Name: SABEDORIA Protein: A Workbench para In silico De novo Projeto de biomoléculas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprenda a usar o Protein WISDOM para projeto computacional de proteínas de novo. Esta ferramenta online permite projetar proteínas monoméricas com estabilidade aprimorada e complexos com maior afinidade de ligação.

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CAF agradece o apoio da NSF, NIH (R01 GM52032; R24 GM069 736) e a Agência de Proteção Ambiental dos EUA, EPA (R 832721-010). Uma parte dessa pesquisa foi possível com o apoio do governo do DoD, Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea. JS agradece o apoio do NIH (P50GM071508-06). A MLBP agradece o apoio de uma bolsa de pós-graduação em ciência e engenharia de defesa nacional (NDSEG), 32 CFR 168a. O GAK agradece o apoio de uma bolsa de pesquisa de pós-graduação da National Science Foundation sob o número de concessão DGE-1148900.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A estrutura de design de proteína de novo consiste em dois estágios, um estágio de seleção de sequência e um estágio de validação. A estrutura é robusta o suficiente para lidar com modelos de design rígidos e flexíveis e pode ser aplicada a um design de proteína única ou a um design de proteína complexa. A estrutura foi aplicada com sucesso a vários sistemas de proteínas com aplicações em dezenas de doenças. Vários projetos foram validados experimentalmente, fornecendo os inibidores ou agonistas mais potentes de...

