Name: SABEDORIA Protein: A Workbench para In silico De novo Projeto de biomoléculas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprenda a usar o Protein WISDOM para projeto computacional de proteínas de novo. Esta ferramenta online permite projetar proteínas monoméricas com estabilidade aprimorada e complexos com maior afinidade de ligação.

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CAF agradece o apoio da NSF, NIH (R01 GM52032; R24 GM069 736) e a Agência de Proteção Ambiental dos EUA, EPA (R 832721-010). Uma parte dessa pesquisa foi possível com o apoio do governo do DoD, Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea. JS agradece o apoio do NIH (P50GM071508-06). A MLBP agradece o apoio de uma bolsa de pós-graduação em ciência e engenharia de defesa nacional (NDSEG), 32 CFR 168a. O GAK agradece o apoio de uma bolsa de pesquisa de pós-graduação da National Science Foundation sob o número de concessão DGE-1148900.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A estrutura de design de proteína de novo consiste em dois estágios, um estágio de seleção de sequência e um estágio de validação. A estrutura é robusta o suficiente para lidar com modelos de design rígidos e flexíveis e pode ser aplicada a um design de proteína única ou a um design de proteína complexa. A estrutura foi aplicada com sucesso a vários sistemas de proteínas com aplicações em dezenas de doenças. Vários projetos foram validados experimentalmente, fornecendo os inibidores ou agonistas mais potentes de...

