Name: Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Aprenda a transduzir células T CD4 naive com adenovírus para estudar diferenciação Treg. Este método permite expressão transiente de genes sem afetar viabilidade celular ou potencial de diferenciação.

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Os autores gostariam de agradecer a Lirui Du para a construção do vetor pCAGAdDU e Oliver Gorka para a prestação do protocolo de fixação.

1. A clonagem de um gene de interesse num vector de entrada <ol><li> Clonar o gene de interesse num vector de entrada. A amplificação por PCR do gene seguido por ligação blunt-end num vector de topoisomerase acoplado (por exemplo, pENTR / D-TOPO) ou enzima de restrição mediada clonagem pode ser utilizado para este procedimento. </li></ol> 2. Transferir o gene de interesse para o pCAGAdDu Destino Vector <ol><li> Transferência do gene de interesse a partir do vector de entrada no vector de destino por LR recombinação (por exemplo, mistura de Gateway LR Clonase Enzima II). Isto irá criar o vector de expressão de adenovírus (Figura 1). </li><li> Linearizar 10 ug do vector de expressão de adenovírus numa digestão de restrição PacI, precipitar o ADN e ressuspender em água a uma concentração de 3 ug por 100 ul. A linearização liberta as repetições invertidas virais (ITRs), que são necessários para a replicação e encapsidação do vADN Iral em partículas de vírus. </li></ol> 3. A geração do vírus lisado Primária <ol><li> Semente de 1 x 10 5 células HEK293A em 2 ml de meio de cultura celular (DMEM, 10% FBS, 5% de PenStrep) em um poço de uma placa de 6 poços e incubar as células durante 6-14 horas a 37 ° C num 10% incubadora de CO 2 para permitir que adiram. As células devem ser, em seguida, a cerca de 50% de confluência. </li><li> A lipofecção: Transferência 6 ul de reagente jetPEI em 94 ul de 50 mM de NaCl, de forma breve vórtice. Adicionar a solução da mistura de 100 ul vector de adenovírus linearizado enquanto vórtex e incubar essa mistura de transfecção durante 15 - 30 min à temperatura ambiente. </li></ol> Executar todas as etapas nas condições de biossegurança adequadas para infecção adenovírus! <ol start="3"><li> Dispensar a solução gota a gota sobre a célula contendo HEK293A bem e incubar as células a 37 ° C e 10% de CO 2. Quando se utiliza um marcador de fluorescência, avaliar a transfeeficiência cção visualmente após 12-36 horas usando um microscópio de fluorescência invertido. Adicionar 0,5 ml de meio fresco a cada 3 dias. </li><li> Verifique a cada 2 - 3 dias com um microscópio de luz ou de fluorescência para efeitos citopáticos (CPE), que são áreas com células ampliadas e arredondadas que começam a destacar. Isto é indicativo de geração de vírus eficiente. Após a ocorrência de zonas mais amplas de CPE (Figura 3), vai demorar 24-72 horas antes de todas as células são infectadas. </li><li> Quando todas as células apresentam sinais de CPE, mas antes de uma separação total das células ocorre, separar as células por pipetagem suave e transferência de células com o sobrenadante (SN, 3-5 mL) para um tubo de poliestireno de 15 ml. </li><li> Congelar as células no SN em gelo seco durante 15 - 20 min e descongelar-los rapidamente a 37 ° C depois da ruptura das células. Repetir este-e-ciclo congelação-descongelação (F / CT) mais duas vezes. Manter o lisado de vírus primário em gelo para o uso dentro de um dia ou de congelar a -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Qualquer F adicional/ TC irá reduzir o título de vírus por 30 - 50%. </li></ol> 4. Amplification vírus <ol><li> Sementes e crescer as células HEK293A a 90% de confluência num prato de 14 cm de tecido de cultura. </li><li> Infectar as células com metade do lisado de vírus principal (1.5 - 2,5 ml) e incubar as células durante pelo menos 36 horas. Quase todas as células infectadas devem ser, em seguida, o que pode ser determinado por microscopia de fluorescência. Para a re-amplificação de um stock de virus já amplificado (ou seja, mais concentrado), infectar HEK293A a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 50 (ver 6.3). </li><li> As células devem ser colhidas quando todos eles mostram CPE, mas antes de desapego. Com a produção de vírus eficiente este estado é alcançado dentro de 48 horas após a infecção. (Se demorar até uma semana, considerar uma outra rodada de amplificação, aumentando a quantidade de estoque adenovírus usado para a infecção descrito no ponto 4.2.) </li><li> Retire as células por pipetagem suave e células de transferência e SN para um tubo de poliestireno de 50 ml. Girar células para baixo a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Remover o SN e ressuspender o sedimento em um volume apropriado de meio ou SN (ca. 1 mL). </li><li> Realizar 3 F / CT perturbar as células e centrifugar a 800 xg durante 15 min a 4 ° C. Retire a SN que contém as partículas virais (isto é, o lisado de vírus concentrado), e do lisado de vírus aliquota para armazená-lo a -80 ° C. </li></ol> 5. Vírus Titer Determinação <ol><li> Semente 10 5 células A549 por cavidade em cinco poços de uma placa de 12 poços em 1 ml de meio e deixar as células aderir durante 6 horas. </li><li> Use 1 ul de adenovírus concentrado (descongeladas em gelo) para realizar uma diluição em série em meio (1:5.