O design de proteína de novo é a identificação de sequências de proteínas que produzirão uma estrutura terciária desejada com propriedades ou função aprimoradas. Como a dobra nativa de uma proteína é a conformação que está no mínimo de energia livre, o design de proteína de novo busca sequências que terão um mínimo de energia livre na dobra alvo. Esse problema foi descrito pela primeira vez por Drexler1 e Pabo2 e foi chamado de "problema de dobramento inverso". No entanto, ao contrário do problema de dobramento de proteínas, onde uma sequência pode produzir apenas uma solução de estrutura dobrada, o problema de design de proteínas de novo exibe degeneração. Muitas sequências de aminoácidos diferentes podem produzir a mesma estrutura e função terciária.
Embora o design de proteínas tenha sido tradicionalmente realizado experimentalmente por meio de design racional e evolução direcionada, métodos computacionais têm sido empregados mais recentemente para superar o espaço de busca limitado inerente aos métodos experimentais. Uma variedade de métodos computacionais tem sido usada, incluindo métodos determinísticos, métodos estocásticos e métodos probabilísticos. 3,4 Os primeiros métodos computacionais usavam modelos de backbone fixo para tornar o problema mais fácil de resolver. 5-7 Com o advento de processadores mais rápidos, computação de alto desempenho e algoritmos mais eficientes, a flexibilidade do backbone foi incorporada usando um conjunto de modelos de backbone fixo8-14 ou incorporando a verdadeira flexibilidade do backbone, expressando o modelo em termos de intervalos de distâncias átomo a átomo e ângulos diedros. 15,16
Este artigo descreve em detalhes o Protein WISDOM, uma ferramenta online que foi disponibilizada para a comunidade acadêmica para utilizar nossa estrutura computacional de design de proteínas de novo. Essa estrutura foi aplicada ao design de inúmeras proteínas, para uso terapêutico direcionado a doenças como HIV, câncer, doenças do complemento e outras doenças autoimunes. Muitos dos peptídeos previstos foram validados experimentalmente, demonstrando o poder do método. A Tabela 1 fornece um resumo das diferentes proteínas que foram projetadas, incluindo o tamanho da proteína ou peptídeo, o número de previsões e a validação experimental.
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Design de proteínas</td>
			<td>Comprimento da proteína</td>
			<td># de previsões computacionais</td>
			<td># de validações experimentais</td>
			<td>referência</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Projeto de sequência completa de beta-defensina-2 humana</td>
			<td>41</td>
			<td>340</td>
			<td> </td>
			<td>Acessórios (17)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores da compestatina de C3 humano</td>
			<td>13</td>
			<td>28</td>
			<td>3/3</td>
			<td>(18, 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Análogos da compstatina que se ligam ao C3c de rato</td>
			<td>13</td>
			<td>5</td>
			<td> </td>
			<td>(20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Análogos da compestatina com extensão de diserina</td>
			<td>15</td>
			<td>8</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Estrutura estabilizadora do análogo da compstatina W4A9</td>
			<td>13</td>
			<td>18</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agonistas e antagonistas do receptor C3a</td>
			<td>77</td>
			<td>20</td>
			<td>4/7</td>
			<td>Acessórios (21)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agonistas e antagonistas do receptor C5a</td>
			<td>74</td>
			<td>61</td>
			<td>2/61</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores do HIV-1 gp14</td>
			<td>12</td>
			<td>6</td>
			<td>4/5</td>
			<td>Acessórios (22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores do HIV-1 gp120</td>
			<td>9</td>
			<td>14</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores de Bak de Bcl-x L e Bcl-2</td>
			<td>16-18</td> anos
			<td>10</td>
			<td>5/5</td>
			<td>Acessórios (23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores de ERK2</td>
			<td>11</td>
			<td>25</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores de EZH2</td>
			<td>21</td>
			<td>17</td>
			<td>10/10</td>
			<td>Eletrônicos (24)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores de LSD1 e LSD2</td>
			<td>16</td>
			<td>41</td>
			<td>17/20</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores de HLA-DR1</td>
			<td>13</td>
			<td>6</td>
			<td> </td>
			<td>Acessórios (25)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibidores de PNP</td>
			<td>5</td>
			<td>13</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Resumo das proteínas e peptídeos projetados usando a estrutura de design de proteínas de novo. O # de previsões computacionais é apresentado como o número de previsões favoráveis (ou seja, especificidades de dobra acima de um certo corte ou afinidades de ligação aproximadas maiores que a sequência nativa). O # de validações experimentais fornece dois números: o primeiro é o número de previsões que foram validadas experimentalmente, enquanto o segundo é o número total de previsões que foram testadas experimentalmente.
O projeto de beta-defensina-2 humana (hβD-2) foi realizado para melhorar a propriedade antimicrobiana do peptídeo. 17 Para este desenho, consideramos dois casos: 1) até 10 mutações ao longo de hβD-2 e 2) desenho de sequência completa de todas as posições de resíduos de hβD-2, exceto as cisteínas (8, 15, 20, 30, 37 e 38). Três modelos de design diferentes e três modelos de seleção de sequência diferentes foram utilizados no design. Altos níveis de similaridade nas mutações foram observados entre os modelos de média ponderada e compartimento de distância tanto para o projeto de 10 mutações quanto para o projeto de sequência completa. Além disso, um grande número de sequências apresentou valores de especificidade de dobra calculados mais favoráveis do que a sequência nativa.
Os inibidores do sistema complemento (de C3, C3a e C5a) foram projetados para combater uma série de doenças imunológicas, como acidente vascular cerebral, ataque cardíaco, doença de Alzheimer, asma, artrite reumatóide, rejeição de xenotransplante, doença respiratória do adulto, psoríase e doença de Crohn. Três inibidores de compstatina de C3c previstos pela estrutura de design de proteínas, além de três sequências racionalmente projetadas, foram validados experimentalmente para serem melhores aglutinantes do que a compstatina nativa. 18,19
