Name: Titulação Bioquímica de glicogênio In vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-24T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprenda a titulação bioquímica de glicogênio in vitro usando hidrólise enzimática e medição de fluorescência. Este método reprodutível permite quantificar níveis de glicogênio em amostras celulares para estudos de metabolismo energético.

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Somos gratos ao Dr. Thierry Pourcher por nos permitir usar o espectrômetro de fluorescência e por sua ajuda. O laboratório é financiado pelo Ligue Nationale Contre le Câncer (équipe labellisée), a Associação pour la Recherche contre le Câncer, o Instituto Nacional do Câncer du (INCA), a Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (programa da UE FP7), o Centro A. Lacassagne, o Centre National de la Recherche Scientifique, o Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale e da Universidade de Nice ( <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">http://www.unice.fr/isdbc/</a> ). Agradecemos ao Dr. M Christiane Brahimi-Horn para a leitura crítica e correção editorial.

Titulação Bioquímica de glicogênio 1. A lise celular <ol><li> Células de sementes a uma concentração de 0,5-2 x 10 6 por 100 prato mm de diâmetro. </li><li> Tratamento: incubar células 24, 48, ou 72 horas em baixa concentração de oxigênio (hipóxia), em uma estação de trabalho anaeróbio Bug-Box (Ruskinn Tecnologia Biotrace International Plc, Bridgend, Reino Unido), fixado em 1% ou 0,1% O 2, 94% ou 94,9% de N 2, e 5% de CO 2. Em paralelo, as células incubar em normoxia (21% de O2, 5% de CO 2). Mudança de meio (meio contendo glicose 25 mM) a cada 24 horas para minimizar as variações na concentração de glicose durante o tempo da experiência. </li><li> Após o tratamento, as células de lavagem 2x com PBS para remover vestígios de glicose a partir de meio de cultura. Raspe as células em PBS frio. </li><li> Centrifugar a solução a 1.000 rpm durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante e lava-se o sedimento uma vez com PBS. O sedimento pode ser congelada a -20 ° C, antes de prosseguir.</li><li> Ressuspender o sedimento em 100 ul de água destilada. Adicione 100 ml de glicogênio Hidrólise buffer fornecido com o glicogênio Assay Kit (Abcam). Ferver o lisado a 95 ° C durante 5 minutos para inactivar as enzimas. </li><li> Vortex e centrifuga-se o ligado a 13.000 rpm durante 10 min para remover os produtos insolúveis. Manter o sobrenadante. </li><li> Para normalizar os níveis de glicogénio para o teor de proteína entre as amostras, a quantificação de proteínas pode ser feito com 25-35 ul do sobrenadante utilizando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA-Interchim). </li></ol> Algum do lisado pode ser utilizado para medir a concentração de glicose livre no interior das células. 2. A hidrólise de glicogênio <ol><li> Misturar 50 ul de sobrenadante (passo 1) com 1 ml da mistura de hidrólise enzimática. Esta mistura contém glucoamilase. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> A curva de calibração através da diluição do padrão de glicogénio (2 mg / ml) supplied com o kit, a uma solução de 10 ug / ml no tampão de hidrólise. Em seguida, preparar seis tubos separados, com 0, 4, 8, 12, 16, e 20 l de 10 ng / ml de padrão e ajustar cada tubo para um volume final de 50 ul com tampão de hidrólise para se obter uma concentração de glicogénio de 0, 0,04 , 0,08, 0,12, 0,16, e 0,2 ug / ml. Adicionar 1 ml de mistura de hidrólise de enzima nas normas e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. </li></ol> A concentração de glucose no fundo da linha de células, dada em termos de valor para a concentração de glicose livre, deve ser subtraído do valor para a concentração total de glicose (glicose a partir da hidrólise de glicogénio + livre de glucose) para determinar o nível de glicogénio na célula. 3. Desenvolvimento e leitura de fluorescência <ol><li> Para cada condição, preparar um tubo (tubo 1) para medir a concentração de glicose livre e dois tubos (tubos 2 e 3) para medir a concentração total de glicose (cada sagacidade tuboha volume diferente de glicogênio hidrolisada). </li><li> Adicionar 15 ul de sobrenadante extraído no final do passo 1 no tubo 1. Adicionar 35 ul de tampão de hidrólise para completar a um volume final de 50 ul. Fluorescência obtida dará a concentração de glicose livre. </li><li> Adicionar X ul de glicogénio hidrolisada (obtido no passo 2) no tubo 2. Ajustar para um volume final de 50 ul. Volume da amostra (X ul) tem de ser ajustada de acordo com a densidade celular e / ou tipo de célula, a fim de obter valores de fluorescência que não estão além concentrações da curva de calibração. </li><li> Adicionar 2 X ul de glicogénio hidrolisado no tubo 3. Ajustar para um volume final de 50 ul. </li><li> Prepare uma solução de desenvolvimento de amostras e padrões através da mistura para cada tubo de 48,7 l de Desenvolvimento do Buffer, 1 ml de Desenvolvimento mistura de enzimas e 0,3 l de OxiRed Probe (fornecido no glicogênio Assay Kit). Por exemplo, para duas condições, para preparar uma mistura de 12 tubos (6 para os padrões, 2 para a glicose livre e 4 de fluorescência total de glicose). </li><li> Adicionar 50 ul desta mistura a cada tubo e incubar durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Medir a fluorescência num comprimento de onda de excitação de 535 nm, um comprimento de onda de emissão de 587 nm, tal como recomendado, e uma fenda de 3 nm para a excitação e de emissão. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não há conflito de interesses.