O design de proteína de novo é a identificação de sequências de proteínas que produzirão uma estrutura terciária desejada com propriedades ou função aprimoradas. Como a dobra nativa de uma proteína é a conformação que está no mínimo de energia livre, o design de proteína de novo busca sequências que terão um mínimo de energia livre na dobra alvo. Esse problema foi descrito pela primeira vez por Drexler1 e Pabo2 e foi chamado de "problema de dobramento inverso". No entanto, ao contrário do problema de dobramento de proteínas, onde uma sequência pode produzir apenas uma solução de estrutura dobrada, o problema de design de proteínas de novo exibe degeneração. Muitas sequências de aminoácidos diferentes podem produzir a mesma estrutura e função terciária.
Embora o design de proteínas tenha sido tradicionalmente realizado experimentalmente por meio de design racional e evolução direcionada, métodos computacionais têm sido empregados mais recentemente para superar o espaço de busca limitado inerente aos métodos experimentais. Uma variedade de métodos computacionais tem sido usada, incluindo métodos determinísticos, métodos estocásticos e métodos probabilísticos. 3,4 Os primeiros métodos computacionais usavam modelos de backbone fixo para tornar o problema mais fácil de resolver. 5-7 Com o advento de processadores mais rápidos, computação de alto desempenho e algoritmos mais eficientes, a flexibilidade do backbone foi incorporada usando um conjunto de modelos de backbone fixo8-14 ou incorporando a verdadeira flexibilidade do backbone, expressando o modelo em termos de intervalos de distâncias átomo a átomo e ângulos diedros. 15,16
Este artigo descreve em detalhes o Protein WISDOM, uma ferramenta online que foi disponibilizada para a comunidade acadêmica para utilizar nossa estrutura computacional de design de proteínas de novo. Essa estrutura foi aplicada ao design de inúmeras proteínas, para uso terapêutico direcionado a doenças como HIV, câncer, doenças do complemento e outras doenças autoimunes. Muitos dos peptídeos previstos foram validados experimentalmente, demonstrando o poder do método. A Tabela 1 fornece um resumo das diferentes proteínas que foram projetadas, incluindo o tamanho da proteína ou peptídeo, o número de previsões e a validação experimental.
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Design de proteínas</td>
			<td>Comprimento da proteína</td>
			<td># de previsões computacionais</td>
			<td># de validações experimentais</td>
			<td>referência</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Projeto de sequência completa de beta-defensina-2 humana</td>
			<td>41</td>
			<td>340</td>
			<td> </td>
			<td>Acessórios (17)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores da compestatina de C3 humano</td>
			<td>13</td>
			<td>28</td>
			<td>3/3</td>
			<td>(18, 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Análogos da compstatina que se ligam ao C3c de rato</td>
			<td>13</td>
			<td>5</td>
			<td> </td>
			<td>(20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Análogos da compestatina com extensão de diserina</td>
			<td>15</td>
			<td>8</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Estrutura estabilizadora do análogo da compstatina W4A9</td>
			<td>13</td>
			<td>18</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agonistas e antagonistas do receptor C3a</td>
			<td>77</td>
			<td>20</td>
			<td>4/7</td>
			<td>Acessórios (21)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agonistas e antagonistas do receptor C5a</td>
			<td>74</td>
			<td>61</td>
			<td>2/61</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores do HIV-1 gp14</td>
			<td>12</td>
			<td>6</td>
			<td>4/5</td>
			<td>Acessórios (22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores do HIV-1 gp120</td>
			<td>9</td>
			<td>14</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores de Bak de Bcl-x L e Bcl-2</td>
			<td>16-18</td> anos
			<td>10</td>
			<td>5/5</td>
			<td>Acessórios (23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores de ERK2</td>
			<td>11</td>
			<td>25</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores de EZH2</td>
			<td>21</td>
			<td>17</td>
			<td>10/10</td>
			<td>Eletrônicos (24)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores de LSD1 e LSD2</td>
			<td>16</td>
			<td>41</td>
			<td>17/20</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores de HLA-DR1</td>
			<td>13</td>
			<td>6</td>
			<td> </td>