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) e adicionam-se 10 ul por poço. Deixar um poço não infectado para ajustar o gating em citometria de fluxo. </li><li> Após 36 horas, retire a SN, lave com células PBS e detach (por exemplo, por tripsinização). Para precauções de risco biológico, é recomendado para corrigir cells em 100 uL de paraformaldeído 4% em PBS durante 10 min à temperatura ambiente e lavagem com PBS uma vez. </li><li> Faça uma análise FACS de expressão do marcador da infecção. Plot &#39;ul de lisado viral aplicado »contra o número absoluto de células infectadas (Figura 4). Determinar o intervalo linear da infecção e calcular o título de vírus por ml não diluído a partir da curva padrão no intervalo linear utilizando x = 1.000 ul. </li></ol> 6. Infecção celular T <ol><li> Isolar células T CD4 naive / descanso de DO11.10 tg; camundongos tg CARΔ1 usando MACS (Naive CD4 + T Cell Isolation Kit II) ou FACS classificação (CD4 + CD25-CD62L-CD44 +). </li><li> Para as experiências de pequena escala, pipetar um volume adequado de lisado viral para obter um MOI de 50 para um poço de uma placa de 96 poços de fundo redondo. </li><li> Adicionar até 4 x 10 5 células T num volume final de infecção de 50 ul, em meio de células T (RPMI 1640, 10% de FBS, 5% de PenStrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Essencialvitamina, 1x L-glutamina, 1:250.000 mercaptoetanol, HEPES 10 mM). Exemplo: Uma MOI de 50 será utilizado para infectar 3 x 10 5 células T; o título viral é de 3 x 10 9 mL1 Vírus de volume = MOI x número de células T / título viral = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0.005 ml </li></ol> Nota: para a infecção do número de células maiores, ampliar usando um MOI de 50 em um volume de infecção de 165 mL por 10 6 células T virgens em um tubo de poliestireno com o copo solta (até tp 3 ml por tubo). <ol start="4"><li> Incubar as células durante 90 min a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Gire as células a 300 xg por 5 min à temperatura ambiente, tire SN, ressuspender em 200 mL PBS. Centrifugar novamente e tirar SN. </li></ol> (Opcional: as células podem ser lavadas outra vez para remover o vírus de forma mais eficiente) <ol start="6"><li> Ressuspender as célulasem 200 ul de meio de células T sem os anticorpos estimulantes e sem IL-2 ou outras citocinas e descanse por 40 horas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora para permitir a expressão do gene de interesse antes da activação. </li></ol> 7. Ativação de células T e Polarização <ol><li> Pipetar um volume de anti-CD3 e anti-CD28 contas acoplados que é igual ao número de células (por exemplo, 4 x 10 5) em um copo pequeno de reagente, adicionar o volume 10 vezes maior de PBS e colocá-los em um ímã para 2 min . Retire o sobrenadante e ressuspender as esferas em 200 ul de meio de polarização (Tregs: meio de células T + 1 ng / ml de TGF-p, com 100 U / ml de IL-2). </li></ol> Nota: As células também pode ser activado usando pratos de cultura de tecidos revestidas com anticorpos anti-CD28 e anti-CD3, ou de uma forma específica do receptor de células T usando DO11.10 irradiados BALB / c esplenócitos pulsadas com o péptido de ovalbumina 323-339 antigénio. <ol start="2"><li> Centrifuge descansou a células de antes, tirar o SN e Ressuspender as células em 200 mL meio de polarização contendo anti-CD3 e anti-CD28-anticorpo acoplado contas. Incubar durante 72 horas a 37 ° C numa incubadora de 5% de CO 2, sem alterar médio. </li></ol> 8. T fixação das células e coloração para Citometria de Fluxo <ol><li> Lave as células: Gire as células a 300 xg por 5 min à temperatura ambiente, tire SN, ressuspender em 200 mL PBS. Centrifugar novamente e tirar SN. Executar todas as etapas de lavagem em conformidade. </li><li> Ressuspender as células em 100 ul de solução de coloração de células fixável mortos e incubar durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar as células, ressuspender em 100 ul de PBS, adicionar 100 uL de paraformaldeído 4% em PBS, incubar 15 min a RT. </li><li> Lavar as células, ressuspender em 200 ul deles gelada metanol a 70% em PBS, e incubar durante 30 min em gelo. </li></ol> Nota: As células podem ser tratadas a partir de agora, sem precauções de risco biológico!<ol start="5"><li> Preparar 60 ul mestre de mistura de 60 ul de PBS + 10 ug / ml de Fc-bloco (anti-FCR3 para bloquear a ligação inespecífica). Lavar as células, ressuspender-los em 40 ul de PBS + anti-FCR3 e incubar 15 min a RT. </li><li> Adicionar 20 ul de PBS + anti-FCR3 contendo 1 ug de PE-anti-anticorpo acoplado Foxp3, misturar bem e incubar a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lave as células duas vezes em PBS e analisar as células de um citómetro de fluxo. </li></ol>

