mostrando os sinais BL espectralmente filtrada a partir do rato que foi fotografada em 2D. Estes sinais são limiarizados automaticamente pelo software, mas pode ser ajustado manualmente, se necessário, utilizando guias na parte inferior do menu. O limiar para determinar a intensidade mínima de dados (representada como uma percentagem do sinal máximo na imagem) que irá ser incluído como dados na reconstrução. </li><li> Em seguida, selecione&gt; DLIT Reconstrução 3D na paleta de ferramentas e verifique se as propriedades ópticas utilizadas para a reconstrução DLIT estão corretas. Selecione&gt; guia Propriedades e certifique-se de que as configurações de propriedades do tecido é definido para o tecido mouse, Spectrum Origem está definida para bactérias. </li><li> Clique&gt; Reconstruir para executar a reconstrução DLIT. </li><li> Para gerar o DLIT-μCT 3D clique filme&gt; Ferramentas&gt; Animação 3D e selecione Opções&gt; preset Animações&gt; CCW eixo Y e&gt; Duração Total&gt; 10 segundos (25 quadros por segundo). Uma vez que as definições para a animação em 3D são imprensa correto&gt; Gravar e salvar as reconstruções 3D DLIT-μCT como. Avi marcados com experiência, grupo e tempo ponto em uma pasta separada. Nota: <ul><li> É importante ao realizar reconstruções em 3D de dados DLIT-μCT usar um PC com a vida 4.3.1 Imagem e um pacote de serviços instalados e que o PC tem uma placa de vídeo adequado para executar o software de imagem multi-modalidade. Thé um software pode ser baixado, e as especificações da GPU estão contidos nas notas de lançamento ( <a href="http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm" target="_blank">http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm</a> ). </li><li> Se as reconstruções 3D DLIT-μCT aparecer para trás depois de ter sido salvo, o seu computador está executando uma versão antiga do seu driver de gráficos e isso pode ser corrigido baixando uma atualização do site dos fabricantes. </li><li> Na etapa 5, apresentamos as nossas definições preferidas para gerar reconstruções 3D DLIT-μCT. No entanto, existem vários pontos durante as reconstruções em 3D, onde os parâmetros que não são discutidos neste protocolo podem ser modificados. Para um guia completo para reconstruções em 3D usando o 4.3.1 imagem viva por favor consulte o manual de instruções dos fabricantes. </li><li> É importante criar as reconstruções em 3D usando as configurações idênticas na ferramenta de imagem multi-modalidade para que eles sejam comparáveis. Além deisso, ao criar as reconstruções 3D DLIT-μCT, é importante para fazer os vídeos usando o mesmo número de quadros por segundo e duração total (comprimento), caso contrário, o calendário do vídeo 4D não é homogênea. </li></ul></li></ol> 6. Geração de um filme 4D de C. Infecção rodentium <ol><li> Claramente rotular todas as reconstruções 3D DLIT-μCT com a experiência correta, ponto de tempo e de grupo em uma pasta de fácil acesso. </li><li> Crie um novo arquivo no Windows Live Movie fabricante e inserir as reconstruções DLIT-μCT em ordem cronológica, desde o dia 1 PI utilizando a guia ferramentas da pasta preparada no passo 6.1. </li><li> Adicionar legendas para o início de cada vídeo que descreve o ponto de tempo, por exemplo Dia 1 PI, selecionando o vídeo DLIT-μCT apropriado e, em seguida, selecione Home&gt; Adicionar legenda. Uma caixa de texto aparecerá na tela, onde a legenda apropriada é adicionado. Ajuste o tamanho da fonte, estilo, cor e justificação como desired usando guias idênticas para o Microsoft Word na barra de ferramentas do software. Finalmente, mover a legenda para o canto superior esquerdo do vídeo. </li><li> Repita o passo 7.3 para todos os vídeos DLIT-μCT. </li><li> Adicionar uma página de título, por exemplo C. rodentium dias após a infecção 1-8 clicando Início&gt; título. Uma caixa de texto aparecerá na tela onde o título apropriado é adicionado a um slide em branco. Ajuste o tamanho da fonte, estilo, cor e justificação como desejado usando abas idênticas para o Microsoft Word na barra de ferramentas do software. </li><li> Salve o projeto como um projeto movie maker * MMP em uma pasta apropriada com o título do filme. Este passo é essencial se você quiser alterar o filme. </li><li> Salve o filme como um arquivo WMV.. Clique no menu Movie Maker&gt; Salvar filme&gt; para computador. </li><li> Converter o arquivo movie maker usando um conversor de arquivo. Avi ou outro tipo de arquivo adequado compatível com o computador. Notas: <ul><li> Recomenda-se que os filmes 4Dsão gerados em um PC com o Windows Live Movie Maker instalado ( <a href="http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker" target="_blank">http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker</a> ) e um bom programa de multi-mídia capaz de reproduzir. wmv ou. avi tipos de arquivos. </li></ul></li></ol>