			<td>Acessórios (25)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores de PNP</td>
			<td>5</td>
			<td>13</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Resumo das proteínas e peptídeos projetados usando a estrutura de design de proteínas de novo. O # de previsões computacionais é apresentado como o número de previsões favoráveis (ou seja, especificidades de dobra acima de um certo corte ou afinidades de ligação aproximadas maiores que a sequência nativa). O # de validações experimentais fornece dois números: o primeiro é o número de previsões que foram validadas experimentalmente, enquanto o segundo é o número total de previsões que foram testadas experimentalmente.
O projeto de beta-defensina-2 humana (hβD-2) foi realizado para melhorar a propriedade antimicrobiana do peptídeo. 17 Para este desenho, consideramos dois casos: 1) até 10 mutações ao longo de hβD-2 e 2) desenho de sequência completa de todas as posições de resíduos de hβD-2, exceto as cisteínas (8, 15, 20, 30, 37 e 38). Três modelos de design diferentes e três modelos de seleção de sequência diferentes foram utilizados no design. Altos níveis de similaridade nas mutações foram observados entre os modelos de média ponderada e compartimento de distância tanto para o projeto de 10 mutações quanto para o projeto de sequência completa. Além disso, um grande número de sequências apresentou valores de especificidade de dobra calculados mais favoráveis do que a sequência nativa.
Os inibidores do sistema complemento (de C3, C3a e C5a) foram projetados para combater uma série de doenças imunológicas, como acidente vascular cerebral, ataque cardíaco, doença de Alzheimer, asma, artrite reumatóide, rejeição de xenotransplante, doença respiratória do adulto, psoríase e doença de Crohn. Três inibidores de compstatina de C3c previstos pela estrutura de design de proteínas, além de três sequências racionalmente projetadas, foram validados experimentalmente para serem melhores aglutinantes do que a compstatina nativa. 18,19
Outros estudos examinaram a perda de atividade da compstatina contra C3c não primatas e projetaram vários candidatos a inibidores de C3c em ratos e camundongos. Cinco sequências mostraram ter energias livres de associação mais favoráveis com C3c de rato do que o mutante de compstatina W4A9 conhecido por inibir C3c. Isso se deve a uma nova formação de ponte salina por Arg1. 20 Oito sequências com extensão N-terminal foram previstas como melhores ligantes do que W4A9 com extensão di-Serina. Finalmente, 18 sequências de compstatina foram previstas para estabilizar a conformação ligada de W4A9, fornecendo fortes candidatos para inibidores de C3c em primatas e não primatas.
Além dos inibidores de C3c, os agonistas e antagonistas dos receptores de C3a e C5a foram projetados com base nas estruturas de C3a e C5a. Sete sequências de C3a previstas pelo modelo foram testadas experimentalmente. Duas das sequências eram agonistas potentes, enquanto outras duas eram agonistas parciais. 21 Os dois agonistas potentes mostraram uma melhora de 58 vezes em relação a um "superagonista" descoberto anteriormente. O desenho dos agonistas e antagonistas do receptor C5a forneceu um conjunto de 61 sequências. Todas as sequências foram sintetizadas e duas foram consideradas novos agonistas de C5a.
Os inibidores de fusão do HIV-1, o vírus que causa a AIDS, foram projetados para impedir que o HIV-1 infecte as células. O primeiro projeto teve como alvo a gp41, uma glicoproteína de envelope do HIV-1. A estrutura de design de proteínas previu seis sequências que eram melhores ligantes do que a sequência nativa. Quatro dessas sequências previstas foram validadas experimentalmente para inibir o HIV-1, com a melhor sequência tendo um IC50 tão baixo quanto 29 μM. Esta sequência mostrou uma melhoria de 3-15 vezes em relação à sequência nativa e não teve perda de atividade contra uma cepa de vírus resistente a Enfuvirtida. 22 O segundo projeto teve como alvo a gp120, outra glicoproteína de envelope do HIV-1. Quatorze sequências foram previstas para serem aglutinantes de gp120 e fornecer inibidores de fusão potenciais adicionais do HIV-1.
Numerosas proteínas ligadas ao câncer forneceram alvos promissores para a terapêutica do câncer. Bcl-2 e Bcl-xL são proteínas antiapoptóticas que previnem a morte celular. Os inibidores dessas duas proteínas foram projetados para induzir a morte celular em células cancerígenas. Dez sequências foram previstas como melhores aglutinantes do que as nativas, e esses resultados capturaram resultados experimentais e de mutagênese anteriores. 23 Outra proteína-alvo, ERK2, está envolvida em cascatas de transdução de sinal que a tornam um alvo promissor para terapias antiproliferativas contra o câncer. Vinte e cinco sequências foram previstas como inibidoras de ERK2.