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Os autores declaram que não há conflito de interesse.

Geração de vírus e Titulação Para obter resultados de transfecção ideais, a qualidade ea quantidade de linear vetor aparecem mais importante. Não foram observados efeitos negativos sobre a produção primária a partir de um lisado supercrescimento inicial da cultura, desde a infecção prosseguir rapidamente uma vez que a produção de vírus eficiente ocorre. No entanto, a produção de vírus por células HEK293A pode ser afectada por inserções longas que reduzem a eficiência. Algumas estruturas de leit...

Tregs são cruciais para manter a tolerância imunológica e diminuir as respostas imunes overshooting. Tregs suprimem a ativação de células T espectador. Por conseguinte, a ablação de Tregs conduz à autoimunidade fatal e auto-destruição dirigida por células T activadas 1. Tregs desenvolvem-se no timo durante a selecção negativa de células T CD4-positivos precursores única, mas também podem diferenciar na periferia das células T CD4 + naive com a estimulação de antigénio de baixa dose com 1,2 subóptima de co-estimulação. Tímico Tregs parecem suprimir a auto-imunidade de tecidos, contra auto-antigénios, enquanto periférica Tregs têm sido implicadas no fornecimento de tolerância no intestino ou do pulmão. Estes induzida Tregs potencialmente prevenir a ativação de células T após o reconhecimento de antígenos estranhos na mucosa, incluindo antígenos ambientais dos alimentos e do ar, bactérias comensais, e alérgenos 3,4. Além disso, as Tregs são cruciais para estabelecer a tolerância aos péptidos materna e fetal 5 préventilação doença do enxerto-versus-hospedeiro 6. Ao mesmo tempo, também Tregs mediar efeitos indesejados por meio da atenuação de vigilância imunitária de células tumorais 7,8. O recurso marca de Tregs é a expressão do subconjunto-especificar o fator de transcrição Foxp3, um fator de transcrição contendo domínio fork-cabeça que é necessário e suficiente para conferir função Treg 9,10. Algumas vias de sinalização que podem induzir a expressão de Foxp3 é conhecido. No entanto, os processos moleculares que controlam, regulam, modulam ou Treg diferenciação em resposta ao receptor de células T desencadeamento forem menos bem compreendidas. Tregs pode muito eficazmente ser induzida in vitro através da estimulação das células T CD4 + naive com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 na presença de TGF-p e IL-2 11. Como o Tregs emergentes são funcionais in vivo, a manipulação de moléculas que promovem a diferenciação de Treg tem um enorme potencial para futuro therapies, por exemplo, o tratamento de asma, doença de Crohn, e transplante de 11,12. Por outro lado, a modulação terapêutica de moléculas para bloquear a diferenciação Treg podem proporcionar benefícios em futuras abordagens de tratamento combinado dos pacientes com tumor. Em ensaios de diferenciação in vitro têm sido fundamentais para a descrição de alterações moleculares que estão associados com a diferenciação subconjunto de células T. No momento, as tentativas experimentais para pesquisa ou na tela para produtos de genes que controlam a diferenciação de células T são dificultados pelo facto de que os métodos mais comuns de expressão do gene ectópico falhar em células T naive. Por exemplo, a transdução retroviral, electroporação e só são eficazes em células T activadas. Em contraste com as expectativas iniciais, transdução lentiviral, que é tipicamente eficaz em células em repouso, requer pre-activação de células T naive por citocinas 13. Além disso, a transferência de cDNA ou mRNA durante electroporaçãoenvolve a despolarização da membrana plasmática, que se confere características de activação das células T e pode mesmo mobilização de Ca2 + sinalização e ativar proteínas NFAT (observação e ref inédito. 