Name: Um modelo de transplante heterotópico Modificado Swine Hind Limb para Translational vascularizado Composite Alotransplante (VCA) Pesquisa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo translacional de transplante heterotópico de membro posterior em suínos com medula óssea vascularizada intacta para pesquisa em VCA. Este método permite testar protocolos imunomoduladores clinicamente relevantes.

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Gostaríamos de agradecer as seguintes pessoas por sua contribuição para este projecto: Kakali Sarkar, PhD, Joani Christensen, BS, Kate Buretta, BS, Nance Yuan, BS, William Lehao, MD, Johanna GRAHAMMER, Georg Furtmüller, MD, Erin Rada MD, Mohammed Al-Rakan MD, Karim Sarhane MD, Sami Khalifian, BS, Mao Qi, MD, e Angelo Barone Leto MD, VCA Laboratório do Departamento de Cirurgia Plástica e Reconstrutiva, Faculdade de Medicina, Janis Taube, MD da Universidade Johns Hopkins, Mark Fischer, MD, Departamento de Dermatologia e Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Johns Hopkins, Sue Eller, Cirurgia Minimamente Invasiva Centro de Treinamento da Faculdade de Medicina da Universidade Johns Hopkins e Cheng-Hung Lin, MD Chang Gung Memorial Hospital, Linkou, Taiwan. Fonte de financiamento: Forças Armadas Instituto de Medicina Regenerativa (DoD W81XWH-08-2-0032)

Nesta publicação de vídeo, todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com um protocolo de animais aprovado pelo Animal Care and Use Committee da Universidade Johns Hopkins Institucional (IACUC). 1. Planejamento pré-operatório <ol><li> Nós utilizamos MHC-definido MGH puras suína miniatura (15-20 kg) em nossos estudos translacionais para allotransplantation membro em que um doador do sexo masculino fornece membros para dois destinatários femininos (Figura 1). Antes da cirurgia, doador e receptor animais passam por avaliação clínica minuciosa por um médico veterinário. </li><li> A fim de minimizar o tempo de isquemia e anestesia, processos de dador e do receptor são realizados simultaneamente em três mesas de operação em uma sala dedicada operacional animal. Trabalho em equipe e coordenação entre as equipes cirúrgicas, bem como o pessoal veterinário são fundamentais para o sucesso global do presente procedimento. O plano cirúrgico é discutido com a equipe veterinária em uma reunião formal 1-2 Semanas antes do dia da cirurgia. </li><li> Um cateter venoso central em túnel (7 Fr duplo lúmen Hickman cateter) é colocado em uma veia jugular externa ou interna de cada animal receptor antes do transplante para imunossupressora monitoramento do nível de droga e administração intravenosa de imunossupressor e / ou imunomoduladores. Estes cateteres são colocados sob visão direta através de uma técnica de corte-down venosa e posterior túnel para sair alto no pescoço dorsal e protegido usando monofilamento suturas não absorvíveis e cola envoltório atadura em torno do pescoço. </li><li> Manter os animais NPO (nenhum alimento sólido, mas são permitidos água ad lib), pelo menos 12 horas antes da cirurgia. </li><li> No dia da cirurgia, os animais sedar com cetamina 20 mg / kg e xilazina a 2 mg / kg, IM. </li><li> Coloque um tubo endotraqueal de tamanho adequado e conectá-lo ao aparelho de anestesia e ventilação mecânica (manutenção em isoflurano 0,5-3%) </li><li> Inserir um cateter intravenosa em uma veia marginal da orelha e administrarpeso base de 0,9% de solução salina ao longo do procedimento. </li><li> Administrar analgesia preventiva (buprenorfina 0,02 mg / kg IV). </li><li> Administrar antibiótico profilático (cefazolina 20-25 mg / kg IV) antes da incisão inicial para dador e animais receptores. </li><li> Use uma técnica asséptica em todos os procedimentos para ambos os receptores e doadores. Isso inclui o uso de instrumentos autoclavados ou esterilizados, máscaras de gás, tampas de cabeça, aventais cirúrgicos estéreis e luvas estéreis. Raspar a área da incisão com um cortador e desinfectar com a alternância de solução Betadine e álcool. </li></ol> Monitorização intra-operatória: <ol><li> Após a indução e intubação, manter a anestesia com uma mistura de inalação 0,5-3% de isoflurano em oxigênio. </li><li> Monitor de freqüência cardíaca, oximetria de pulso, ECG, ao final da expiração