As metiltransferases e desmetilases de histonas controlam dinamicamente a metilação das histonas, que tem sido associada a muitos tipos de câncer, incluindo próstata, mama, linfoma, mieloma, bexiga, cólon, pele, fígado, endométrio, pulmão e gástrico. A estrutura de design de proteína de novo identificou 17 inibidores de EZH2 (uma lisina metiltransferase) e dos dez testados experimentalmente, todos inibiram EZH2. 24 O peptídeo mais potente tinha um IC50 de cerca de 13 μM, era igualmente eficaz com concentrações elevadas de enzimas e não competia com o cofator. Esses peptídeos foram o primeiro conjunto de inibidores de EZH2. 53 inibidores de LSD1 (uma desmetilase) foram previstos pela estrutura e dos 20 testados experimentalmente, 17 eram inibidores de LSD1 e 18 eram inibidores de LSD2. Os melhores inibidores apresentaram valores de IC50 abaixo de 1 μM, tornando-os os inibidores peptídicos mais potentes descobertos até o momento.
Os dois sistemas de proteínas finais forneceram alvos para o tratamento de várias doenças autoimunes, como doença celíaca, diabetes mellitus tipo 1, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjögren, síndrome de Churg-Strauss, tireoidite de Hashimoto, doença de Graves, púrpura trombocitopênica idiopática, artrite reumatóide e alergias. Nenhum desses inibidores potenciais foi validado experimentalmente, no entanto, a estrutura previu seis sequências que se ligam ao HLA-DR1 e 13 sequências que se ligam ao PNP.
A Tabela 2 resume os inibidores e agonistas validados experimentalmente previstos usando a estrutura de design de proteína de novo. A métrica de afinidade de ligação aproximada foi usada para prever nove das sequências (inibidores de C3c humano, HIV-1 gp41, EZH2, LSD1 e LSD2), enquanto a métrica de especificidade de dobra foi usada para identificar quatro das sequências (agonistas / antagonistas de C3aR). Esses peptídeos destacam o sucesso da estrutura de design de proteínas de novo, particularmente a métrica de afinidade de ligação aproximada adicionada. A estrutura é extremamente versátil em sua aplicabilidade. Seis proteínas diferentes ligadas a vinte e cinco doenças diferentes foram projetadas com sucesso e validadas experimentalmente.
<table border="1" cellpadding="1" cellspacing="1" height="147" width="856">
	<tbody>
		<tr>
			<td>nome</td>
			<td>IC50</td>
			<td>EC50</td>
			<td>Alvo de proteína</td>
			<td>Doenças aplicáveis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ027</td>
			<td>0,94 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c humano</td>
			<td colspan="1" rowspan="7">acidente vascular cerebral, ataque cardíaco, doença de Alzheimer, asma, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, psoríase, diabetes tipo I, doença de Crohn, pancreatite e fibrose cística</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ086</td>
			<td>1,98 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c humano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ059</td>
			<td>4,73 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c humano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ110-4</td>
			<td> </td>
			<td>15,2 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ060-4</td>
			<td> </td>
			<td>36,4 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ007-5</td>
			<td>15,4 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ002-5</td>
			<td>26,1 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUADRADO435</td>
			<td>29 - 253 μM</td>
			<td> </td>
			<td>HIV-1 gp41</td>
			<td>SIDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ037</td>
			<td>13,57 μM</td>
			<td> </td>
			<td>EZH2</td>
			<td colspan="1" rowspan="5">câncer de próstata, mama, linfoma, mieloma, bexiga, cólon, pele, fígado, endométrio, pulmão e estômago</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ011-1</td>
			<td>0,521 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ016-1</td>
			<td>0,249 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ026-1</td>
			<td>2,51 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ015-1</td>
			<td>1.332 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Peptídeos previstos computacionalmente e validados experimentalmente direcionados a várias doenças.