14). Da mesma forma, para a transdução retroviral, as células T virgens tem que ser ativado para 18 - 40 hr. Durante este tempo, a ruptura da membrana nuclear durante a divisão celular ocorrer e permite a subsequente integração do genoma do vector retroviral 15. Estes métodos não são, portanto, capazes de dirigir a regulação molecular inicial do encontro de células T inicial com o antigénio, que é a etapa determinante de diferenciação da célula T helper. Transdução adenoviral é conhecido para conferir a expressão do gene ectópico transitória em um número de tipos de células humanas que expressam o receptor para o adenovírus humano de Coxsackie (CAR). Procede sem necessidade de activação celular ou na progressão do ciclo celular. A expressão de superfície de CRA é essencial para a ligação e internalização do vírus eficiente, e a expressão transgénica da versão truncada CARΔ1 sob um promotor específico de células-T foi encontrada para processar timócitos de ratinho e as células T sensíveis a infecção adenoviral 16. Mais importante, o transgene não se alterar o desenvolvimento de timócitos ou a diferenciação in vitro de células T CD4 + naive em subconjuntos diferentes (dados não mostrados; Ref. 17.). Adenovírus mediada transdução de células T foi usado anteriormente para superexpressão 17,18 e knock-down abordagens 19,20. As células T transgénicas podem ser purificados a partir comercialmente disponível DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. e ref 17.). Importante, a transdução adenoviral permite uma elevada expressão de um gene de interesse em células T virgens sem induzir sinais óbvios de activação. As células T permanecer ingênuo (CD44 baixo, CD62L high) e de repouso (CD25 -, CD69 -) após infectiem e podem ser activadas e diferenciadas em Treg semelhante a células não infectadas. Produção de adenovírus recombinantes pode ser conseguida após a transfecção de células com plasmídeos HEK293A adenovirais (Figura 1). Estes plasmídeos contêm, tipicamente, o adenovírus tipo 5 do genoma humano com os genes E1 e E3 eliminados para processar os adenovírus recombinantes de replicação incompetente 21. Células HEK293A complementar a deficiência de replicação como eles foram imortalizados através da integração estável de adenovírus cortado 22. Como vectores adenovirais são grandes (~ 40 kb) e, consequentemente, não é adequado para a clonagem da enzima de restrição mediada tradicional, utilizou-se o sistema Gateway. O gene de interesse é, inicialmente, clonado num vector de entrada mais pequena, a partir da qual ele pode ser facilmente transferido para o vector adenoviral de destino por via da reacção de recombinação lambda (LR) 23. Construímos o pCAGAdDu vectorcombinando o promotor CAG (promotor de actina de galinha e intensificador de CMV), com uma cassete de expressão contendo LR locais flanqueando o marcador procariota selecção ccdB 24. Esta cassete de expressão está fundido com um local de entrada interno do ribossoma (IRES), elemento que permite a co-expressão do marcador de infecção melhorada proteína fluorescente verde eucariota (eGFP), que está fundido com uma sequência que contém a hormona de crescimento bovina poli (A) do sinal. Escolhemos as sequências de cis-reguladoras CAG, uma vez que o promotor de CMV prototípico foi encontrado para ser altamente dependente da activação e, portanto, desfavorável para a expressão de genes em células T naive. Aqui, nós fornecemos um protocolo eficiente para a diferenciação Treg vitro e um método para a transdução de células T CD4 naive sem activação (Figura 2). O método permite a expressão gênica ectópica ou derrubar CD4 anteriores diferenciação de células T no estado ingênuo. Ele permite testar o efeito de uma overexpressed gene de interesse durante os eventos de sinalização início após a estimulação inicial até TCR compromisso subconjunto de células T. Nossos experimentos de validação também fornecem a base para estabelecer a aplicação adenovírus semelhante na diferenciação de outros subgrupos de células T, como Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, ou células TFH.