de CO 2 e temperatura retal de forma contínua e gravar cada 15 min. </li><li> Prevenir hipotermia com um Bair Hugger quente cobertor de ar forçado. </li></ol><ol><li> Colocar o animal doador em decúbito dorsal na mesa de operação e armar de forma estéril. </li><li> Use quase infravermelho angiografia laser para identificar vasos perfurantes para a pele ântero-medial. Injetar indocianina verde em cerca de 0,06 mg / kg diluída em 2-5 ml de soro fisiológico por meio do acesso vascular periférico. Aproximadamente 10 segundos depois, realizar 30 seg-2 min de perto as gravações de infravermelho. Use o vídeo a partir dessas gravações para identificar perfuradores. Baseado em perfuradores, marcar uma área de pele (aproximadamente 100 cm 2) para a monitorização. </li><li> Use um bisturi para fazer uma incisão na pele da virilha em continuidade com marcações para o remo pele (Figura 2). </li><li> Identificar vasos femorais e isolá-los distalmente ao nível dos ramos suprageniculado e proximal ao nível do ligamento inguinal. </li><li> Dissecar da pele e tecido subcutâneo, enquanto preservandog a área da pá da pele. Suturar as extremidades da pele para os músculos subjacentes, para evitar a contracção durante a aba de colheita. </li><li> Realizar uma osteotomia um pouco acima do tarso usando uma serra de vaivém (Electric Pen Drive, Synthes, West Chester PA). </li><li> Divida os músculos da coxa proximal utilizando o eletrocautério. </li><li> Divida o fêmur ao meio-eixo deixando uma aba osteomyocutaneous em um pedículo vascular. A aba contém o remo pele, músculos da coxa subjacentes, articulação do joelho, fêmur distal e tíbia proximal que inclui medula óssea vascularizada intacta, com suas características imunológicas únicas. </li><li> Use cera óssea para alcançar a hemostasia nos espaços da medula. Óssea suavizar as bordas usando ronjeurs em preparação para o destinatário. </li><li> Manter o enxerto na sua perfundido pedículo vascular até vasos femorais do destinatário são preparados (figura 3). </li><li> Uma vez que a dissecção destinatário estiver concluída, ligadura dos vasos femorais de doadores como proximal possível umaª infundir o enxerto com histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK, Custodiol, Newtown PA) antes do transplante. NOTA: O membro doador é transplantado no lado contralateral do destinatário ou seja, o membro doador esquerda para o lado direito do recipiente e o membro doador direito para o lado esquerdo do receptor). </li><li> Eutanásia o porco doador imediatamente após a colheita da segunda parte traseira utilizando pentobarbital sódico 100 mg / kg IV. A morte foi confirmada pela equipe veterinária por protocolo estabelecido. </li></ol> 4. Procedimento Destinatário (Hind Limb Alotransplante) <ol><li> Comece a indução e intubação receptor imediatamente após a incisão inicial dador para permitir a preparação de vasos receptores, enquanto o membro doador está a ser colhida. Isso elimina o tempo de espera necessário e reduz o tempo total de anestesia para o dador e receptores. </li><li> Posicione o supino animal com uma rotação de 30 ° no lado operacional para alloexposição w do lado dorsolateral. </li><li> Fazer uma incisão na virilha e expor os vasos femorais, isolá-los distalmente ao nível dos ramos suprageniculado e proximal ao nível do ligamento inguinal. </li><li> Criar uma bolsa subcutânea a partir da virilha para a parede abdominal dorsolateral para a inserção do enxerto (Figura 4). </li><li> Ligadura dos navios dadores e lave o enxerto com HTK. </li><li> Realizar a inserção do enxerto de forma invertida: Já o remo pele virada para dorsolateral para permitir o monitoramento fácil imune em uma posição ereta e as extremidades cortadas dos vasos femorais enfrentam caudal para permitir anastomoses vasculares end-to-end, sem qualquer tensão sobre os vasos ( Figura 5). </li><li> Se possível, use um dispositivo de acoplamento vascular (Synovis, St Paul MN) para anastomoses venosas (2,5-3,5 tamanho é adequado para animais de 10-20 kg). Isto reduz significativamente o tempo de isquemia, quando comparado com os métodos convencionais. </li><li> Realize anast arterialomoses usando uma técnica de sutura convencional com 9-0 sutura (Synovis, St Paul MN) </li><li> Após a