sabedoria protein: a workbench para<em&gt; in silico</em&gt;<em&gt; de novo</em&gt; projeto de biomoléculas

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

O objectivo da concepção de novo de proteínas é de encontrar as sequências de aminoácidos que se dobram numa estrutura 3-dimensional desejada com melhorias nas propriedades específicas, como a afinidade de ligação, comportamento agonista ou antagonista, ou estabilidade, em relação à sequência nativa. Projeto proteína está no centro da atual concepção de medicamentos avanços e descoberta. Não só o projeto proteína fornecer previsões para alvos de drogas potencialmente úteis, mas também melhora a nossa compreensão do processo de enovelamento de proteínas e interações proteína-proteína. Métodos experimentais, tais como evolução dirigida têm demonstrado sucesso em design de proteína. No entanto, tais métodos são restringidos pela sequência espaço limitado que pode ser pesquisado tractably. Em contraste, as estratégias para a concepção computacional permitir a projecção de um conjunto muito maior de sequências que abrangem uma grande variedade de propriedades e funcionalidades. Nós desenvolvemos uma gama de ambientes computacionais de novo proteína projeto metodods capazes de abordar várias áreas importantes do projeto proteína. Estas incluem o desenho de proteínas monoméricas para o aumento da estabilidade e complexos para aumentar a afinidade de ligação. Para difundir mais ampla destes métodos para usar apresentamos SABEDORIA Proteína ( <a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a> ), uma ferramenta que proporciona métodos automatizados para uma variedade de problemas de concepção de proteínas. Modelos estruturais são submetidos a iniciar o processo de design. A primeira etapa do projeto é uma fase de selecção seqüência de otimização que visa melhorar a estabilidade através da minimização de energia potencial no espaço de sequência. Seqüências selecionadas são, então, passar por um estágio especificidade dobra e um estágio de afinidade de ligação. A lista de classificação ordenada das seqüências para cada etapa do processo, juntamente com estruturas projetadas relevantes, proporciona ao usuário uma avaliação quantitativa abrangente do design. Aqui nós fornecemos os detalhes of cada método de criação, bem como alguns sucessos notáveis ​​experimentais obtidos através da utilização dos métodos.