<ol><li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547(2011).</li>
<li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).</li>
<li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+specificity%2C+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).</li>
<li>Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+a+%27hyperinfectious%27+bacterial+state+after+passage+of+Citrobacter+rodentium+through+the+host+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract.</a> Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).</li>
<li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifidobacterial+surface-exopolysaccharide+facilitates+commensal-host+interaction+through+immune+modulation+and+pathogen+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).</li>
<li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li>
<li>Collins, J. W., et al. Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCollins%2C+JW+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. , 10-1099 (2012).</li>
<li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li>
<li>Hardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303, 851-853 (2004).</li>
<li>Szittner, R., Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence%2C+expression%2C+and+properties+of+luciferase+coded+by+lux+genes+from+a+terrestrial+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium.</a> J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).</li>
<li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).</li>
<li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007(2007).</li>
<li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940(2012).</li>
<li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).</li>
<li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL%2F6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).</li>
<li>Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+biophotonic+imaging+as+a+training+aid+for+administration+of+substances+in+laboratory+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents.</a> Lab Anim. 41, 321-328 (2007).</li>
<li>Crepin, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+the+Tir%3ANck+and+Tir%3AIRTKS%2FIRSp53+signalling+pathways+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo.</a> Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).</li>
<li>Willekens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+radiation+dose+in+micro-CT+with+optimization+of+the+scan+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22ContrastMedia+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol.</a> ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).</li>
<li>Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-animal+X-ray+dose+from+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Small-animal X-ray dose from micro-CT.</a> Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).</li>
<li>Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+effects+of+whole+or+partial+body+x-irradiation+on+mice%3A+life+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol.+Relat.+Stud.+Phys.+Chem.+Med%22%5BJournal%5D)">Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening.</a> Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).</li>
<li>Kohn, H. I., Kallman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+strain+on+acute+x-ray+lethality+in+the+mouse.+II.+Recovery+rate+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat.+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies.</a> Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).</li>
</ol>

Produção e acesso gratuito a este artigo é patrocinado pela PerkinElmer. Os autores Kevin P, Francis, Jeff Meganck e Chaincy Kuo são funcionários da Caliper-A PerkinElmer Company. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os procedimentos científicos Animals Act 1986 e foram aprovados pelo comitê de ética local.

O filme 4D de infecção bacteriana fornece uma ferramenta útil para visualizar e interpretar grandes quantidades de dados de imagem multi-modalidade com rapidez e facilidade. Esta técnica facilita a análise pormenorizada de como uma infecção se espalha por meio de um rato individual e pode ser utilizado para investigar a forma como a eliminação de hospedeiro ou de genes bacterianos ou estratégias de intervenção particular, efeito da carga bacteriana, distribuição e localização durante um estudo longitudinal 7. Estes vídeos também fornecem materiais didáticos úteis e um meio de divulgação de informações ao público. Existem vários passos críticos neste protocolo que poderiam afectar a qualidade dos dados obtidos a partir de DLIT-μCT imagem e a capacidade para elaborar um vídeo 4D da infecção. A parte mais importante deste protocolo é a infecção bem sucedida e homogênea de ratos com C. rodentium. É essencial que os ratinhos usados ​​para o estudo são entre 18-20 g e que o bactericidariais inóculos são preparados e cerca de 5 x 10 9 ufc, como descrito anteriormente 2,3. Antes da infecção dos ratos, é importante verificar que o inoculo é bioluminescente utilizando o Espectro de CT e uma vez que o inóculo foi preparado, tem de ser continuamente homogeneizada antes de cada rato é gavaged para assegurar que os ratos recebem doses infecciosas semelhantes. A imagem DLIT-μCT de camundongos foi otimizado para que a função de exposição automática no software 4.3.1 imagem viva determina automaticamente os parâmetros de imagem otimizado para o sinal de estar bem acima do ruído. No entanto, a função de auto-exposição depende de configurações definidas pelo utilizador e os parâmetros que devem ser modificados tal como descrito no procedimento. Não fazer isso irá resultar em imagens de baixa com um baixo número de fótons coletados que não resultar em uma progressão evidente na infecção, como as configurações de fábrica do Spectrum CT para auto-exposição estão programados para os tumores de imagem expressandofirefly luciferase. Reconstruções realizadas utilizando 560-620 nm dar o melhor acordo entre os dados medidos e simulados e, portanto, são os dados mais confiáveis ​​para incluir na reconstrução. Uma limitação para a utilização de DLIT-μCT é que a radiação ionizante a partir da analise μCT provoca danos de radiação sub-letais, que é cumulativa ao longo de um estudo longitudinal 18. Exposição de radiação sub-letal pode enfraquecer a resposta imune, causar danos no ADN e apoptose em órgãos internos 19. Em última análise, os danos da radiação sub-letal cumulativo pode causar a morte, se o LD 50/30 para a radiação ionizante é ultrapassado, o que se situa entre 5 e 7 Gy, dependendo da estirpe de ratinho e da idade dos ratos utilizados 18,20,21. Embora alguns dos danos molecular das radiações ionizantes podem curar, desde o princípio primordial é estimar a dose de forma conservadora, este não é normalmente contabilizados no planejamento do estudo. Em vez disso, o objetivo é ficar o mais below esses limites quanto possível, enquanto ainda realizar os objetivos do estudo. Isto é particularmente importante no presente estudo, devido à resposta imunitária normal à infecção, a frequência de imagem, e o facto transgénicas, imuno-formado, ou fortemente os animais infectados podem ser mais sensíveis à radiação ionizante. Ao planear a experiência para gerar um filme 4D da infecção, é importante ter em conta a duração da experiência, o número de μCT verifica necessário durante este período e o LD 50/30 para a radiação ionizante para a estirpe de ratinho a ser utilizado. Outra limitação potencial ao DLIT-μCT é a força de expressão do repórter no interior da estirpe bacteriana a ser utilizada, pois isso irá afectar os limites de detecção de bactérias e tempos de imagem. É altamente recomendável que os pesquisadores usam validado cepas bacterianas que são totalmente virulenta, mas otimizado para máxima lux operon expressão, como demonstrado anteriormente para BLI2,3. Uma ressalva ao projeto atual da imagem 4D é que cada filme é composto de exames individuais DLIT-μCT que têm diferente escala fóton. Isto pode tornar as imagens difíceis de interpretar se as alterações para a localização de focos BL, ou a sua intensidade ser subtil, ou se houver uma atenção intensa BL rodeado por focos fraco múltipla. Portanto, para a visualização longitudinais, é importante para manter as barras de cor consistentes entre os pontos de tempo. O conceito de um filme 4D da infecção pode ser aplicado a qualquer agente patogénico bacteriano adequadamente rotulado. Desenvolvimento futuro desta técnica terá como objetivo usar a fluorescência tomografia (FLIT), bem como DLIT para facilitar a investigação da resposta do hospedeiro à infecção usando uma combinação de patógenos bacterianos bioluminescentes e injetáveis ​​fluorescentes perto sondas infravermelhas para investigar respostas do hospedeiro à infecção. Em adição a isso, neste protocolo, sódescrevem a utilização de bactérias bioluminescentes para criar 4D filmes de infecção. No entanto, em alguns casos, pode ser necessário o uso de bactérias marcadas fluorescentes, por exemplo marcados com IRFP, de modo que o repórter bioluminescente pode ser utilizado para a investigação genética hospedeiro durante a infecção. Mais importante, o uso de imagens multi-modalidade combinando DLIT / FLIT-μCT permitirá investigar de forma não invasiva vários parâmetros durante uma infecção bacteriana, o que vai contribuir significativamente para a redução, refinamento e substituição do uso de animais em pesquisa científica conforme descrito na iniciativa da NC3R ( <a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a> ).