<table><tbody><tr><td>Kit de clonagem pENTR/D-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Mistura enzimática</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R057S</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus-transfecção</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A Linha Celular</td><td>Invitrogen</td><td>R705-07</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 14 cm</td><td>Nunc</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta; 1) 1Jdgr</td><td>Taconic Farms</td><td>Modelo Nr. 4285</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4 + Kit de Isolamento de Células T II</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN Biotech</td><td>1502-P110704</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Lonza</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>NEAA 100x</td><td>Lonza</td><td>BE13-114E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão HEPES (1 M)</td> <td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>&beta; -Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>MEM Mistura vitamínica essencial (100x)</td> <td>Lonza</td><td>13-607C</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3 / CD28 para Expansão e Ativação Celular</td><td>Invitrogen</td><td>114-56D</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Humano TGF-beta 1</td><td>R & D Systems</td><td>240B</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin S (18 x 106IE)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de coloração de células mortas azuis fixável</td><td>Invitrogen</td><td>L-23105</td><td></td></tr><tr><td>Mouse BD Fc BlockT</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse/Rato Foxp3 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4427975</tr><tr><td>Sondas LightCycler 480 Master</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>04902343001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Transcrição Reversa de MicroRNA TaqMan</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr></tbody></table>

transdução de adenovírus naive cd4 células t para estudar a diferenciação treg

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

As células T reguladoras (Tregs) são essenciais para proporcionar a auto-tolerância imunológica, bem como para certos antigénios estranhos. Tregs podem ser gerados a partir de células T CD4 + naive in vitro com TCR-e co-estimulação na presença de TGF-p e IL-2. Isso tem um enorme potencial para futuras terapias, no entanto, as moléculas e vias de sinalização que a diferenciação de controle são em grande parte desconhecidos. As células T primárias podem ser manipulados através da expressão ectópica de genes, mas os métodos comuns não conseguem atingir a mais importante do estado ingénuo da célula T antes do reconhecimento do antigénio primário. Aqui, nós fornecemos um protocolo para expressar genes ectópicas nas células T CD4 ingênuas in vitro antes de induzir a diferenciação Treg. Aplica-se a transdução com o adenovírus deficiente em replicação e explica a sua geração e produção. O adenovirus pode demorar até inserções grandes (até 7 kb), e podem ser equipadas com os promotores para alcançar alta e transitória OVEREXPression nas células T. Ele efetivamente transduz células T rato ingênuos se expressar um receptor adenovírus Coxsackie transgênicos (CAR). Importante, após a infecção, as células T permanecem ingénuo (CD44 baixa, alta CD62L) e de repouso (CD25 -, CD69 -), e podem ser activadas e diferenciadas em Tregs semelhante a células não infectadas. Assim, este método permite a manipulação de diferenciação de células T CD4 desde o seu início. Ele garante que a expressão gênica ectópica já está em vigor quando os eventos de sinalização início da estimulação inicial TCR induz alterações celulares que, eventualmente, levar em Treg diferenciação.

A produção de vírus Para a geração de títulos elevados de vírus, o período de colheita de células HEK293A na produção de vírus ou de amplificação de primário de vírus é crucial. Representativos fluorescentes e as imagens de contraste de fase com os sinais visuais de produção de vírus estão apresentados na Figura 3. O CPE, foram observadas 10 dias após a transfecção de células com um HEK293A pCAGAdDu vector de controlo sem inserção. CPE são caracterizadas pelo aparecimento de zo...

Adenoviral de transferência do gene em células T CD4 naive com a expressão transgénica do receptor de adenovirus Coxsackie possibilita a análise molecular da diferenciação de células T reguladoras<em&gt; In vitro</em&gt;.

Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho para a produção de partículas adenovirais infecciosas que são utilizadas para transduzir um gene de interesse em células T ingênuas, as quais, após a expressão atópica do transgene, se diferenciam em células T reguladoras ou tregs. Primeiro, o gene de interesse é clonado no vetor adenoviral de destino. O vetor é então transferido para a linhagem celular produtora de adenovírus, HC 2 93 A, e partículas adenovirais infecciosas são geradas.Os vírus resultantes são usados para infectar linfócitos T ingênuos de camundongos que possuem um transgene do receptor de adenovírus após a infecção. As células são então mantidas em repouso para garantir a expressão do gene de interesse. Em linfócitos T ingênuos, as células são ativadas em condições polarizantes para induzir a diferenciação em linfócitos T reguladores.Em seguida, as células são fixadas e coradas para análise por citometria de fluxo. Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram a expressão do marcador de diferenciação de Treg, Fox P três, e do marcador de infecção GFP, os quais podem ser influenciados pelo gene de interesse superexpresso. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a transdução gênica por retrovírus, é que ela permite a superexpressão de um gene de interesse em linfócitos T naïve.Isso resulta em um alto nível de superexpressão presente no momento da ativação de linfócitos T. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de linfócitos T reguladores. Por exemplo, sobre a regulação pós-transcricional de genes que subjaz ao estabelecimento da identidade das células T-Rex.Inicie este protocolo clonando o gene de interesse em um vetor de entrada. O gene de interesse amplificado por PCR é liso e ligado ao vetor acoplado à topoisomerase P enter D topo. O gene de interesse é então transferido por recombinação LR para o vetor destino P kakadu.Ele contém os genes adenovirais e um sítio interno de entrada ribossômica ou iris, seguido pelo quadro de leitura aberto da GFP, para criar um vetor de expressão adenoviral com um marcador de infecção. Em seguida, 10 microgramas do vetor de expressão adenoviral são linearizados. Em um digestão com restrição PAC I, o DNA é então precipitado e ressuspenso em água numa concentração de três microgramas por 100 microlitros.A linearização libera os terminais repetidos invertidos virais ou ITR, que são necessários para a replicação e encapsidamento do DNA viral em partículas virais. Todos os passos a seguir devem ser realizados sob as condições apropriadas de biossegurança para infecção por adenovírus. Para preparar o vetor linearizado para a cotransfecção, transfira seis microlitros do reagente jet PEI para 94 microlitros de cloreto de sódio 50 micromolar e vortex. Resumidamente, enquanto realiza v&oacute;rtex, adicione a solu&ccedil;&atilde;o mista a 100 microlitros de vetor de adenov&iacute;rus linearizado. Incube essa mistura de transfe&ccedil;&atilde;o por 15 a 30 minutos &agrave; temperatura ambiente. Em seguida, remova as c&eacute;lulas HEC 2 9 3 A cultivadas at&eacute; 50% de conflu&ecirc;ncia em placas de seis po&ccedil;os do incubador.Adicione a solução gota a gota nos poços contendo células HEC 2 9 3 A e incube-as a 37 graus Celsius e 10% de dióxido de carbono. Adicione 0,5 mililitros de meio fresco a cada três dias, utilizando a expressão de GFP como marcador de infecção. Avalie a eficiência de transfeção visualmente com um microscópio de fluorescência invertido a cada dois ou três dias, verificando efeitos citopáticos evidenciados por áreas com células aumentadas e arredondadas que começam a se destacar.Isso indica uma geração eficiente de vírus. Uma vez que apareçam zonas mais amplas de efeitos citopáticos, todas as células estarão infectadas em 24 a 72 horas. Quando todas as células apresentarem sinais de efeitos citopáticos, mas antes que ocorra uma dessacoplamento geral das células, colete as células por pipetagem suave e transfira-as, juntamente com o sobrenadante, para um tubo de poliestireno de 15 mililitros.Em seguida, para romper as células, congele as suspensões em gelo seco por 15 a 20 minutos e, depois, descongele rapidamente a 37 graus Celsius. Repita esse ciclo de congelamento e descongelamento mais duas vezes. A suspensão de células rompidas é agora denominada lisado viral primário.Mantenha todos os lisados virais em gelo. Se forem utilizados dentro de um dia para armazenamento de longo prazo, congele-os a menos 80 graus Celsius. Tenha em mente que ciclos adicionais de congelamento e descongelamento reduzirão o título viral em 30 a 50%. Para amplificar o lisado viral primário, infecte células HC 2 93 A cultivadas até 90% de confluência em 15 placas de cultura tecidual com metade do lisado viral primário e incube por pelo menos 36 horas.Após 36 horas, verifique a infecção por microscopia de fluorescência; quase todas as células devem estar infectadas. Quando todas as células apresentarem efeitos citopáticos, mas ainda não tiverem se destacado, colete as células por pipetagem suave com produção eficiente de vírus. Esse estágio é alcançado dentro de 48 horas após a infecção; transfira as células e o sobrenadante para um tubo de poliestireno de 50 mililitros.Centrifugar as células a 300 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em um volume adequado de meio. Um mililitro deve resultar em uma titulação na faixa de 10 elevado à 10ª potência por mililitro.Realize três ciclos de congelamento e descongelamento como antes para romper as células. Em seguida, centrifugue a 900 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, transfira cuidadosamente o sobrenadante, agora denominado vírus concentrado, lisado, para um tubo criogênico.Prepare alíquotas para múltiplas infecções e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Por fim, determine o título viral por meio de análise de fax da expressão do marcador de infecção em células 5 4 9. De acordo com as instruções no documento anexo, esta parte do protocolo é realizada utilizando células T CD4 naïve isoladas de camundongos