Projeto De Novo de Inibidores de Entrada para o HIV-1
A estrutura de projeto de novo implementada no Protein WISDOM tem sido usada para o desenvolvimento de peptídeos inibidores em diversos sistemas terapêuticos importantes (Tabelas 1 e 2). Um sistema notável é o projeto de peptídeos para inibir a entrada do HIV-1 no receptor celular hospedeiro CD4, que aqui é utilizado como um sistema representativo para demonstrar o uso prático da interface Protein WISDOM. Os ...

Desenvolvemos métodos computacionais de design de proteínas de novo capazes de lidar com várias áreas importantes do design de proteínas. Para disseminar esses métodos, apresentamos o Protein WISDOM, uma ferramenta online para design de proteínas (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). A partir de um modelo estrutural, o projeto de proteínas monoméricas para maior estabilidade e complexos para maior afinidade de ligação pode ser realizado.

SABEDORIA Protein: A Workbench para<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Projeto de biomoléculas

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

O objetivo geral do experimento a seguir é projetar proteínas ou peptídeos com propriedades aprimoradas de dobramento, ligação ou função. Isso é alcançado enviando a estrutura da proteína ou do complexo e definindo mutações e restrições biológicas. Como segundo passo, para definir o objetivo do projeto, é realizada uma otimização de seleção de sequência, que produz um grande número de possíveis sequências de proteínas ou peptídeos com propriedades aprimoradas de estabilidade e interação. Em seguida, dobrar.Realizam-se cálculos de especificidade e/ou afinidade de ligação aproximada na sequência projetada com o objetivo de validar as proteínas ou peptídeos projetados quanto às propriedades melhoradas desejadas. Obtêm-se resultados que demonstram propriedades aprimoradas das sequências projetadas com base na análise computacional das estruturas produzidas por meio do procedimento. Este protocolo foi desenvolvido no laboratório do Professor Chris Doles, flautista da Universidade de Princeton.Este protocolo computacional geral de design de proteínas de novo é capaz de abordar diversas áreas importantes do design de proteínas. Estas incluem o design de proteínas monoméricas para maior estabilidade e complexos para maior afinidade de ligação. Obtivemos diversos designs notavelmente bem-sucedidos em uma variedade de áreas terapêuticas diferentes, incluindo inibidores da G-P-41 do H-I-V, direcionando EZH dois para terapêuticas contra o câncer e inibidores que visam os componentes do complemento C3 A. Para tornar a aplicação da metodologia de design de proteínas disponível para a comunidade acadêmica mais ampla, desenvolvemos uma interface web chamada Protein Wisdom.Esta interface permite ao usuário ter controle total sobre o envio de modelos, a definição de restrições de design e a especificação de parâmetros do método, facilitando a aplicação dos métodos de design para uma ampla variedade de problemas de design. Após o registro do usuário no site Protein Wisdom, conforme descrito no protocolo textual, envie a sequência proteica e a estrutura modelo, clicando no botão de login do usuário. Para iniciar o experimento de design de proteína, o usuário é direcionado à página inicial do usuário, que exibe o número de tarefas enviadas, o número de estruturas carregadas e uma lista das estruturas já carregadas até o momento. Inicie uma nova tarefa de design.Ao clicar em criar novo trabalho, o usuário é direcionado à página de envio do trabalho. Dê um nome ao trabalho e indique se ele é baseado em um trabalho anterior. Clique em continuar.Faça o upload da estrutura proteica do modelo de projeto. Este modelo deve estar no formato padrão de banco de dados de proteínas ou formato PDB. Pode ser um modelo rígido com um conjunto de coordenadas para cada átomo ou um modelo flexível com múltiplos modelos, como os obtidos a partir de estruturas em solução por RMN.No caso de projetar uma única proteína, pode haver apenas uma cadeia. No modelo, um usuário pode carregar um novo modelo ou selecionar entre modelos existentes que tenham sido previamente carregados. Se forem carregados múltiplos modelos, certifique-se de que cada modelo comece com o número do modelo e termine com fim do modelo.Certifique-se de que cada resíduo seja designado por um aminoácido natural. Clique em continuar. Após o modelo ter sido carregado e confirmado com sucesso, o usuário é direcionado para a página principal de controle.Nesta página, o usuário pode visualizar o status do trabalho, modificar os conjuntos de mutações e as restrições biológicas, e submeter o trabalho para a seleção de sequência da etapa um. Neste momento, como a etapa um ainda não foi concluída, não há opções para a etapa dois. Essas opções aparecem somente quando os resultados da etapa um estiverem disponíveis.Em seguida, clique no link conjuntos de mutação na página principal de controle para definir conjuntos de mutação, selecione quais resíduos poderão sofrer mutação e selecione para quais aminoácidos eles poderão mutar. Por padrão, os aminoácidos permitidos em qualquer posição são selecionados com base na área de superfície acessível ao solvente ou são necessários conjuntos de mutação SSA. Clique em salvar alterações após a seleção dos conjuntos de mutação.Observe a complexidade computacional da otimização a ser resolvida. Existe um limite superior de 20 à 25ª potência para a complexidade computacional permitida. Em seguida, clique no link restrições biológicas na página de controle principal para definir restrições biológicas, especificando limites de carga ou conteúdo de aminoácidos em toda a proteína ou em uma parte dela.O número total de mutações permitidas para ocorrer, se necessário, sendo que as restrições biológicas são opcionais. Retorne à página principal de controle ao finalizar. Clique no link iniciar estágio um para levar o usuário à página de envio do estágio um.Selecione a cadeia para definir o número de sequências para gerar o campo de força dependente da distância e o cálculo do modelo. Detalhes específicos sobre essas seleções podem ser encontrados no protocolo textual. Envie a tarefa; o usuário será redirecionado de volta à página principal de controle.O status da tarefa será atualizado para indicar o progresso atual do trabalho. A tarefa ficará bloqueada para edição após o envio. Após a conclusão da tarefa, o usuário recebe um e-mail com os resultados, que consistem em uma lista de sequências projetadas.Os resultados também podem ser visualizados na página principal de controle. Uma