permeabilidade vascular for confirmada, proteger o enxerto no lugar com 3-0 suturas PDS (Figura 5). Os músculos do enxerto são suturados para os músculos da parede abdominal. Os músculos de enxerto não deve ser suturado aos músculos da coxa de destinatários, uma vez que pode ser prejudicial quando o animal se move ao redor da gaiola. </li><li> Exteriorizar o remo pele no lado dorsolateral para monitorização imune (Figura 6) e uma sutura de pele adjacente utilizando suturas 3-0 Vicryl subcutâneos e de monofilamento 4-0 suturas absorvíveis interrompidas. </li><li> Feche a pele virilha em camadas usando 3-0 Vicryl suturas subcutâneas e monofilamento 4-0 absorvíveis suturas interrompidas. </li><li> Coloque um pedaço de 50-100 mcg / hr fentanil para analgesia pós-operatória. </li><li> Após o transplante do enxerto dos membros posteriores, devolver o animal para a sua caneta, uma vez acordado e respirando confortavelmente em sua própria.</li>
</ol>

<ol><li>Barth, R. N., Rodriguez, E. D., Mundinger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+bone+marrow-based+immunosuppression+inhibits+rejection+of+vascularized+composite+allografts+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Vascularized bone marrow-based immunosuppression inhibits rejection of vascularized composite allografts in nonhuman primates.</a> Am. J. Transplant. 11 (7), 1407-1416 (2011).</li>
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<li>Hettiaratchy, S., Mendely, E., Randolph, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+to+composite+tissue+allografts+across+a+major+histocompatibility+barrier+in+miniature+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tolerance to composite tissue allografts across a major histocompatibility barrier in miniature swine.</a> Transplantation. 27, 514-521 (2004).</li>
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<li>Mathes, D. W., Randolph, M. A., Solari, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+tolerance+to+a+composite+tissue+allotransplant+in+a+swine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Split tolerance to a composite tissue allotransplant in a swine model.</a> Transplantation. 75 (1), 25-31 (2003).</li>
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<li>Sucher, R., Lin, C., Zanoun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+hind+limb+transplantation%3A+a+new+composite+tissue+allotransplantation+model+using+nonsuture+supermicrosurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery.</a> Transplantation. 90, 1374-1380 (2010).</li>
<li>Ustüner, E. T., Majzob, R. K., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swine+composite+tissue+allotransplant+model+for+preclinical+hand+transplant+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies.</a> Microsurgery. 20, 400-406 (2000).</li>
<li>Ustüner, E. T., Zdichavsky, M., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+composite+tissue+allograft+survival+in+a+porcine+model+with+cyclosporine%2Fmycophenolate+mofetil+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term composite tissue allograft survival in a porcine model with cyclosporine/mycophenolate mofetil therapy.</a> Transplantation. 661, 581-587 (1998).</li>
<li>Wachtman, G. S., Wimmers, E. G., Gorantla, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologicals+and+donor+bone+marrow+cells+for+targeted+immunomodulation+in+vascularized+composite+allotransplantation%3A+a+translational+trial+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Biologicals and donor bone marrow cells for targeted immunomodulation in vascularized composite allotransplantation: a translational trial in swine.</a> Transplant Proc. 43, 3541-3544 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Historicamente, o protocolo de transplante heterotópico membro posterior incluídos exteriorização de uma pá de pele da parede abdominal ventral e os vasos anastomosados ​​de uma maneira extremo-a-lado (Hettiarachty 2004). No entanto, em nosso método modificado, uma aba invertida insetting e end-to-end anastomoses trazer o remo pele mais lateralmente e, portanto, facilita o monitoramento imunológico em uma posição de pé do animal. A identificação da artéria sural e as zonas de máxima de perfusão utilizando próximo angiog...