Modelos de pequenos animais, em especial os que utilizam ratos, são rotineiramente utilizados para investigar patogênese bacteriana ou para testar estratégias de intervenção para infecções, tais como antibióticos, probióticos, prebióticos e vacinas 1-7. As principais leituras experimentais de infecções animais pequenos são carga de patógenos, localização espacial e temporal da infecção, e alterações na resposta imunológica do organismo infectado. Em imagiologia óptica in vivo é uma ferramenta valiosa para a pesquisa de doenças infecciosas e pode ser utilizado para monitorizar múltiplas Leituras experimentais, através da utilização de genes repórteres (proteínas fluorescentes, luciferase, beta-lactamase, etc), corantes fluorescentes, nanopartículas ou sondas quimioluminescentes apontado a um processo biológico da proteína, ou microrganismo 6. Imagem de bioluminescência (BLI) é uma modalidade de imagiologia óptica utilizado para monitorar a colonização de pequenos animais, tais como ratinhos e ratos, por bactericida patogénicaria 3,6,8,9. Os ratinhos são infectados com as bactérias recombinantes que expressam uma luciferase, tal como o operão lux CDABE de Photorhabdus luminescens. Estas bactérias, em seguida, pode ser detectado através da sua produção de luz, utilizando um CCD com base no sistema de imagem in vivo 3,6,9. É importante ressaltar que apenas micro-organismos metabolicamente ativas são bioluminescentes (BL), ou seja, somente as células bacterianas viáveis ​​são detectados por esta metodologia 10,11. Usando 2D BLI, o local da fonte de BL é inferida a partir da superfície do animal, onde o sinal é emitido 8. A localização anatómica exacta dos focos BL in vivo tem de ser determinada através da análise ex vivo de órgãos 3,6,9 Em contraste, a luz difusa 3D tomografia composto (DLIT) pode ser usado para compilar uma reconstrução 3D quantitativa do BL fonte 12. DLIT é realizada através da recolha de imagens BL tiradas com filtros ópticos passa-banda estreitos e definidosposteriormente, introduzindo-os em uma tomografia óptica reconstrução 3D algoritmo difuso 1,7,12,13. Actualmente, imagiologia multimodalidade é o único método disponível para se verdadeira localização anatómica não-invasivo de focos bioluminescente in vivo, sem a necessidade de análise ex vivo. Recentemente, foi utilizada uma combinação de DLIT co-registradas com μCT de imagem para avaliar Citrobacter rodentium (C. rodentium) dinâmica de colonização após o tratamento profilático com uma bactéria probiótica 7. C. rodentium é um patógeno entérico específico murino usado para infecção humana com modelo enteropatogênico e enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. infecção rodentium provoca colite, normalmente associada com perda moderada de peso, diarréia, polarizada Th1 de resposta imune e alterações patológicas distintas, incluindo hiperplasia da cripta do cólon e anexando e discreto lesão formatiem 14. Além disso, C. patogênese rodentium tem sido exaustivamente estudada usando BLI e sua dinâmica de colonização em camundongos C57BL/6J estão bem documentados, fazendo com que esta bactéria um microorganismo modelo ideal para uso com multi-modalidade de imagem 3,4,7. Este protocolo é o primeiro a descrever uma metodologia para imagiologia DLIT-μCT integrada de uma infecção bacteriana utilizando uma única plataforma multimodalidade imagiologia, o IVIS Espectro de CT, e a geração de um filme 4D mostra os verdadeiros dinâmica desta infecção não-invasiva.

