4D Multimodalidade de imagens de Citrobacter rodentium Infecções em Ratos

O objetivo geral deste procedimento é monitorar o ciclo de infecção zero DUM usando tomografia de imagem de luz difusa composta com micro CT integrada para criar um filme de quatro D da infecção. Isso é feito preparando primeiro um inóculo bacteriano bioluminescente. A segunda etapa do procedimento é infectar camundongos por gavagem oral com zero dunum.

Os camundongos infectados são então fotografados diariamente usando micro ct D light, e as etapas finais são reconstruir os dados de micro CT 3D DLI e compilá-los em um filme de quatro D do ciclo de infecção. Em última análise, os resultados podem mostrar a mudança na distribuição e localização da carga bacteriana por meio da imagem multimodal de quatro D de camundongos infectados. Dr. James Collins.

Um pós-doutorado em meu laboratório demonstrará o procedimento hoje No final da tarde do dia anterior à infecção, coloque um frasco criogênico de cepa zero deum IC 180 para descongelar assim que for descongelado em um cordão criogênico de bactérias para 15 mililitros de lb. Com a micina, defina a cultura para crescer durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 220 RPM. Também cultive 15 mililitros de LB não inoculado para controlar a contaminação do meio na manhã seguinte.

Se o controlo inoculado pela ONU não estiver turvo, transferir a cultura inoculada para um tubo de 50 mililitros e centrifugá-la a 4 000 rpm durante 10 minutos. Em seguida, ressuspenda completamente as células em 1,5 mililitros de PBS para criar o inóculo bacteriano. Para verificar se a cultura ICC 180 é bioluminescente e estimar o número de bactérias, faça a imagem da cultura na TC do espectro ivus usando imagens de bioluminescência de filtro aberto e use a configuração automática na imagem viva, 4.3 0.1 assistente.

Isso é descrito em detalhes em um vídeo publicado anteriormente. Para demonstrar a infecção de camundongos com roedor bioluminescente, infectaremos um camundongo e usaremos um camundongo para uma infecção simulada com PBS. Antes de realizar a infecção, anestesiar o camundongo com 3% de flúor usando um sistema de anestesia XGI oito para fornecer contenção humana enquanto a anestesia se firma completamente.

Misture o inóculo bacteriano e desenhe um número conhecido de bactérias em 0,2 mililitros em uma seringa para gavagem oral. Agora recupere o primeiro mouse a infectar segurando firmemente sua nuca. Observe que os camundongos foram esgotados antes da imagem usando creme detory, conforme descrito no artigo de texto, empurre a agulha em direção ao céu da boca sobre a língua e desça pelo esôfago e injete o inóculo bacteriano no estômago.

Se houver resistência, não force a agulha, pois isso colocará o inóculo nos pulmões, em vez disso, reinsira suavemente a agulha. Posteriormente, se o camundongo tiver problemas para respirar ou andar, ele deve ser sacrificado para a infecção simulada. Gavagem em um camundongo com 0,2 mililitros de PBS para confirmar que a gavagem oral foi realizada corretamente.

Visualize os camundongos na TC do espectro IVUS usando imagens de bioluminescência de filtro aberto e use a configuração automática na imagem viva. 4.3 0.1 Assistente de imagem Conforme descrito anteriormente, a micro TC Delight envolve imagens ópticas delight integradas a uma microtomografia computadorizada de baixa dose de radiação. Como a dose acumula os animais de cada sessão de imagem, nosso objetivo é manter a dose o mais baixa possível.

Devido a essas preocupações, os camundongos devem ser chamados ao primeiro sinal de sintomas prejudiciais ou no final do período de microtomografia computadorizada. Para este estudo, otimize os parâmetros do recurso de exposição automática na imagem viva 4.3 0.1 para imagens de luciferase bacteriana in vivo. Primeiro selecione editar, depois preferências, depois aquisição e depois janela de exposição automática.

Em seguida, selecione os valores de intervalo seguidos pelo tempo do experimento em segundos e defina o máximo como 300 segundos. Por fim, selecione a contagem mínima de alvos seguida de luminescência e defina esse valor como 10.000 contagens. Uma vez que o sistema tenha sido inicializado, a anestesia foi configurada e os intertravamentos de segurança de raios-x foram verificados.

Prossiga com a anestesia de um rato. Use um sistema de anestesia XGI oito com uma taxa de fluxo de oxigênio de dois litros por minuto e 3% de flúor. Com o mouse pronto para a geração de imagens, abra o assistente de geração de imagens no software.

Esta ferramenta otimiza automaticamente vários parâmetros para fornecer a melhor relação sinal-ruído possível para cada filtro de emissão selecionado. Quando solicitado pelo assistente de imagem, inclua os filtros de emissão de cinco, sessenta e cinco, oitenta e seiscentos e seis e vinte nanômetros. Em seguida, certifique-se de que a microtomografia computadorizada de um mouse esteja selecionada e clique em adquirir para iniciar a imagem.

Depois de retornar o camundongo anestesiado à sua gaiola, remova a plataforma de imagem de um camundongo da TC de espectro e desinfete a plataforma animal usando o gene 1%tri. Nota. Se a plataforma do animal estiver muito suja, a almofada de espuma pode ser substituída. Continue a imagem dos camundongos diariamente até oito dias após a infecção para gerar os dados de imagem longitudinais.

Períodos de teste mais longos aumentam a probabilidade de artefatos devido à exposição cumulativa à radiação. Para produzir três reconstruções de micro TC de luz DD reprodutíveis de alta qualidade, são necessárias várias etapas. Primeiro, abra o software de imagem viva, 4.3 0.1 e selecione Procurar na janela de navegação.