caixa para a especificidade da dobra da fase dois aparece na página para permitir ao usuário realizar esta validação; clique em iniciar especificidade da dobra da fase dois. Para acessar a página da fase dois, defina os limites superior e inferior da distância entre os carbonos alfa, especificando o fator de flexibilidade do molde, seja como uma porcentagem da distância ou como uma distância fixa.Em seguida, defina os limites angulares superiores e inferiores para os ângulos diedrais PHI e laterais. Ao especificar o fator de flexibilidade do modelo como uma porcentagem, clique no botão enviar, especifique o número de estruturas por sequência a serem geradas e clique em Continuar. Observe que há um limite superior de 500 estruturas por sequência a serem geradas.Em seguida, clique em continuar para confirmar a intenção de submeter à validação de dobramento. A etapa um e a etapa dois ficam bloqueadas para edição até a conclusão da etapa dois. Após a conclusão do processo, um e-mail é enviado ao usuário com os resultados, que também podem ser visualizados na página principal de controle.Aqui é possível visualizar e baixar os arquivos de texto contendo as sequências projetadas, os valores de energia correspondentes da etapa um e os valores de especificidade de dobramento da etapa dois. Além disso, o usuário pode clicar no link "visualizar resultados", que exibe uma tabela no navegador com os ranques e valores de energia da etapa um, bem como os ranques e valores de especificidade de dobramento da etapa dois. Cálculos aproximados de afinidade de ligação são utilizados para determinar a afinidade da proteína ou peptídeo ligante projetado em relação ao restante do complexo.Esses cálculos podem ser realizados diretamente após a primeira etapa ou após a conclusão dos cálculos de especificidade de dobramento. Para começar, clique no número da sequência para selecionar a sequência. Para iniciar o cálculo aproximado de afinidade de ligação, o usuário será direcionado à página de seleção de sequência, que apresenta uma lista das sequências projetadas, juntamente com suas classificações de seleção de sequência e especificidade de dobramento.Uma vez que a sequência é selecionada e salva, o usuário é redirecionado para a página principal de controle. Em seguida, clique em Iniciar estágio dois, afinidade de ligação aproximada para submeter a tarefa; após a conclusão, os resultados são enviados por e-mail ao usuário, incluindo um anexo contendo o número da sequência, a afinidade de ligação aproximada e os valores das funções de partição. Para cada tarefa subsequente de afinidade de ligação aproximada, este arquivo contém os resultados de todas as sequências concluídas.Os resultados completos também podem ser visualizados acessando a página de controle principal do trabalho exibido. Abaixo está o modelo estrutural para inibidores de entrada do HIV-1, que corresponde à estrutura cristalina do peptídeo cruzado de 14 resíduos C14 ligado ao núcleo da GP41. Esse peptídeo modelo é um inibidor potente conhecido e foi submetido sem o agente de reticulação.Após as entradas de projeto serem definidas e o sistema ser submetido para a seleção de sequência da fase um, os resultados ordenados da seleção de sequência podem ser acessados por meio dos links de visualização de resultados na página principal da tarefa. Este link fornece um resumo facilmente legível de todos os resultados calculados para um determinado sistema, que podem ser ordenados por qualquer um dos resultados das fases.Para uma análise rápida, os resultados também podem ser visualizados por meio do link de resultados de sequência, que fornece um resumo das sequências selecionadas em código de aminoácidos de três letras. A terceira opção para acessar os resultados é por meio do link de resultados de energia, que apresenta um resumo da execução do modelo de otimização com as sequências selecionadas, suas energias e o tempo necessário para resolver o modelo e obter a solução. Após a conclusão da etapa um, seleção de sequências e envio dos métodos da etapa dois para especificidade de dobramento e afinidade de ligação aproximada, os resultados podem ser acessados e organizados na seção de visualização de resultados do resumo.Alternativamente, eles podem ser visualizados individualmente na seção Dobras – Resultados de Especificidade, na qual os números das sequências e os valores de especificidade das dobras são fornecidos como um array. Os resultados dos cálculos aproximados de afinidade de ligação são apresentados como uma lista classificável. Na seção Visualizar Resultados, todas as sequências que foram processadas para o cálculo aproximado de afinidade de ligação possuem um link destacado na coluna Visualizar. O link Visualizar direciona o usuário a uma página com informações do desenho.Esta página fornece arquivos zip para download com todas as estruturas de complexos e peptídeos utilizadas. Na etapa final de design estrutural, tanto para os complexos quanto para as estruturas peptídicas, são fornecidas as 10 estruturas de energia mais baixa em uma lista classificada por ordem de classificação. Cada estrutura possui um link de visualização, que permite ao usuário visualizar a estrutura em um ambiente JM O interativo.Um link para download também é fornecido para permitir que o usuário baixe cada estrutura individualmente. Mais detalhes dos resultados são apresentados na seção de resultados de afinidade de ligação aproximada. Esta seção fornece os valores das funções de partição do peptídeo, da proteína e do complexo, juntamente com o valor final da afinidade de lig游戏副本 aproximada.Ao trabalhar com o protein wisdom, é importante lembrar que a seleção de restrições de projeto pode ter um grande impacto nos resultados gerais do projeto. As restrições de projeto não apenas aceleram a busca geral ao limitar a quantidade de espaço de sequência que os algoritmos de otimização devem explorar, mas também o uso de restrições de otimização derivadas de informações experimentais pode levar à obtenção de projetos de proteínas biologicamente relevantes. Esperamos que a disponibilidade dos métodos de projeto por meio da interface web protein wisdom permita um uso mais amplo desses métodos.Continuamos a expandir e desenvolver as capacidades dos métodos de design e esperamos generalizar a estrutura para incluir sistemas multiméricos, interações proteína-DNA e o design com modificações pós-traducionais e aminoácidos não canônicos em um futuro próximo. Com cada expansão, a disponibilidade dos métodos por meio do Protein Wisdom permitirá uma aplicação fácil e eficiente pela comunidade acadêmica.