transgênicos D 1110 car delta 1 transgênicos para experimentos em pequena escala.Adicione um volume apropriado de lisado viral para atingir uma MOI de 50 em um poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços. Adicione até quatro vezes 10 à quinta células T em um volume final de infecção de 50 microlitros em células T.Meio médio. Esta configuração permite abordagens experimentais paralelas. Incube as células por 90 minutos a 37 graus Celsius em uma estufa com 5% de dióxido de carbono.Após a incubação, centrifugue as células a 300 G durante cinco minutos à temperatura ambiente; após a centrifugação, ressuspenda-as em 200 microlitros de PBS, centrifugue novamente e remova o sobrenadante. Ressuspenda as células em 200 microlitros de meio para linfócitos T sem anticorpos estimulantes e sem IL-2 ou outras citocinas. Em seguida, mantenha as células em repouso por 40 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono para permitir a expressão do gene de interesse antes da ativação. Para ativar e polarizar os linfócitos T, pipete esferas conjugadas com anti-CD3 e anti-CD28 em um copo reagente pequeno. O número de esferas deve ser igual ao número de células, acrescido de dez vezes o volume de PBS, e coloque-as em um ímã por dois minutos.Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda. Suspenda as microesferas em 200 microlitros de meio polarizante, centrifugue as células repousadas a 300 ×g durante cinco minutos à temperatura ambiente; após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 200 microlitros de meio polarizante contendo microesferas conjugadas com anticorpo. Incube por 72 horas a 37 °C em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono, sem trocar o meio. O protocolo para coloração e fixação é descrito brevemente aqui.Primeiro, as células são lavadas em PBS e incubadas com solução corante fixável para células mortas. Após outra etapa de lavagem, as células são fixadas em paraformaldeído, após o que podem ser manipuladas sem precauções de biossegurança para adenovírus; as células são então lavadas novamente e permeabilizadas com metanol. Após mais uma etapa de lavagem, as células são incubadas com anti-FCR três para bloquear a ligação inespecífica.Por fim, as células são incubadas com os anticorpos anti-FCR três e anti-fox P três conjugado com PE. Existe o risco de perder grande quantidade de células durante o procedimento de fixação e coloração devido às múltiplas etapas de lavagem; para evitar perdas, certifique-se de remover o sobrenadante imediatamente após a centrifugação, sem perturbar o pellet com a ponteira de uma pipeta. Após as células terem sido coradas, lave-as duas vezes em PBS e analise-as em um citômetro de fluxo.Um leitor de 96 poços no citômetro de fluxo permite realizar infecção de linfócitos T, diferenciação, fixação e coloração no mesmo placa de 96 poços, proporcionando um fluxo de trabalho eficiente para análises paralelas de múltiplas condições, mas a análise também pode ser realizada em tubos padrão para avaliar o efeito da infecção por adenovírus na viabilidade dos linfócitos T e na diferenciação de linfócitos T reguladores. Linfócitos T naïve purificados de camundongos transgênicos DO11.10 e car delta um transgênicos foram infectados com adenovírus controle em diferentes MOIs e ativados em condições polarizadoras para treg. Células fixadas e coradas foram analisadas por citometria de fluxo quanto à expressão do marcador de infecção.A incorporação de GFP de células mortas e do marcador de diferenciação. FOX P três, conforme mostrado aqui. O aumento da MOI de um para 50 resulta em uma porcentagem maior de células infectadas.Embora nem a viabilidade nem a diferenciação em Treg sejam afetadas, determinou-se se a infecção por adenovírus influencia o estado de ativação dos linfócitos T. Células infectadas e não infectadas foram analisadas quanto à expressão de marcadores de ativação e repouso por citometria de fluxo, conforme mostrado aqui. A expressão desses marcadores foi indistinguível entre células infectadas e não infectadas quando as células foram posteriormente ativadas em condições polarizadoras para Treg.A superexpressão de marcadores de ativação e a subexpressão de marcadores de linfócitos T ingênuos foram muito semelhantes em células infectadas e não infectadas consideradas em conjunto. Esses dados indicam que uma infecção de linfócitos T em estado ingênuo não interfere com a ativação subsequente das células T. Para testar o nível de superexpressão alcançado com o protocolo descrito de transdução adenoviral, linfócitos T ingênuos foram infectados com adenovírus codificando microRNA 155 ou adenovírus controle em uma MOI de 50. As células foram mantidas em repouso por 40 horas, ativadas por 40 horas, ou mantidas em repouso por 40 horas, seguidas por uma ativação de 40 horas. O cDNA foi gerado e a expressão do microRNA 155 foi determinada em relação ao snoRNA 202.Por PCR quantitativa, os níveis de superexpressão do microRNA 155 em células T ingênuas mantidas em repouso por 40 horas correspondem aos níveis endógenos de expressão do microRNA 155. Após 40 horas de ativação das células T, a ativação dessas células ainda induz a upregulação dependente de ativação do microRNA 155.Isso demonstra o alto nível de superexpressão em células T ingênuas por meio do adenovírus, além da expressão de microRNA induzida pela ativação endógena. Uma vez dominado, o procedimento de clonagem, geração do vírus e infecção de células T pode ser concluído em quatro semanas. O vírus, após gerado, pode ser armazenado por longo prazo ou reamplificado em três dias.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de controlar cuidadosamente todos os experimentos com um vetor vazio e, primeiramente, estabelecer o efeito da infecção adenoviral em si sobre o processo estudado. Tenha em mente que a infecção adenoviral e a superexpressão são transitórias e duram apenas cerca de cinco a sete dias.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós apresentamos um protocolo para a produção de antígenos específicos do mouse células T usando transdução...