Titulação Bioquímica de glicogênio in vitro permite uma quantificação precisa das células conteúdo de glicogênio. Comparando com outras técnicas (PAS, de imunofluorescência com um anticorpo de glicogénio, etc.), Esta titulação é muito específica, sensível e reprodutível. Além disso, o método é conveniente, uma vez que não necessita de radioactividade mas um espectrómetro de fluorescência. No entanto, esta técnica é puramente quantitativa e não fornece informações sobre a distribuição de glicogênio na c...

Glicogénio é um polímero de múltiplas ramificações de resíduos de glicose, que está presente no citoplasma de muitos tipos de células. É uma das principais formas de armazenamento de energia nas células e desempenha um papel importante no metabolismo da glicose. A maioria das células de mamíferos são capazes de produzir e armazenar glicogênio, que pode ser rapidamente degradado em glicose para promover a glicólise e ATP produção durante o estresse metabólico. Hepatócitos produzir grandes quantidades de glicogénio para regular o nível de açúcar no sangue, proporcionando assim um fornecimento contínuo de glicose no corpo. Em contraste, a concentração de glicogénio nos músculos (outras células, as células vermelhas do sangue, etc) é relativamente baixa. No entanto, a nível local, estas quantidades são suficientes para fornecer energia a curto prazo quando as células são repentinamente expostos a um ambiente privado de nutrientes. A síntese de glicogénio e a quebra de glicogênio segue os mesmos passos em todos os tecidos (Figura 1). Em primeiro lugar, a glucoseentra nas células por transportadores de glicose (GLUTs), e é rapidamente convertido a partir de glicose-6-fosfato (G6P) em glicose-1-fosfato (G1P) por fosfoglucomutase. G1P é então modificada em UDP-glucose, e o carbono C1 da UDP-glucose é ligado a um resíduo de tirosina de glicogenina, a proteína de ancoragem de glicogénio. Esta molécula, considerada um iniciador de glicogénio, é alargada por fixação da UDP-glucose para o terminal de glicose por uma α (1 → 4) ligação através da sintase do glicogénio. Finalmente, quando uma cadeia linear de mais de 11 resíduos de glicose é formada, a enzima de ramificação transfere um oligossacárido de terminal constituída por um mínimo de 6 resíduos de glicose para outro glicose de cadeia vizinha através de uma α (1 → 6) de ligação. A repetição desse processo dá uma enorme estrutura fractal contendo ramos que formam uma hélice com 6,5 glicose por turno. O glicogênio pode ser inversamente hidrolisada em glicose pela ação concertadadesramificadora de enzimas que hidrolisam o α (1 → 6) amarrado e glicogênio fosforilase que hidrolisa o α (1 → 4) glicosídica limite entre o último resíduo de glicose de um ramo ea molécula de glicogênio. Esta reação chamado glicogenólise é ativado, aumentando os níveis de AMP (refletindo o consumo de ATP) e inibida por glicose e ATP 2,3. Por microscopia electrónica, as moléculas de glicogénio tem sido descrito em muitos tipos de células como as partículas β livres (ou monoparticles glicogênio) de 15-30 nm de diâmetro. Em tipos de células específicas, tais como os hepatócitos, partículas β pode ser montado em um complexo para formar rosetas, também conhecidas como partículas α que variam em diâmetro de 80 nm, com um máximo de 200 nm, 4 </sup&gt;. A forma como estas partículas β estão ligados para formar grandes aglomerados de partículas α ainda não está completamente elucidado. Algumas evidências tende a demonstrar que as partículas β podem ser ligados por uma ligação covalente 5, ligações de hidrogénio, ou até mesmo através de interacções proteína-proteína 6. A quantidade de glicogénio armazenado nas células depende de vários parâmetros: (i) a quantidade de glicogenina na célula que inicia a síntese de glicogénio, (II), a actividade de sintase do glicogénio fosforilase e regulada por fosforilação da proteína / desfosforilação, (III) a concentração de glicose nas células, o que é dependente de vários