Vascularizado Composite Alotransplante (VCA), tais como mãos e rosto transplantes são agora uma realidade clínica com inúmeros transplantes de mão e rosto realizados em todo o mundo 12. Apesar do facto de que os resultados iniciais e intermediários são favoráveis ​​e muito encorajadores 2, o requisito de imunossupressão multidroga crónica continua a limitar a sua aplicação clínica generalizada. Os avanços em modelos murinos de VCA incluindo anastomoses super-microcirurgia e técnicas de punho nonsuture 13, 3 abriram o caminho para uma melhor compreensão do aloimunes respostas em VCA. Miríades de protocolos imunomoduladores têm sido propostos para aplicações clínicas com base em nossa melhor compreensão dos mecanismos imunes em VCA, mas eles precisam ser validados em um modelo animal de grande porte que seria razoavelmente preditivo do seu desempenho em humanos 7. Com base nas semelhanças fisiológicas e imunológicas entre os sistemas de órgãos humanos e suínos <sup&gt; 6, os modelos VCA suína podem ser consideradas alternativas confiáveis ​​e de baixo custo a canino 9 e modelos de primatas não humanos 1. Este artigo fornece uma visão detalhada da metodologia utilizada em nosso modelo MHC-definido suína heterotópico traseira membro transplante, que serve como base para as nossas estratégias imunomoduladoras atuais e futuras destinadas a induzir tolerância imunológica a VCA e, consequentemente, ampliando sua aplicação clínica. Nós utilizamos porcos puras bem caracterizados criados para homozigose no antígeno leucocitário lócus suína especificamente para seu uso em pesquisa relacionada ao transplante 11. Nós levantamos uma ponta osteomyocutaneous vascularizado baseado em vasos femorais. A aba contém medula óssea vascularizada intacto no fêmur distal e tíbia proximal. A pele da coxa anteromedial também está incluído no enxerto e é exteriorizada do aspecto dorsolateral do animal receptor por monitorização imunitária do componente o mais imunogênicaf o VCA. Posicionamento Dorsolateral facilita o exame clínico em pé e sentada, e também mantém a pele do enxerto relativamente limpa. Ustener et al. Introduziu um dos primeiros grandes modelos translacionais animais em VCA por transplante radiais abas membro anterior osteomyocutaneous em suínos fazenda outbred 15. O grupo utilizou este modelo para demonstrar pela primeira vez que a rejeição aguda em VCA que inclui o componente de pele altamente imunogénica pode ser retardada e tratada com uma estratégia clinicamente relevantes sem complicações específicos da droga e os efeitos colaterais significativos. Os resultados favoráveis ​​obtidos neste estudo posteriormente construído um passo fundamental na concepção de regimes de medicamentos para transplante de reconstrução humana. Embora estes modelos VCA porco precoce foram bem adequado para o desenvolvimento de protocolos para evitar a rejeição de pele, músculo, ossos, nervos e vasos que não tinham estruturas especializadas, como articular cartilage e membranas sinoviais das articulações. Os esforços subsequentes foram focados na inclusão do dígito medial do animal, o que exigiu a colocação elenco completo para evitar o deslocamento do enxerto 14. Embora adequado para investigar a rejeição de todos os principais componentes do transplante de limbo, uma das principais limitações deste modelo era pós-transplante dificuldade ambulatorial devido ao lançar colocação. Assim, os modelos de alotransplante membro suína heterotópicos, que consiste na tíbia, fíbula, articulação do joelho, fêmur distal, músculo circundante, e uma pá de pele, foram criados para estudar principalmente os aspectos imunológicos da VCA, permitindo que o animal de deambular livremente no pós-operatório com morbidit mínimo 8 . O desenvolvimento de porcos puras SLA definidos bem caracterizados através do trabalho pioneiro do Dr. David H. Sachs levou a uma nova era de pesquisa translacional VCA. Utilizando um modelo de transplante heterotópico membro posterior em um ambiente antígeno incompatibilidade menor, Mathes et al. 10 demonstraram sobrevivência indefinida de componentes músculo-esqueléticas com um curto período de tratamento ciclosporina. A sobrevivência componente da pele, no entanto, só foi prolongada quando comparado com os controlos sem tratamento. A perda da componente da pele do enxerto foi atribuída a uma resposta imune