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

Nós descrevemos um método para a geração de células T de memória, regulamentar e ingénuos a partir de um único dador de sangue humano. Tregs polarizada pode ser então comparada com outros subconjuntos de uma variedade de aplicações genéticas e funcionais com homogeneidade genética, incluindo um ensaio de supressão também detalhados aqui.

Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

Com funções efectoras distintas das outras subpopulações de células T, células Th17 foram centralmente implicada na autoimunidade inflamatória. Este protocolo in vitro de diferenciação Th17 proporciona um meio para determinar se os linfócitos T CD4 + naive podem diferenciar-se em células Th17, e para examinar ainda mais o seu papel no auto-imunidade e resposta do hospedeiro.

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

As células T CD4+ virgens polarizam para vários subconjuntos, dependendo do ambiente no momento da ativação.  A diferenciação de células T CD4+ virgens em vários subconjuntos efetores pode ser alcançada in vitro através da adição de estímulos de receptores de células T e sinais específicos de citocinas.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Aqui, descrevemos um protocolo para analisar o fenótipo de células T reguladoras (Treg) isoladas de camundongos infectados pelo vírus da coriomeningite linfocítica ingênua e crônica. Além disso, fornecemos um processo para avaliar a atividade supressora das células Treg.

Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

Muitos sistemas experimentais foram utilizados para compreender os mecanismos de regulação do desenvolvimento e função de células T numa resposta imunitária. Aqui uma abordagem genética utilizando transdução retroviral é descrito, que é económico, eficiente tempo, e, o mais importante, altamente informativos na identificação de vias reguladoras.

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

Este protocolo descreve a geração reprodutível e fenotipagem de células T reguladoras humanas induzida (iTregs) a partir de células naive T CD4 + in vitro. Diferentes protocolos de indução de FOXP3 permitem o estudo de fenótipos específicos iTreg obtidos com os respectivos protocolos.

Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo

Este protocolo descreve a diferenciação de células T CD4+ virgens em células Th17 patogênicas in vitro. Especificamente, quando combinado com uma abordagem baseada em citometria de fluxo multiparâmetro, 90% de pureza de células Th17 patogênicas podem ser obtidas de células T CD4 + virgens usando este método de diferenciação.

Diferenciação in vitro de células T CD4+ virgens em células Th17 patogênicas em camundongos

O presente estudo apresenta protocolos para avaliar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus e manipular a expressão gênica nessas células.

Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Apresentamos um protocolo para transdução retroviral de RNA guia em células T primárias de camundongos transgênicos Cas9, fornecendo uma alternativa eficiente para edição gênica no estudo da diferenciação Th17.

Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro

Aprenda a transduzir células T CD4 naive com adenovírus para estudar diferenciação Treg. Este método permite expressão transiente de genes sem afetar viabilidade celular ou potencial de diferenciação.

Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

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