parâmetros, tais como o fornecimento de glucose a partir do sistema vascular e a absorção de glicose pelas células. Os estoques de glicogênio estão fortemente regulada por regulação alostérica de hormônios biossintéticas através metabólitos intermediários, por hormônios que regulam o metabolismo energético e de nutrientes por sensoriamento vias de sinalização 7. É importante estarcapazes de quantificar de glicogénio em amostras biológicas para compreender melhor a importância do metabolismo do glicogénio em todo o corpo e nível celular. Descrevemos aqui um bioquímico preciso, reprodutível e conveniente ensaio in vitro para glicogênio. Esta técnica baseia-se na quantificação de fluorescência de glicose antes e depois da hidrólise específica de glicogénio. Existem outros métodos para a estimativa do nível de glicogénio nas células, mas a maioria deles não são quantitativas. Uma das primeiras técnicas descritas para a quantificação de glicogénio nas células foi baseada na medição da incorporação de [14 C]-glucose em glicogénio 8,9. O uso de radioactividade torna este processo mais difícil de manusear, mas tem a vantagem de fornecer a taxa de incorporação de glucose em glicogénio e para distinguir entre a distribuição dos resíduos de glicose nos ramos exteriores e no núcleo da molécula (isto também requer um β-amyloly adicionalsis e uma etapa de cromatografia). Outra técnica foi desenvolvido mais recentemente e baseia-se na incorporação de 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-il] amino}-2-desoxiglucose), um 2-desoxiglucose derivado fluorescente, em glicogênio 10. A intensidade de fluorescência medida reflecte a quantidade de glicogénio produzido e pode ser medida com um leitor de fluorescência. Distribuição de fluorescência na célula também pode ser avaliada por microscopia confocal. Entre as outras técnicas não quantitativa, ácido periódico de Schiff (PAS) é talvez a mais comum. Ele pode ser usado para a detecção de glicogénio em células fixadas, as secções de tecido em parafina ou congelado. Estas cores técnica histológica não especificamente polissacarídeos, glicolipídeos, glicoproteínas, celulose e mucinas neutras em roxo. A especificidade deste ensaio pode ser aumentada por tratamento de células ou secções de tecido fixadas com diastase, que digere especificamente glicogénio. Posteriormente,o nível de glicogênio pode ser qualitativamente estimada comparando amostras não hidrolisados ​​(todas as macromoléculas de carboidratos modificados) para amostras hidrolisadas (carboidrato macromoléculas modificado, exceto glicogênio). Coloração com PAS e análise microscópica, ao contrário de ensaios bioquímicos de glicogénio, fornece informação sobre a distribuição de glicogénio na célula, o qual pode ser difuso ou concentrado numa determinada parte da célula. No entanto, embora as diferenças das estimativas de coloração PAS em acúmulo de glicogênio entre diferentes condições, não é quantitativa 11. Um anticorpo monoclonal de rato originalmente feitas usando cartilagem condilar da mandíbula, o antigénio tem sido demonstrado que reagem com glicogénio em células e com glicogénio purificada in vitro, 12. Como este anticorpo reconhece especificamente cadeias de açúcar relacionados com o glicogénio, que é um instrumento útil para a detecção de glicogénio por imuno-histoquímica de uma forma mais específica do que a coloração PAS. </p&gt; A microscopia eletrônica é outra técnica que permite a visualização de grãos de glicogênio em células e avaliação do grau de armazenamento de glicogênio. Na verdade, o glicogênio partículas β são facilmente reconhecíveis com um microscópio eletrônico de elétrons como grânulos densos 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31966.047</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Glicogênio</td><td>Abcam ab65620</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Espectrômetro de Fluorescência</td><td>PerkinElmer</td><td>LS 50B</td><td></td></tr></tbody></table>

