SABEDORIA Protein: A Workbench para In silico De novo Projeto de biomoléculas

O objetivo geral do experimento a seguir é projetar proteínas ou peptídeos para melhorar as propriedades de dobramento, ligação ou funcionais. Isso é obtido carregando a proteína ou estrutura complexa e definindo mutação e restrições biológicas Para definir o objetivo do projeto como uma segunda etapa, é realizada a otimização da seleção de sequências, que produz um grande número de possíveis sequências de proteínas ou peptídeos com propriedades aprimoradas de estabilidade e interação. Próxima dobra.

Cálculos de especificidade e/ou afinidade de ligação aproximada são realizados na sequência projetada para validar as proteínas ou peptídeos projetados para as propriedades aprimoradas desejadas. São obtidos resultados que mostram propriedades melhoradas das sequências projetadas com base na análise computacional das estruturas produzidas através do procedimento. Este protocolo foi desenvolvido no laboratório do professor Chris Doles, flautista da Universidade de Princeton.

Este protocolo computacional geral de design de proteínas de novo é capaz de abordar várias áreas importantes do design de proteínas. Isso inclui o design de proteínas monoméricas para maior estabilidade e complexos para maior afinidade de ligação. Tivemos vários projetos de sucesso notáveis em uma variedade de áreas terapêuticas diferentes, incluindo inibidores de inibidores de H-I-V-G-P 41, visando EZH dois para terapias e inibidores do câncer, visando componentes do complemento C3 A.In fim de disponibilizar a aplicação da metodologia de design de proteínas para a comunidade acadêmica em geral, desenvolvemos uma interface web chamada Protein Wisdom.

Essa interface permite que o usuário tenha controle total do envio do modelo, definição de restrição de design e especificação de parâmetros de método para empregar facilmente os métodos de design para uma ampla variedade de problemas de design Após o registro do usuário no site da sabedoria de proteínas, conforme descrito no protocolo de texto, envie a sequência de proteínas e a estrutura do modelo, mas clicando no botão de login do usuário. Para iniciar o experimento de design de proteínas, o usuário é apresentado à página inicial do usuário, que lista o número de trabalhos enviados, o número de estruturas carregadas e uma lista das estruturas carregadas até o momento. Comece um novo trabalho de design.

Ao clicar em criar novo trabalho, o usuário é levado para a página de envio de trabalho. Dê um nome ao trabalho e indique se ele é baseado em um trabalho anterior. Clique em continuar.

Carregue a estrutura da proteína do modelo de design. Este modelo deve estar no formato padrão de banco de dados de proteínas ou PDB. Pode ser um modelo rígido com um conjunto de coordenadas para cada átomo ou um modelo flexível com vários modelos, como os obtidos a partir de estruturas de solução de RMN.

Para o caso de projetar uma única proteína, pode haver apenas uma cadeia. No modelo, um usuário pode carregar um novo modelo ou selecionar modelos existentes que carregou anteriormente. Se vários modelos forem carregados, certifique-se de que cada modelo comece com o número do modelo e termine com o modelo final.

Certifique-se de que cada resíduo seja designado por um aminoácido natural. Clique em continuar. Depois que o modelo for carregado e confirmado com sucesso, o usuário será levado para a página de controle principal.

Nesta página, o usuário pode visualizar o status do trabalho, modificar os conjuntos de mutações e as restrições biológicas e enviar o trabalho para a seleção de sequência do estágio um. Neste ponto, como o estágio um não foi concluído, não há opções para o estágio dois. Eles aparecem assim que os resultados do primeiro estágio estão disponíveis.

Em seguida, clique no link dos conjuntos de mutações na página principal de controle para definir os conjuntos de mutações, selecione quais resíduos poderão sofrer mutação e selecione em quais aminoácidos eles poderão sofrer mutação. Por padrão, os aminoácidos permitidos em qualquer posição são selecionados com base na área de superfície acessível ao solvente ou são necessários conjuntos de mutações SSA. Clique em salvar alterações depois que os conjuntos de mutações forem selecionados.

Observe a complexidade computacional da otimização a ser resolvida. Há um limite superior de 20 elevado à 25ª potência para complexidade computacional permitido. Em seguida, clique no link de restrições biológicas na página principal de controle para definir restrições biológicas, especificar restrições de carga ou conteúdo de aminoácidos em toda a proteína ou em uma parte do limite de proteína.

O número total de mutações permitidas para ocorrer, se necessário, as restrições biológicas são opcionais. Retorne à página de controle principal quando terminar. Clique no link iniciar o estágio um para levar o usuário a enviar a página do estágio um.

Selecione a cadeia para projetar o número de sequências para gerar o campo de força dependente da distância e o cálculo do modelo. Detalhes específicos sobre essas seleções podem ser encontrados no protocolo de texto. Envie o trabalho, o usuário será redirecionado de volta para a página de controle principal.

O status do trabalho será atualizado para indicar o progresso atual do trabalho. O trabalho ficará bloqueado para edição após o envio. Após a conclusão do trabalho, o usuário recebe um e-mail com os resultados, que consistem em uma lista de sequências projetadas.

Os resultados também podem ser visualizados na página de controle principal. Uma caixa para especificidade de dobra de estágio dois aparece na página para habilitar o usuário Para executar essa validação, clique em iniciar especificidade de dobra de estágio dois. Para entrar na página do estágio de construção dois, defina os limites de distância de carbono alfa superior e inferior especificando o fator de flexibilidade do modelo, como uma porcentagem de distância ou como uma distância fixa.