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JoVE Journal

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Biologia

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A análise de partículas únicas na microscopia crio-elétron é uma das principais técnicas utilizadas para determinar a estrutura dos conjuntos biológicos em alta resolução. A Scipion fornece as ferramentas para criar todo o gasoduto para processar as informações adquiridas pelo microscópio e alcançar uma reconstrução 3D do espécime biológico.

Crio-EM e Análise de Partículas Únicas com Scipion

Uma habilidade fundamental na modelagem biomolecular é exibir e anotar locais ativos em proteínas. Esta técnica é demonstrada usando quatro programas gratuitos populares para visualização macromolecular: iCn3D, Jmol, PyMOL e UCSF QuimeraX.

Modelando um site ativo enzimático usando freeware de visualização molecular

Este protocolo fornece uma abordagem para otimização de formulação sobre fatores de estudo de mistura, contínuos e categóricos que minimiza escolhas subjetivas na construção do planejamento experimental. Para a fase de análise, um procedimento de ajuste de modelagem eficaz e fácil de usar é empregado.

Um fluxo de trabalho para otimização de formulação de nanopartículas lipídicas (LNP) usando experimentos de processo de mistura projetados e modelos de conjunto autovalidados (SVEM)

Este protocolo apresenta as ferramentas disponíveis para modelar ligantes de moléculas pequenas em mapas crioEM de macromoléculas.

Modelagem de ligantes em mapas derivados da criomicroscopia eletrônica

O design de proteínas envolve a construção de sequências de aminoácidos e a incorporação de motivos específicos para criar variantes funcionais. Essa abordagem é fundamental para o desenvolvimento de peptídeos antimicrobianos (AMPs) para combater patógenos resistentes a antibióticos. Este artigo apresenta um procedimento para construção de proteínas usando várias ferramentas de bioinformática.

Aplicação de I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, servidor HADDOCK e HEX loria para design de proteínas De Novo e In Silico

Este protocolo fornece um método para a otimização global sistemática de biossensores geneticamente codificados por meio da geração e avaliação de bibliotecas genéticas assistidas por automação. Isso é combinado com metodologias de design de experimento para agilizar a experimentação e permitir a seleção de componentes genéticos para ajustar os biossensores a resultados de design específicos.

Amostragem eficiente de espaço de design de biossensor geneticamente codificado habilitado com um design de experimentos e fluxo de trabalho de automação

Nós apresentamos um procedimento para a formação de um poli (etileno glicol) monocamada auto-montados (PEG-SAM) em um substrato de silício com microeletrodos de ouro. O PEG-SAM é formada em uma única etapa e impede a incrustação em superfícies de silício e ouro. Eletroforese é então utilizado para padronização biomoléculas até a nanoescala.

Antifouling monocamadas auto-organizadas em Microeletrodos de Biomoléculas Patterning

O vídeo que acompanha descreve o uso do Sistema de Fracionamento GELFREE 8100, que partições amostras de proteínas complexas com base no peso molecular e recupera as frações em fase líquida. O vídeo descreve como a tecnologia funciona, como ele é usado, e fornece dados resultantes, com análise de eletroforese em gel de poliacrilamida de homogenato de fígado bovino fracionado.

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

Aprenda a usar o Protein WISDOM para projeto computacional de proteínas de novo. Esta ferramenta online permite projetar proteínas monoméricas com estabilidade aprimorada e complexos com maior afinidade de ligação.

SABEDORIA Protein: A Workbench para

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