titulação bioquímica de glicogênio<em&gt; in vitro</em

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glicogénio é o principal polímero energético de glicose em animais vertebrados e desempenha um papel fundamental no metabolismo de todo o corpo bem como no metabolismo celular. Já existem muitos métodos para detectar o glicogênio, mas apenas alguns são quantitativos. Descrevemos aqui um método que utiliza o kit de ensaio Abcam do glicogénio, que é baseada na degradação específica de glicogênio a glicose por glucoamilase. A glicose é oxidada então especificamente a um produto que reage com a sonda OxiRed para produzir fluorescência. Titulação é preciso, sensível e pode ser alcançado em extratos de células ou secções de tecidos. No entanto, em contraste com outras técnicas, que não dá informação sobre a distribuição de glicogénio na célula. Como um exemplo desta técnica, descrevemos aqui a titulação de glicogénio em duas linhas celulares de fibroblastos, chinês CCL39 de pulmão de hamster e humanas LS174 carcinoma do cólon, incubadas em normoxia (21% de O 2) contra a hipoxia (1% de O2). Nossa hipótese é que a hipóxia é um signal que prepara as células para sintetizar e armazenamento de glicogénio, a fim de sobreviver 1.

Um baixo nível de oxigénio (hipoxia), em sinais de tumores para células de tumor da necessidade de armazenar a energia para lidar com o esgotamento de nutrientes subsequente, a fim de sobreviver. Como o glicogênio é o principal polímero energético da glicose em células de mamíferos, estudamos a regulação do armazenamento de glicogênio em hipóxia. O cálculo e a normalização da concentração de glicogénio nos lisados ​​celulares devem ser realizadas sobre os dados brutos de fluorescência, como mostrado nas Tabelas ...

Descrevemos aqui um método bioquímico exato, reprodutível e conveniente para a titulação de glicogênio in vitro. Esta técnica utiliza o kit de ensaio Abcam do glicogénio e é baseado na hidrólise sucessiva de glicogênio a glicose e glicose titulação por fluorescência.

Titulação Bioquímica de glicogênio<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

O objetivo geral deste procedimento é titular o glicogênio in vitro em amostras de células. Isso é feito primeiro lisando as células por interrupção mecânica. O segundo passo é hidrolisar o glicogênio com alfa-amilase para obter a glicose.Em seguida, a glicose é oxidada produzindo uma espécie fluorescente. A etapa final é medir a fluorescência. Em última análise, a titulação bioquímica do glicogênio é usada para mostrar mudanças no conteúdo de glicogênio nas células.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que ela é competitiva, sensível, precisa e muito específica. Para iniciar este procedimento, semeie células em uma concentração de 0,5 a 2 milhões por prato de 100 milímetros de diâmetro. Incube as células por 24, 48 ou 72 horas em hipóxia em uma estação de trabalho anaeróbica ajustada para 1% de oxigênio, 94% de nitrogênio e 5% de dióxido de carbono.Paralelamente, incubar outro conjunto de células em normóxia para cada condição de oxigênio. Trocar o meio contendo glicose 25 milimolares a cada 24 horas para minimizar as variações na concentração de glicose durante o experimento após o tratamento. Lave as células duas vezes com PBS para remover vestígios de

biochemical-titration-of-glycogen-in-vitro

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Biologia

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Neste vídeo, descrevemos um ensaio espectrofotométrico qualitativo para determinar a extensão da ramificação em uma amostra de glicogênio com uma estrutura não caracterizada. A comparação dos máximos de absorbância da amostra não caracterizada com os de polissacarídeos com estruturas ramificadas conhecidas indica a presença de ramificação na amostra não caracterizada.

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A coloração com ácido periódico de Schiff é uma técnica que visualiza o conteúdo de polissacarídeos dos tecidos. Este artigo demonstra o protocolo de coloração de Schiff com ácido periódico adaptado para uso em células mononucleares do sangue periférico purificadas de sangue venoso humano. Essas amostras são enriquecidas para linfócitos e outros glóbulos brancos do sistema imunológico.

Detecção de glicogênio no sangue periférico células mononucleares com Periodic Acid Schiff Coloração

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