isolado e altamente vigorosa, em particular, para a epiderme. Da mesma forma, usando porcos totalmente incompatíveis com depleção de células T, um curso curto de ciclosporina e de citocinas mobilizou doadores de células mononucleares do sangue periférico induzidos tolerância apenas aos componentes osteomusculares eo componente pele ainda foi rejeitado 5. Esse fenômeno, chamado de &quot;tolerância dividida &#39;, trouxe uma mudança de paradigma na investigação VCA com um foco maior sobre o componente da pele altamente imunogênica, que é um componente integral da maioria dos transplantes de reconstrução realizados até o momento. Neste modelo modificado, nós utilizamos anastomose fim-de-final por ligating a artéria femoral destinatário e rodando-cefálica (Figura 1). Isto não só reduz o tempo de isquemia, permitindo a utilização de um dispositivo de acoplamento convencional, mas também diminui a probabilidade de falha da anastomose. Não observamos eventos isquêmicos seguintes ligadura da artéria femoral em nossos destinatários, indicando que a circulação colateral foi suficiente para fornecer a vascularização na perna nativa. Além disso, neste método modificado, o componente de pele é exteriorizada mobilizados com base nos vasos subjacentes perfurantes e está posicionada lateralmente (Figura 1), em contraste com uma posição ventral virilha no modelo tradicional 10. Isso permite fácil visualização do enxerto para o monitoramento imunológico em pé ou sentado do animal. Assim, um grande modelo animal confiável e reprodutível é essencial para investigar estratégias de indução de tolerância em relação a componente de pele de VCA e desenvolver novos nestratégias de monitoramento do sistema imunológico oninvasive para uma melhor previsão de sobrevida do enxerto.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>HTK</td><td>Custodial</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Electric Pen Drive</td><td>Synthes, Westchester PA</td><td>05.001.011</td> Dispositivo de acoplamento vascular <td>de serra sabre</td></tr><tr><td></td><td>Synovis, Newtown PA</td><td>21003B</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de transplante heterotópico modificado swine hind limb para translational vascularizado composite alotransplante (vca) pesquisa

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

Vascularizado Composite Alotransplante (VCA), tais como mãos e rosto transplantes de representar uma opção viável de tratamento para trauma músculo-esquelético complexo e perda de tecido devastador. Apesar de os resultados funcionais favoráveis ​​e altamente encorajadores precoce e intermediário, a rejeição do componente pele altamente imunogênica de um VCA e potenciais efeitos adversos da imunossupressão multi-droga crônica continuam a dificultar a aplicação clínica generalizada de VCA. Portanto, a pesquisa neste campo novela precisa de se concentrar em estudos translacionais relacionados a características imunológicas únicas de VCA e desenvolver estratégias novas para imunomoduladores imunomodulação e indução de tolerância seguintes VCA, sem a necessidade de imunossupressão a longo prazo. Este artigo descreve um modelo de animal grande translação fiável e reprodutível de VCA, que é composta de uma aba osteomyocutaneous num suína alotransplante membro posterior heterotópico de MHC definidas. BriEFLY, uma pá pele bem vascularizado é identificada na região ântero-medial da coxa usando perto angiografia laser infravermelho. Os músculos subjacentes, articulação do joelho, fêmur distal e tíbia proximal são colhidas em um pedículo vascular femoral. Este enxerto pode ser considerado tanto um VCA e um transplante de medula óssea vascularizada com as suas características privilegiadas imunológicas únicas. O enxerto é transplantado para uma bolsa abdominal subcutânea no animal receptor com um componente de pele exteriorizados na região dorso-lateral para a monitorização imunitária. Três equipes cirúrgicas trabalhar simultaneamente de uma forma bem coordenada para reduzir a anestesia e os tempos de isquemia, melhorando assim a eficiência deste modelo e reduzindo potenciais fatores de confusão em protocolos experimentais. Este modelo serve como a base para futuras estratégias terapêuticas que visam a redução e, potencialmente eliminando a necessidade de imunossupressão crônica multi-droga em VCA.