<table><tbody><tr><td>Bioluminescente C. rodentium</td><td>Frankel lab</td><td>ICC180</td><td>Wiles et al., 2004</td></tr><tr><td></td><td>Veet Boots</td><td></td><td>O tempo ideal de depilação é de 7 min. A depilação funciona melhor se o creme for bem esfregado.</td></tr><tr><td>Isofluorano (100% v/v)</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cilindro</td><td>Médico de Oxigênio Médico</td><td></td> BOC <td>Tamanho F. <forte>Nota:</forte> é necessário um regulador apropriado.</td></tr><tr><td>Caldo Luria Bertani</td><td>Merck</td><td>1.10285.0500</td><td>25 g em 1L de água desmineralizada.</td></tr><tr><td>Ágar Luria Bertani</td><td>Merck</td><td>1.10283.0500</td><td>37 g em 1L de água desmineralizada.</td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Sigma (Fluka)</td><td>60615</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos cônicos de polipropileno Falcon de 50 ml</td><td>BD (Falcon)</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Universals</td><td>Corning (Gosselin)</td><td>E5633-063</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>BD (Plastipak)</td><td>300013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agulha de dosagem oral (16G x 75 mm) curvada</td><td>Vet Tech</td><td>DE005</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microbancos (Cryovial)</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>PL.170/Y</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paquímetro IVIS Spectrum CT</td><td>- uma empresa PerkinElmer</td><td>133577 Rev A/ Spectrum CT</td><td></td></tr><tr><td>Paquímetro UPS de 6kVA</td><td>- uma empresa</td><td></td> <td>PerkinElmer&nbsp;</td></tr><tr><td>Paquímetro do sistema de anestesia XGI-8</td><td>- uma empresa PerkinElmer</td><td>118918</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinça de Filtro de Anestesia XAF-8 para Carvão</td><td>- a PerkinElmer Company</td><td>118999/00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paquímetro Living Image v4.3.1 SP1</td><td>- uma empresa</td><td></td> <td>PerkinElmer&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubadora de bancada</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 44</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"> </td></tr></tbody></table>

4d multimodalidade de imagens de<em&gt; citrobacter rodentium</em&gt; infecções em ratos

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Este protocolo descreve os passos necessários para monitorar longitudinalmente uma infecção bacteriana bioluminescente utilizando luz difusa tomografia composto 3D integrado com μCT (DLIT-μCT) ea posterior utilização dos dados para gerar um filme de quatro dimensional (4D) do ciclo de infecção. Para desenvolver os filmes de infecção 4D e para validar a imagem DLIT-μCT para estudos de infecção bacteriana utilizando um IVIS Spectrum CT, usamos a infecção com bioluminescente C. rodentium, o que faz com que a auto-limitante colite em ratos. Neste protocolo, descrevemos a infecção de camundongos com bioluminescente C. rodentium e monitoramento não-invasivo da colonização por diária de imagens DLIT-μCT e enumeração de bactérias das fezes para 8 dias. O uso do IVIS Spectrum CT facilita perfeita co-registo de exames ópticos e μCT utilizando uma plataforma de imagem única. A baixa modalidade μCT doses permite a imagem dos camundongosem vários momentos durante a infecção, oferecendo localização anatômica detalhada dos focos de bactérias bioluminescentes em 3D sem causar artefatos da radiação cumulativa. É importante ressaltar que os filmes 4D de camundongos infectados fornecer uma poderosa ferramenta analítica para monitorar a dinâmica de colonização de bactérias in vivo.