Em seguida, defina os limites dos ângulos superior e inferior nos ângulos PHI e diedro lateral. Ao especificar o fator de flexibilidade do modelo como uma porcentagem, clique no botão enviar, especifique o número de estruturas por sequência a serem geradas e clique em Continuar. Observe que há um limite superior de 500 estruturas por sequência a serem geradas.

Em seguida, clique em continuar para confirmar a intenção de enviar para validação de dobra. O estágio um e o estágio dois estão bloqueados para edição até a conclusão do estágio dois. Após a conclusão do trabalho, um e-mail é enviado ao usuário com os resultados, que também podem ser visualizados na página principal de controle.

Aqui, os arquivos de texto contendo sequências projetadas, valores de energia correspondentes do estágio um e valores de especificidade de dobra do estágio dois podem ser visualizados e baixados. Além disso, o usuário pode clicar no link de visualização de resultados, que exibe uma tabela no navegador com classificações de estágio um e valores de energia, bem como classificações de estágio dois e valores de especificidade de dobra. Cálculos de afinidade de ligação aproximada são usados para determinar a afinidade da proteína ou peptídeo ligante projetado com o resto do complexo.

Esses cálculos podem ser realizados diretamente após o estágio um ou após a conclusão dos cálculos de especificidade da dobra. Para começar, clique no número de sequência para selecionar a sequência. Para iniciar o cálculo da afinidade de ligação aproximada, o usuário será direcionado para a página de seleção de sequência, que apresenta uma lista das sequências de design, juntamente com sua seleção de sequência e classificações de especificidade de dobra.

Depois que a sequência é selecionada e salva, o usuário é redirecionado para a página de controle principal. Em seguida, clique em Iniciar estágio dois, afinidade de associação aproximada para enviar o trabalho após a conclusão, os resultados são enviados por email ao usuário, que incluem um anexo contendo o número de sequência, a associação aproximada, a afinidade e os valores das funções de partição. Para cada trabalho de afinidade de associação aproximada subsequente, esse arquivo contém os resultados de todas as sequências concluídas.

Os resultados completos também podem ser visualizados acessando a página de controle principal do trabalho mostrado. Aqui está o modelo de design para inibidores de entrada do HIV um, que é a estrutura cristalina do link C 14 no meio de um peptídeo reticulado de 14 resíduos em complexo com o núcleo GP 41. Este peptídeo molde é um inibidor potente conhecido e é submetido com o reticulador removido.

Depois que as entradas do projeto são definidas e o sistema é enviado para a seleção da sequência do estágio um. Os resultados da seleção de sequência classificada podem ser acessados por meio dos links de resultados da visualização na página principal do trabalho. Este link fornece um resumo facilmente legível de todos os resultados calculados para um determinado sistema, que podem ser classificados por qualquer um dos resultados do estágio.

Para uma análise rápida, os resultados também podem ser visualizados através do link de resultados da sequência, que fornece um resumo das sequências selecionadas em código de aminoácidos de três letras. A terceira opção para acessar os resultados é por meio do link de resultados de energia, que fornece um resumo do modelo de otimização executado com as sequências selecionadas, suas energias e o tempo necessário para resolver o modelo para a solução. Após a conclusão do estágio um, seleção de sequência e envio dos métodos de especificidade de duas vezes e afinidade de ligação aproximada, os resultados podem ser acessados e classificados na seção de resultados da visualização resumida.

Como alternativa, eles podem ser exibidos individualmente na seção Resultados de especificidade de dobra na seção Resultados de especificidade de dobra, os valores de número de sequência e especificidade de dobra são fornecidos como uma matriz. Os resultados dos cálculos de afinidade de vinculação aproximada de amostra são apresentados como uma lista classificável Na seção de resultados da exibição, todas as sequências que foram executadas para o cálculo de afinidade de vinculação aproximada têm um link destacado na coluna de exibição. O link de exibição leva o usuário a uma página de informações de design.

Esta página fornece arquivos zip para download para todas as estruturas complexas e peptídicas usadas. Na etapa final de projeto da estrutura para as estruturas complexas e peptídicas, as 10 principais estruturas de energia mais baixa são fornecidas em uma lista ordenada por classificação. Cada estrutura possui um link de visualização, que permite ao usuário visualizar a estrutura em um ambiente JM O interativo.

Um link de download também é fornecido para permitir que o usuário baixe cada estrutura individualmente. Mais detalhes dos resultados são apresentados na seção de resultados de afinidade de ligação aproximada. Esta seção fornece os valores para a proteína peptídica e as funções de partição complexa, juntamente com o valor final aproximado de afinidade de ligação.

Ao trabalhar com a sabedoria da proteína, é importante lembrar que a seleção de restrições de design pode ter um grande impacto nos resultados gerais do design. As restrições de design não apenas aceleram a pesquisa geral, limitando a quantidade de espaço de sequência que os algoritmos de otimização devem explorar, mas a utilização de restrições de otimização derivadas de informações experimentais pode levar à obtenção de designs de proteínas biologicamente relevantes. Esperamos que a disponibilidade dos métodos de design por meio da sabedoria da proteína da interface da web permita um uso mais amplo dos métodos de design.

Continuamos a expandir e desenvolver as capacidades dos métodos de design e esperamos generalizar a estrutura para incluir sistemas multiméricos, interações de DNA de proteínas e design com modificações pós-traducionais e aminoácidos não canônicos em um futuro próximo. A cada expansão, a disponibilidade dos métodos por meio da proteína Wisdom permitirá uma aplicação fácil e eficiente pela comunidade acadêmica.