Vinte e quatro transplantes de membros posteriores heterotópicos suína SLA definidos foram realizadas utilizando a nossa técnica modificada com um tempo de isquemia médio de 78 min (intervalo: 62-94 min). Inserção do enxerto e dorsolateral posicionamento pá pele foram alcançados sem dificuldades em todos os animais. Perto angiografia laser infravermelho mostrou excelente perfusão do enxerto em todos os destinatários. Os doze anastomoses venosas iniciais foram realizadas utilizando técnicas de sutura convencionais, enqua...

Vascularizado Composite Allotransplantations (VCA) tornaram-se uma realidade clínica. No entanto, a vasta aplicação clínica de VCA é limitada pela imunossupressão multi-droga crónica. Os autores apresentam um grande modelo animal confiável e reprodutível para traduzir estratégias inovadoras imunomoduladores que podem minimizar ou potencialmente eliminar a necessidade de imunossupressão em VCA.

Um modelo de transplante heterotópico Modificado Swine Hind Limb para Translational vascularizado Composite Alotransplante (VCA) Pesquisa

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

O objetivo geral do seguinte experimento é estabelecer um modelo translacional confiável e reprodutível em grande animal para o transplante de membro inferior contendo medula óssea vascularizada intacta, a fim de estudar os resultados imunológicos de protocolos imunomodulatórios clinicamente relevantes. Isso é alcançado inicialmente pela coleta de um retalho osteomiocutâneo para estudar as características imunológicas únicas do componente cutâneo do aloenxerto compósito vascularizado ou VCA, juntamente com a medula óssea vascularizada. Em seguida, o aloenxerto é transplantado para um bolsão subcutâneo na parede abdominal, o que torna o modelo tecnicamente viável sem comprometer a locomoção do receptor.Em seguida, o componente da pele é exteriorizado para a parede abdominal dorsolateral para monitorar o enxerto por meio de inspeção visual direta do animal em posição ereta. Os resultados demonstram que este é um modelo confiável e reprodutível para testar protocolos imunomoduladores clinicamente relevantes que utilizam terapias baseadas em células e agentes biológicos. A principal vantagem desta técnica em relação aos modelos existentes, como os modelos caninos e de primatas não humanos de AVC, é que ela é mais econômica, apresenta o menor risco de infecção zoonótica e possui linhagens de doadores e receptores definidas pelo SLA.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do transplante reconstrutivo relacionadas à característica única de privilégio imunológico da medula óssea vascularizada e abrirá caminho para o desenvolvimento de um protocolo imunomodulatório clinicamente relevante que minimize a imunossupressão. Desenvolvemos inicialmente a ideia para este modelo de transplante, no qual testamos a imunogenicidade de diversos componentes de um enxerto alogênico de membro e demonstramos o fenômeno da tolerância dividida, há quase duas décadas. Antes da colheita do membro alogênico, o porco doador é sedado e conectado a um ventilador para receber isof, flúor e oxigênio durante todo o procedimento.Após a depilação, lavagem e desinfecção do local cirúrgico, posicione o animal doador em posição supina sobre a mesa cirúrgica e cubra-o com um campo estéril. Em seguida, utilize angiografia a laser com infravermelho próximo para identificar os perfurantes da pele intermedial. Então, injete verde de indocianina em solução salina por meio do acesso vascular periférico.Aproximadamente 10 segundos depois, realize gravações de infravermelho próximo por um período de 30 segundos a dois minutos. Em seguida, com base nos perfurantes identificados, marque uma área da pele para um retalho cutâneo que será usado posteriormente para monitoramento imunológico. Após verificar a profundidade da anestesia do animal por meio dos reflexos palpebral e de preensão do dedo, use um bisturi para fazer uma incisão na pele da virilha, contínua com as marcações para o retalho cutâneo, dissecando a pele e o tecido subcutâneo, preservando a área da pele do retalho.Suture as bordas da pele aos músculos subjacentes para evitar contração durante a retirada do retalho. Em seguida, identifique os vasos femorais e isole-os proximalmente até o nível do ligamento inguinal. Ligue os ramos distalmente até o nível da pala cutânea para obter um comprimento ideal de quatro centímetros com uma serra alternada, realize uma osteotomia logo acima da articulação do tornozelo.Em seguida, utilize eletrocoagulação para dividir os músculos na região