Outros estudos examinaram a perda de atividade da compstatina contra C3c não primatas e projetaram vários candidatos a inibidores de C3c em ratos e camundongos. Cinco sequências mostraram ter energias livres de associação mais favoráveis com C3c de rato do que o mutante de compstatina W4A9 conhecido por inibir C3c. Isso se deve a uma nova formação de ponte salina por Arg1. 20 Oito sequências com extensão N-terminal foram previstas como melhores ligantes do que W4A9 com extensão di-Serina. Finalmente, 18 sequências de compstatina foram previstas para estabilizar a conformação ligada de W4A9, fornecendo fortes candidatos para inibidores de C3c em primatas e não primatas.
Além dos inibidores de C3c, os agonistas e antagonistas dos receptores de C3a e C5a foram projetados com base nas estruturas de C3a e C5a. Sete sequências de C3a previstas pelo modelo foram testadas experimentalmente. Duas das sequências eram agonistas potentes, enquanto outras duas eram agonistas parciais. 21 Os dois agonistas potentes mostraram uma melhora de 58 vezes em relação a um "superagonista" descoberto anteriormente. O desenho dos agonistas e antagonistas do receptor C5a forneceu um conjunto de 61 sequências. Todas as sequências foram sintetizadas e duas foram consideradas novos agonistas de C5a.
Os inibidores de fusão do HIV-1, o vírus que causa a AIDS, foram projetados para impedir que o HIV-1 infecte as células. O primeiro projeto teve como alvo a gp41, uma glicoproteína de envelope do HIV-1. A estrutura de design de proteínas previu seis sequências que eram melhores ligantes do que a sequência nativa. Quatro dessas sequências previstas foram validadas experimentalmente para inibir o HIV-1, com a melhor sequência tendo um IC50 tão baixo quanto 29 μM. Esta sequência mostrou uma melhoria de 3-15 vezes em relação à sequência nativa e não teve perda de atividade contra uma cepa de vírus resistente a Enfuvirtida. 22 O segundo projeto teve como alvo a gp120, outra glicoproteína de envelope do HIV-1. Quatorze sequências foram previstas para serem aglutinantes de gp120 e fornecer inibidores de fusão potenciais adicionais do HIV-1.
Numerosas proteínas ligadas ao câncer forneceram alvos promissores para a terapêutica do câncer. Bcl-2 e Bcl-xL são proteínas antiapoptóticas que previnem a morte celular. Os inibidores dessas duas proteínas foram projetados para induzir a morte celular em células cancerígenas. Dez sequências foram previstas como melhores aglutinantes do que as nativas, e esses resultados capturaram resultados experimentais e de mutagênese anteriores. 23 Outra proteína-alvo, ERK2, está envolvida em cascatas de transdução de sinal que a tornam um alvo promissor para terapias antiproliferativas contra o câncer. Vinte e cinco sequências foram previstas como inibidoras de ERK2.
As metiltransferases e desmetilases de histonas controlam dinamicamente a metilação das histonas, que tem sido associada a muitos tipos de câncer, incluindo próstata, mama, linfoma, mieloma, bexiga, cólon, pele, fígado, endométrio, pulmão e gástrico. A estrutura de design de proteína de novo identificou 17 inibidores de EZH2 (uma lisina metiltransferase) e dos dez testados experimentalmente, todos inibiram EZH2. 24 O peptídeo mais potente tinha um IC50 de cerca de 13 μM, era igualmente eficaz com concentrações elevadas de enzimas e não competia com o cofator. Esses peptídeos foram o primeiro conjunto de inibidores de EZH2. 53 inibidores de LSD1 (uma desmetilase) foram previstos pela estrutura e dos 20 testados experimentalmente, 17 eram inibidores de LSD1 e 18 eram inibidores de LSD2. Os melhores inibidores apresentaram valores de IC50 abaixo de 1 μM, tornando-os os inibidores peptídicos mais potentes descobertos até o momento.
Os dois sistemas de proteínas finais forneceram alvos para o tratamento de várias doenças autoimunes, como doença celíaca, diabetes mellitus tipo 1, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjögren, síndrome de Churg-Strauss, tireoidite de Hashimoto, doença de Graves, púrpura trombocitopênica idiopática, artrite reumatóide e alergias. Nenhum desses inibidores potenciais foi validado experimentalmente, no entanto, a estrutura previu seis sequências que se ligam ao HLA-DR1 e 13 sequências que se ligam ao PNP.
A Tabela 2 resume os inibidores e agonistas validados experimentalmente previstos usando a estrutura de design de proteína de novo. A métrica de afinidade de ligação aproximada foi usada para prever nove das sequências (inibidores de C3c humano, HIV-1 gp41, EZH2, LSD1 e LSD2), enquanto a métrica de especificidade de dobra foi usada para identificar quatro das sequências (agonistas / antagonistas de C3aR). Esses peptídeos destacam o sucesso da estrutura de design de proteínas de novo, particularmente a métrica de afinidade de ligação aproximada adicionada. A estrutura é extremamente versátil em sua aplicabilidade. Seis proteínas diferentes ligadas a vinte e cinco doenças diferentes foram projetadas com sucesso e validadas experimentalmente.
<table border="1" cellpadding="1" cellspacing="1" height="147" width="856">
	<tbody>
		<tr>
			<td>nome</td>
			<td>IC50</td>
			<td>EC50</td>
			<td>Alvo de proteína</td>
			<td>Doenças aplicáveis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ027</td>
			<td>0,94 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c humano</td>
			<td colspan="1" rowspan="7">acidente vascular cerebral, ataque cardíaco, doença de Alzheimer, asma, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, psoríase, diabetes tipo I, doença de Crohn, pancreatite e fibrose cística</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ086</td>
			<td>1,98 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c humano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ059</td>
			<td>4,73 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c humano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ110-4</td>
			<td> </td>
			<td>15,2 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ060-4</td>
			<td> </td>
			<td>36,4 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ007-5</td>
			<td>15,4 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ002-5</td>
			<td>26,1 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUADRADO435</td>
			<td>29 - 253 μM</td>
			<td> </td>
			<td>HIV-1 gp41</td>
			<td>SIDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ037</td>
			<td>13,57 μM</td>
			<td> </td>
			<td>EZH2</td>
			<td colspan="1" rowspan="5">câncer de próstata, mama, linfoma, mieloma, bexiga, cólon, pele, fígado, endométrio, pulmão e estômago</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ011-1</td>
			<td>0,521 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ016-1</td>
			<td>0,249 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ026-1</td>
			<td>2,51 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ015-1</td>
			<td>1.332 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Peptídeos previstos computacionalmente e validados experimentalmente direcionados a várias doenças.