A infecção de camundongos C57BL/6J com 5 x 10 9 ufc C. rodentium é um modelo de infecção bacteriana e bem descritas resulta numa infecção gastrointestinal auto-limitante e que os picos entre 6-8 dias após a infecção e dura entre 3 a 4 semanas 2,14. A infecção está confinada ao lúmen intestinal pelo sistema imunitário dos murinos e, como consequência, as bactérias são continuamente eliminados nas fezes. Colonização de ratos por C. rodentium pode ser monitorado de forma não invasiva por enumeração bacteriana direta das fezes, ou imagem de bioluminescência 2,3. Este manuscrito descreve um protocolo otimizado para executar 3D e 4D multimodalidade de imagem de C. rodentium dentro ratos para monitorizar a carga bacteriana e localização durante a infecção. Os resultados apresentados na Figura 1 demonstram os controlos que são necessários para imagiologia 4D bem sucedido. Antes da infecção de ratinhos é essencial para dissuadirmina que o inoculo bacteriano utilizado é bioluminescente (Figura 1A) e que, após a administração por sonda oral de um rato com bioluminescente C. rodentium, que o sinal pode ser observado no estômago do animal, e não nos pulmões (Figura 1B) 16. Além de controlar a colonização bacteriana utilizando imagiologia bioluminescente, é boa prática para quantificar o número de bactérias nas fezes, que é usado como uma medida indirecta da colonização bacteriana da mucosa gastrointestinal Figura 2 demonstra a carga bacteriana típica nas fezes feita a partir de 8 C57BL6 / J. os ratos que foram infectadas com aproximadamente 5 x 10 9 ufc ICC180 e monitorizada durante 8 dias PI Colonização aumenta a partir do dia 2 até o dia PI 6-7, onde os picos de infecção a ~ 5 x 10 10 ufc / g; que está em consonância com os relatórios anteriores 2,3,17. Para enfatizar a importância da avating a propagação da infecção em um único rato, Figuras 1B e 3, bem como um vídeo ter sido gerados a partir do mesmo rato após C. rodentium infecção, tal como descrito acima. Diariamente DLIT-μCT foi utilizado para avaliar a distribuição espacial das bactérias bioluminescentes dentro deste rato, usando o esqueleto como uma referência anatómica. Figura 3 demonstra a reconstrução DLIT-μCT de um rato infectado com C57BL/6J ICC180 em três pontos chave hora PI Em dia 3 PI pequenos focos bioluminescente pode ser observada no cólon, que exibem um aumento moderado na intensidade de bioluminescência durante o dia 5 PI com pouca alteração na distribuição espacial. No dia 7 de PI observou-se um aumento significativo na bioluminescência ea bioluminescente focos espalhados por todo o cólon. Video 1 é uma compilação de reconstruções DLIT-μCT 3D a partir de 1-8 dias PI com ICC180 e ilustra C.rodentium dentro do trato gastrointestinal proximal entre os dias PI 1-2 que se espalha para o cólon no dia 3 PI De 4-6 dias PI os números de bactérias no cólon expandir até um pico no dia 7 PI, onde os focos de bactérias cobre todo o cólon. No dia 8 PI apenas dois focos distintos de bactérias estão presentes no cólon proximal e distal. A capacidade de visualizar a reconstrução 3D completa em cada momento, em ordem cronológica, representa uma poderosa ferramenta para analisar as interações patógeno hospedeiro e é mais fácil de interpretar do que um 3D ainda do mesmo conjunto de dados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> Figura 1. Imagem de bioluminescência 2D A) Bioluminiscente C. rodentium ICC180 inoculo e B) de um rato após administração por sonda oral com 200 mL de inoculo. Arrowhead (&gt;) ilustra bioluminescente C. rodentium </<html> em&gt; no estômago. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> Figura 2. C. dinâmica de colonização rodentium. Quantificação C. rodentium unidades formadoras de colônia de fezes por 8 dias PI <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> Figura 3. Luz difusa imagem tomografia μCT varredura de bioluminescente C. infecção rodentium de um rato monitorados no dia 3, 5 e 7 PI Arrowhead (&gt;) ilustra a colonização do cólon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver o vídeo. 4D filme de infecção por C. rodentium de um rato monitorado a partir de 1-8 dias PI

De imagem multi-modalidade é uma abordagem útil para estudar a colonização bacteriana em modelos de animais pequenos. Este protocolo descreve a infecção de camundongos com bioluminescente<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Eo acompanhamento longitudinal de colonização bacteriana usando luz difusa tomografia 3D composto com μCT imagens para criar um filme 4D de<em&gt; C. rodentium</em&gt; Infecção.

4D Multimodalidade de imagens de<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecções em Ratos