Abra a pasta que contém os arquivos delight micro CT clicando em carregar. Abra o arquivo micro CT DLI no navegador de imagens vivas. Por exemplo, veja deum dia sete pós-infecção.

Na paleta de ferramentas, selecione topografia de superfície seguida de mouse nu. Ajuste o limite e clique em gerar superfície. Se a reconstrução da superfície for bem-sucedida, um contorno de superfície será exibido na janela de visualização 3D.

Para visualizar a micro TC renderizada na janela de visualização 3D, oculte o contorno da superfície ou diminua a opacidade da superfície. Ambas as opções são acessadas selecionando primeiro as ferramentas ópticas 3D. Em seguida, desmarque a exibição do objeto da superfície ou ajuste a barra deslizante de opacidade para fornecer uma localização anatômica detalhada da reconstrução de três luzes DD.

Em referência ao esqueleto do animal, altere os dados volumétricos 3D. Para visualizar o esqueleto com contraste ideal, clique em Ferramentas de multimodalidade 3D e ajuste o controle deslizante do histograma para a direita até que apenas os ossos estejam claramente visíveis. Em seguida, se ainda não estiver selecionado, clique em histograma logarítmico, inverter a qualidade da iluminação do gradiente de coloração e reduzir o ruído.

Se desejar, corte a imagem para remover quaisquer estruturas indesejadas da reconstrução 3D da paleta de ferramentas, selecione D light 3D reconstruction. Certifique-se de que apenas os filtros cinco, sessenta e cinco, oitenta e seiscentos e seis e vinte nanômetros sejam selecionados. Em seguida, clique em iniciar.

Isso abre a janela de visualização de dados com os sinais de bioluminescência filtrados espectralmente do mouse fotografado em 2D. Esses sinais são automaticamente limitados pelo software, mas podem ser ajustados manualmente, se necessário, usando guias na parte inferior do menu. O limite determina a intensidade mínima de dados que será incluída como dados na reconstrução.

Em seguida, na paleta de ferramentas, selecione a reconstrução D light micro CT 3D e verifique as propriedades ópticas. Ao clicar na guia de propriedades, as propriedades do tecido devem ser definidas como tecido de camundongo, o espectro de origem definido como bactérias. Agora clique em reconstruir para realizar a reconstrução da luz D.

A localização real do sinal luminoso D circulado em vermelho está dentro da cintura pélvica. Isso é mais fácil de interpretar quando a imagem gira durante o filme. Para gerar o filme DLI micro CT 3D, vá para o menu de ferramentas e selecione animações predefinidas de animação 3D, eixo no sentido anti-horário e, em seguida, duração total.

Defina esse valor como 10 segundos ou 25 quadros por segundo. Quando as configurações da animação 3D estiverem corretas, pressione gravar e salve as reconstruções DLI micro CT 3D como um arquivo VI. É vital fazer essas reconstruções usando configurações idênticas para que sejam comparáveis.

Também é importante fazer os vídeos usando o mesmo número de quadros por segundo e duração total. Caso contrário, o tempo do vídeo 40 não é homogêneo. No computador, abra o Windows Live Movie Maker e crie um novo arquivo.

Insira as reconstruções de micro TC DLI em ordem cronológica desde o primeiro dia após a infecção. Usando a guia de ferramentas, adicione legendas ao início de cada vídeo selecionando o vídeo, selecionando página inicial e, em seguida, selecionando adicionar legenda. O texto na legenda pode ser formatado na barra de ferramentas e o local da legenda também é ajustável.

Agora adicione uma página de título clicando em home e depois em title. Digite seu título na caixa usando a barra de ferramentas para formatar o texto. Em seguida, salve o projeto como um arquivo MMP.

Isso é essencial se você quiser alterar o filme. Por fim, salve o filme como um arquivo WMV no menu do criador de filmes, selecione salvar filme e escolha as quatro opções de computador que os controles são essenciais para uma boa técnica. Antes de infectar camundongos, o inóculo bacteriano usado foi determinado como bioluminescente.

Após a gavagem oral com roedor bioluminescente, verificou-se se o sinal podia ser observado no estômago do animal ilustrado por uma ponta de seta branca e ausente dos pulmões. O mesmo camundongo será mostrado em exemplos subsequentes de uma infecção individual. A prótese zero é um patógeno extracelular confinado ao lúmen intestinal durante a infecção demonstrada.

Assim, é eliminado nas fezes, que foram analisadas para mostrar que a colonização aumenta do segundo para o sexto ou sétimo dia, quando a infecção atinge o pico diariamente. A micro TC de luz D foi usada para avaliar a distribuição espacial de bactérias bioluminescentes dentro deste camundongo usando o esqueleto como referência anatômica. No terceiro dia, pós-infecção, pequenos focos bioluminescentes foram observados no cólon ilustrados por uma seta azul.

Esses focos exibiram um aumento moderado na intensidade da bioluminescência no quinto dia pós-infecção, com pouca mudança na distribuição espacial no sétimo dia pós-infecção, houve um aumento significativo na bioluminescência e os focos bioluminescentes se espalharam por todo o cólon. Três reconstruções de microtomografia computadorizada de luz DD do primeiro ao oitavo dia após a infecção ilustram a disseminação da infecção por soro deum. A infecção bacteriana começa como focos distintos dentro do gastrointestinal proximal.

No terceiro dia, a infecção se espalha para o cólon. Nos dias seguintes, os focos de infecção se espalharam ainda mais, crescendo em tamanho e número. A infecção atinge seu pico no sétimo dia.

Então, no oitavo dia, as colônias foram reduzidas a dois focos bacterianos distintos no cólon proximal e distal. Essa tecnologia permitirá que os pesquisadores estudem o mecanismo de colonização e infecção bacteriana em tempo real e investiguem a eficácia das estratégias de intervenção.