proximal da coxa. Seccione o fêmur do doador ao nível da metade do corpo, deixando um retalho osteomiocutâneo com um retalho cutâneo vascularizado. O retalho contém o retalho cutâneo, os músculos subjacentes da coxa, o fêmur distal e a articulação do joelho, a tíbia proximal e, portanto, uma medula óssea vascularizada intacta.Devido às suas características imunológicas únicas, mantenha o enxerto do doador perfundido em seu pedículo vascular até que os vasos femorais do receptor estejam prontos. Imediatamente após a incisão no doador ser iniciada, conecte o porco receptor a um ventilador e inicie a anestesia com isoflurano, conforme demonstrado com o porco doador. Insira um cateter para administração de soro fisiológico e administre buprenorfina pre emptiva e antibióticos profiláticos.Posicione o animal em posição supina com boa exposição da superfície lateral dorsal e verifique o nível de anestesia. Em seguida, faça uma incisão inguinal para expor os vasos femorais e isole-os por três a quatro centímetros, distal e proximalmente em relação ao nível do ligamento inguinal. Depois, crie um bolsão subcutâneo da virilha até a parede abdominal lateral dorsal para a inserção do enxerto.Agora, ligue os vasos doadores e use solução de histidina, triptofano, cetoglutárato ou solução HTK para lavar o tecido enxertado. Se esta for a colheita final do doador, eutanazie imediatamente o animal de acordo com o protocolo para animais para realizar a implantação do enxerto. Posicione-o de maneira invertida, de modo que a extremidade cortada do fêmur esteja voltada para baixo, permitindo a anastomose sem qualquer tensão sobre os vasos, utilizando um dispositivo de acoplamento vascular.Se disponível, prepare uma anastomose venosa. O dispositivo reduzirá significativamente o tempo de isquemia. Em seguida, utilizando suturas 8-0 e uma técnica convencional de sutura, realize uma anastomose arterial após a confirmação da patência vascular.Use três suturas OPDS para fixar o enxerto, suturando os músculos do enxerto aos músculos da parede abdominal do receptor para monitoramento imunológico. Exteriorize o retalho cutâneo no lado dorsolateral. Em seguida, suture as camadas profundas usando três suturas Vicryl 3-0 e fixe o tecido à pele do receptor com quatro suturas cutâneas interrompidas absorvíveis 4-0 de monofilamento.Por fim, feche a pele da virilha em camadas usando três pontos subcutâneos de Vicryl 4-0, seguidos por quatro pontos isolados de sutura absorvível monofilamentosa 4-0 na pele. Para analgesia pós-operatória, aplique um adesivo de fentanil de 50 microgramas por hora no animal assim que ele estiver acordado e respirando confortavelmente por conta própria.Retorne o animal à sua baiia e permita que coma e beba água à vontade. Observe o animal quanto a sinais de dor ou desconforto a cada quatro horas durante as primeiras 24 horas e, em seguida, duas vezes ao dia. Foram realizados 19 transplantes de membros posteriores heterotópicos em suínos com MHC definido utilizando nossa técnica modificada.Esses transplantes foram realizados com o objetivo de desenvolver estratégias terapêuticas para induzir tolerância imunológica em AVC. Este modelo foi utilizado com sucesso no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para tolerância imunológica em AVC com longo prazo de sobrevida livre de rejeição, enquanto os grupos-controle demonstraram rejeição acelerada do enxerto após a interrupção da imunossupressão convencional. Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em uma a duas horas para cada membro doador e de duas a três horas para cada procedimento receptor, se realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o membro contralateral do doador é transplantado para o bolso na parede abdominal do receptor de forma que o membro direito seja transplantado para a virilha esquerda e vice-versa, após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de transplante reconstrutivo explorassem novos protocolos imunomodulatórios capazes de minimizar a necessidade de imunossupressão vitalícia e, assim, favorecer a relação risco-benefício dessa modalidade inovadora. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão dos aspectos técnicos do transplante heterotópico de membro posterior contendo medula óssea vascularizada intacta. Esse modelo confiável e reprodutível de transplante de membro abrirá caminho para o desenvolvimento de novos protocolos imunomodulatórios que minimizem e potencialmente eliminem a necessidade de imunossupressão crônica com múltiplas drogas.

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