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

O objetivo geral deste procedimento é monitorar o ciclo de infecção por zero DUM utilizando tomografia por imagem de luz difusa composta com micro-TC integrada para criar um filme em quatro dimensões da infecção. Isso é realizado primeiramente preparando um inóculo bacteriano bioluminescente. O segundo passo do procedimento é infectar camundongos por gavagem oral com zero dunum.Os camundongos infectados são então imageados diariamente utilizando microtomografia computadorizada com luz D, e os passos finais consistem em reconstruir os dados tridimensionais de microtomografia por emissão de luz (DLI) e compilá-los em um filme quadridimensional do ciclo de infecção. Em última análise, os resultados podem demonstrar a alteração na distribuição e na localização da carga bacteriana por meio do imageamento multimodal quadridimensional em camundongos infectados. Dr. James Collins.Um pós-doutorando do meu laboratório demonstrará o procedimento hoje à tarde. No dia anterior à infecção, retire um tubo de criopreservação da linhagem Zymo deum IC 180 para descongelar; assim que descongelado, adicione uma pérola de criopreservação de bactérias a 15 mililitros de LB com canamicina, e então deixe o cultivo crescer durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 220 RPM. Além disso, cultive 15 mililitros de LB não inoculado para controlar contaminação do meio na manhã seguinte.Se o controle inoculado com UN não estiver turvo, transfira a cultura inoculada para um tubo de 50 mililitros e centrifugue a 4.000 RPM por 10 minutos a quatro graus Celsius. Recoloque o pellet em um volume de PBS e repita a centrifugação. Em seguida, ressuspenda completamente as células em 1,5 mililitro de PBS para criar o inóculo bacteriano. Para verificar se a cultura ICC 180 é bioluminescente e para estimar o número de bactérias, image a cultura no sistema IVIS Spectrum CT utilizando imagem de bioluminescência com filtro aberto e use a configuração automática no Living Image, versão 4.3 0.1.Isso é descrito em detalhes em um vídeo previamente publicado. Para demonstrar a infecção de camundongos com roedor bioluminescente, infectaremos um camundongo e usaremos outro camundongo para uma infecção simulada com PBS. Antes de realizar a infecção, anestesie o camundongo com isoflurano a 3% utilizando um sistema de anestesia XGI eight para fornecer contenção humanitária enquanto a anestesia faz efeito completamente.Prepare a suspensão bacteriana e aspire um número conhecido de bactérias em 0,2 mililitros para dentro de uma seringa para gavagem oral. Agora, pegue o primeiro camundongo a ser infectado com um aperto firme na pele da nuca. Observe que os camundongos foram previamente despilados antes da imagem usando creme depilatório conforme descrito no artigo, empurre a agulha em direção ao teto da boca, por cima da língua e para dentro do esôfago, e injete a inoculação bacteriana diretamente no estômago.Se houver resistência, não force a agulha, pois isso fará com que o inóculo seja depositado nos pulmões; reinsira suavemente a agulha. Posteriormente, se o camundongo apresentar dificuldade para respirar ou andar, ele deve ser eutanasiado no caso da infecção simulada. Realize uma gavagem no camundongo com 0,2 mililitros de PBS para confirmar que a gavagem oral foi realizada corretamente.Image os camundongos no espectro de CT por USIV utilizando imagem de bioluminescência com filtro aberto e use a configuração automática no living image. O assistente de imagem 4,3 0,1 conforme descrito anteriormente, o micro-CT Delight envolve imagem óptica Delight integrada a um exame de micro-CT com baixa dose de radiação. Como a dose se acumula nos animais a cada sessão de imagem, nosso objetivo é mantê-la tão baixa quanto razoavelmente possível.Devido a essas preocupações, os camundongos devem ser eutanasiados ao primeiro sinal de sintomas prejudiciais ou ao final do período de imagem por micro-TC. Para este estudo, otimize os parâmetros do recurso de exposição automática no Living Image 4.3 0.1 para a imagem da luciferase bacteriana in vivo. Primeiro, selecione editar, depois preferências, depois aquisição e, em seguida, a janela de exposição automática.Em seguida, selecione os valores de intervalo seguidos pelo tempo do experimento em segundos e defina o máximo em 300 segundos. Por fim, selecione a contagem mínima alvo seguida pela luminescência e defina esse valor em 10.000 contagens. Uma vez que o sistema tenha sido inicializado, a anestesia tiver sido configurada e as travas de segurança de raio-x tiverem sido verificadas.Prossiga com a anestesia de um camundongo. Utilize um sistema de anestesia XGI eight com uma taxa de fluxo de oxigênio de dois litros por minuto e 3% de isoflurano. Com o camundongo preparado para a aquisição de imagens, abra o assistente de aquisição no software.Esta ferramenta otimiza automaticamente diversos parâmetros para fornecer a melhor relação sinal-ruído possível para cada filtro de emissão selecionado. Quando solicitado pelo assistente de imagem, inclua os filtros de emissão de quinhentos e sessenta, oitocentos, seiscentos e vinte nanômetros. Em seguida, certifique-se de que a microtomografia computadorizada de um camundongo esteja selecionada e clique em adquirir para iniciar a aquisição de imagens.Após retornar o camundongo anestesiado à sua gaiola, remova a plataforma de imagem única do espectro CT e desinfete a plataforma do animal usando tri gene a 1%. Observação. Se a plataforma do animal estiver muito suja, a almofada de espuma pode ser substituída. Continue a realizar imagens dos camundongos diariamente até oito dias após a infecção para gerar os dados de imagem longitudinal.Períodos experimentais mais longos aumentam a probabilidade de artefatos devido à exposição acumulada à radiação. Para produzir reconstruções de microtomografia tridimensional de alta qualidade e reprodutíveis com luz de três DD, são necessários diversos passos. Primeiro, abra o software Living Image, versão 4.3 0.1, e selecione Procurar na janela de navegação.Abra a pasta que contém os arquivos micro-TC do Delight clicando em carregar. Abra o arquivo micro-TC do DLI no navegador de imagens vivas. Por exemplo, veja o sétimo dia após a infecção.No painel de ferramentas, selecione topografia da superfície seguida por camundongo nu. Ajuste o limite e clique em gerar superfície. Se a reconstrução da superfície for bem-sucedida, um contorno da superfície será exibido na janela de visualização 3D.Para visualizar a microtomografia computadorizada renderizada na janela de visualização 3D, oculte o contorno da superfície ou reduza a opacidade da superfície. Ambas as opções são acessadas selecionando primeiro as ferramentas ópticas 3D. Em seguida, desmarque exibir objeto de superfície ou ajuste a barra deslizante de opacidade para fornecer uma localização anatômica detalhada da reconstrução luminosa de três DD.Em referência ao esqueleto animal, altere os dados volumétricos tridimensionais. Para visualizar o esqueleto com contraste ideal, clique em ferramentas multimodais 3D e ajuste o controle deslizante do histograma para a direita até que apenas os ossos fiquem claramente visíveis. Em seguida, se ainda não estiver selecionado, clique em histograma logarítmico, inverta o gradiente de cor e ative a iluminação de qualidade e a redução de ruído.Se desejar, recorte a imagem para remover quaisquer estruturas indesejadas da reconstrução 3D na paleta de ferramentas, selecione a reconstrução 3D D light. Certifique-se de que apenas os filtros de quinhentos e sessenta e cinco, oitenta e seis e cento e seis vinte nanômetros estejam selecionados. Em seguida, clique em iniciar.Isso abre a janela de visualização dos dados com os sinais de bioluminescência espectrofiltrados do camundongo imageado em 2D. Esses sinais são automaticamente limiados pelo software, mas podem ser ajustados manualmente, se necessário, usando as guias na parte inferior do menu. O limiar determina a intensidade mínima do sinal que será incluída como dado na reconstrução.A seguir, na paleta de ferramentas, selecione a reconstrução tridimensional por microtomografia D light e verifique as propriedades ópticas. Ao clicar na aba propriedades, as propriedades do tecido devem ser definidas como tecido de camundongo e o espectro da fonte como bactéria. Agora, clique em reconstruir para realizar a reconstrução D light.A localização real do sinal luminoso D, destacado em círculo vermelho, encontra-se dentro da cintura pélvica. Isso é mais fácil de interpretar quando a imagem gira durante o filme. Para gerar o filme 3D micro-TC DLI, vá ao menu ferramentas e selecione animação 3D, animações predefinidas, eixo no sentido anti-horário e, em seguida, duração total.Defina este valor como 10 segundos ou 25 quadros por segundo. Uma vez que as configurações da animação 3D estejam corretas, pressione gravar e salve as reconstruções tridimensionais de microtomografia computadorizada DLI como arquivos VI. É fundamental realizar essas reconstruções utilizando configurações idênticas para que sejam comparáveis.Também é importante produzir os vídeos usando o mesmo número de quadros por segundo e a mesma duração total. Caso contrário, a sincronização dos 40 vídeos não será homogênea. No computador, abra o Windows Live Movie Maker e crie um novo arquivo.Insira as reconstruções de micro-TC DLI em ordem cronológica a partir do primeiro dia após a infecção. Usando a guia ferramentas, adicione legendas ao início de cada vídeo selecionando o vídeo, selecionando início e, em seguida, selecionando adicionar legenda. O texto da legenda pode ser formatado por meio da barra de ferramentas e a posição da legenda também é ajustável.Agora, adicione uma página de título clicando em início e depois em título. Digite seu título na caixa usando a barra de ferramentas para formatar o texto. Em seguida, salve o projeto como um arquivo MMP.Isso é essencial se você deseja editar o vídeo. Por fim, salve o vídeo como um arquivo WMV no menu do criador de filmes, selecione salvar filme e escolha as quatro opções de controle do computador, que são essenciais para uma boa técnica. Antes de infectar os camundongos, determinou-se que o inóculo bacteriano utilizado era bioluminescente.Após a gavagem oral com o roedor bioluminescente, verificou-se se o sinal poderia ser observado no estômago do animal, ilustrado por uma seta branca, e ausente dos pulmões. O mesmo camundongo será mostrado em exemplos subsequentes de uma infecção individual. *Zero denture* é um patógeno extracelular confinado à luz intestinal durante a infecção demonstrada.Assim, é eliminado nas fezes, que foram analisadas para demonstrar que a colonização aumenta do segundo até o sexto ou sétimo dia, quando a infecção atinge seu pico diário. A microtomografia computadorizada em luz D foi utilizada para avaliar a distribuição espacial de bactérias bioluminescentes neste camundongo, usando o esqueleto como referência anatômica. No terceiro dia pós-infecção, pequenos focos bioluminescentes foram observados no cólon, indicados por uma seta azul.Esses focos exibiram um aumento moderado na intensidade da bioluminescência no quinto dia após a infecção, com pouca alteração na distribuição espacial no sétimo dia após a infecção; houve um aumento significativo da bioluminescência e os focos bioluminescentes se espalharam por todo o cólon. Três reconstruções de microtomografia computadorizada em luz DD dos dias um a oito após a infecção ilustram a disseminação da infecção pelo sero deum. A infecção bacteriana começa como focos distintos no trato gastrointestinal proximal.No terceiro dia, a infecção se espalha para o cólon. Nos próximos dias, os focos de infecção se disseminam ainda mais, aumentando em tamanho e número. A infecção atinge seu pico no sétimo dia.Em seguida, no oitavo dia, as colônias foram reduzidas a dois focos bacterianos distintos no cólon proximal e distal. Esta tecnologia permitirá aos pesquisadores estudar os mecanismos de colonização bacteriana e infecção em tempo real e investigar a eficácia de estratégias de intervenção.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Métodos de imagem de bioluminescência de infecções bacterianas em animais vivos são descritos. Patógenos são modificados para expressar luciferase permitindo que imagens de corpo inteiro óptico de infecções em animais vivos. Modelos animais podem ser infectados com patógenos luciferase expressar eo curso resultante de doença visualizadas em tempo real pela imagem de bioluminescência.

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Fonte: Valentine, M. E., et al., Geração de mutantes de deleção gênica em quadro em Pseudomonas aeruginosa e Teste para Atenuação de Virulência em um Modelo Simples de Infecção em Camundongo. J. Vis. Experiência (2020)Este vídeo demonstra o uso de uma abordagem de imagem baseada em bioluminescência para monitorar infecção bacteriana em um modelo de camundongo vivo. Imagens bioluminescentes e por raios X sequenciais permitem visualização em tempo real e localização anatômica da infecção...

Imagem em tempo real de infecção bacteriana em um modelo de camundongo usando bioluminescência

Fonte: Luyts, N., et al. Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando imagem por bioluminescência. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra a indução e o rastreamento da infecção do trato urinário em um modelo camundongo usando E. coli bioluminescente injetada na bexiga, onde ocorrem adesão, invasão bacteriana e replicação intracelular. A luz emitida pelo operon bioluminescente serve como marcador em tempo real da carga bacteriana durante a...

Visualização da Infecção do Trato Urinário em um modelo de camundongo usando bioluminescência

Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de infecções bacterianas entéricas, bem como resposta imune do hospedeiro e colite em ratos. Este protocolo descreve a medição da integridade da barreira, a carga de patógenos e danos histológicos permitindo a caracterização completa de agentes patogénicos e de acolhimento contribuições para colite infecciosa murino.

O<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Modelo de Rato: Contribuições Estudar patógeno e hospedeiro para Colite Infecciosa

Este protocolo descreve o modelo do rato cefoperazona de infecção por Clostridium difficile (CDI), utilizando uma estirpe clinicamente relevante e geneticamente-tratável, R20291. Ênfase na monitorização clínica da doença, C. difficile enumeração bacteriana, a citotoxicidade de toxinas, e alterações histopatológicas em todo CDI em um modelo de rato estão detalhadas no protocolo.

tratados com Cefoperazone Rato Modelo de clinicamente relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 Strain

Um protocolo detalhado de um modelo de mouse para enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) colonização usando bactérias bioluminescência-etiquetado é apresentado. A detecção destas bactérias bioluminescentes por um não-invasivo na vivo sistema de animais vivos de imagem pode avançar nossa compreensão atual da colonização de EHEC.

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

Descrevemos a imagem óptica de camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) usando fluorescência de enzima repórter (REF). Esse protocolo proporciona uma detecção sensível e específica de M. tuberculosis em modelos animais pré-clínicos para investigação patogenia, terapêutica e vacina.

Mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem

Um novo método de preparação de amostras é demonstrado para a análise de macrocolônias bacterianas à base de ágar por meio de espectrometria de massa por imagem de dessorção/ionização a laser assistida por matriz.

Investigação da Cooperação Microbiana via Análise de Espectrometria de Massa por Imagem de Colônias Bacterianas Cultivadas em Ágar e em Tecido Durante a Infecção

A tradução dos achados da microscopia intravital é desafiada por sua penetração em profundidade rasa no tecido. Aqui, descrevemos um modelo de camundongo com câmara de janela dorsal que permite o co-registro de microscopia intravital e modalidades de imagem clinicamente aplicáveis (por exemplo, TC, RM) para correlação espacial direta, potencialmente simplificando a tradução clínica dos achados da microscopia intravital.

Um modelo de camundongo tumoral de câmara de janela de dobra cutânea dorsal para microscopia intravital combinada e ressonância magnética na pesquisa translacional do câncer

Aqui, descrevemos um procedimento que permite a detecção de bactérias patogênicas em todo o órgão durante a infecção e a quantificação das atividades do repórter fluorescente.

Tomografia tridimensional de órgãos inteiros de alta resolução de infecções microbianas

Aqui, apresentamos um protocolo para imagem intravital de um Mycobacterium tuberculosis aprovado por BSL-2 atenuado. Cepa no pulmão murino usando uma janela pulmonar permanente. Essa abordagem permite a análise longitudinal com resolução de célula única das interações precoces hospedeiro-patógeno, incluindo localização bacilar, dinâmica vascular e captação de macrófagos dentro do mesmo microambiente pulmonar.

Imagem intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado no pulmão murino durante infecção intravascular precoce

Aprenda a monitorar o ciclo de infecção por Citrobacter rodentium em camundongos usando imagem 4D multimodal com DLI e μCT. Este método permite visualizar a colonização bacteriana em tempo real.

4D Multimodalidade de imagens de

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