sabedoria protein: a workbench para<em&gt; in silico</em&gt;<em&gt; de novo</em&gt; projeto de biomoléculas

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

O objectivo da concepção de novo de proteínas é de encontrar as sequências de aminoácidos que se dobram numa estrutura 3-dimensional desejada com melhorias nas propriedades específicas, como a afinidade de ligação, comportamento agonista ou antagonista, ou estabilidade, em relação à sequência nativa. Projeto proteína está no centro da atual concepção de medicamentos avanços e descoberta. Não só o projeto proteína fornecer previsões para alvos de drogas potencialmente úteis, mas também melhora a nossa compreensão do processo de enovelamento de proteínas e interações proteína-proteína. Métodos experimentais, tais como evolução dirigida têm demonstrado sucesso em design de proteína. No entanto, tais métodos são restringidos pela sequência espaço limitado que pode ser pesquisado tractably. Em contraste, as estratégias para a concepção computacional permitir a projecção de um conjunto muito maior de sequências que abrangem uma grande variedade de propriedades e funcionalidades. Nós desenvolvemos uma gama de ambientes computacionais de novo proteína projeto metodods capazes de abordar várias áreas importantes do projeto proteína. Estas incluem o desenho de proteínas monoméricas para o aumento da estabilidade e complexos para aumentar a afinidade de ligação. Para difundir mais ampla destes métodos para usar apresentamos SABEDORIA Proteína ( <a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a> ), uma ferramenta que proporciona métodos automatizados para uma variedade de problemas de concepção de proteínas. Modelos estruturais são submetidos a iniciar o processo de design. A primeira etapa do projeto é uma fase de selecção seqüência de otimização que visa melhorar a estabilidade através da minimização de energia potencial no espaço de sequência. Seqüências selecionadas são, então, passar por um estágio especificidade dobra e um estágio de afinidade de ligação. A lista de classificação ordenada das seqüências para cada etapa do processo, juntamente com estruturas projetadas relevantes, proporciona ao usuário uma avaliação quantitativa abrangente do design. Aqui nós fornecemos os detalhes of cada método de criação, bem como alguns sucessos notáveis ​​experimentais obtidos através da utilização dos métodos.

Projeto De Novo de Inibidores de Entrada para o HIV-1
A estrutura de projeto de novo implementada no Protein WISDOM tem sido usada para o desenvolvimento de peptídeos inibidores em diversos sistemas terapêuticos importantes (Tabelas 1 e 2). Um sistema notável é o projeto de peptídeos para inibir a entrada do HIV-1 no receptor celular hospedeiro CD4, que aqui é utilizado como um sistema representativo para demonstrar o uso prático da interface Protein WISDOM. Os ...

Desenvolvemos métodos computacionais de design de proteínas de novo capazes de lidar com várias áreas importantes do design de proteínas. Para disseminar esses métodos, apresentamos o Protein WISDOM, uma ferramenta online para design de proteínas (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). A partir de um modelo estrutural, o projeto de proteínas monoméricas para maior estabilidade e complexos para maior afinidade de ligação pode ser realizado.

SABEDORIA Protein: A Workbench para<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Projeto de biomoléculas

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

O objetivo geral do experimento a seguir é projetar proteínas ou peptídeos com propriedades aprimoradas de dobramento, ligação ou função. Isso é alcançado enviando a estrutura da proteína ou do complexo e definindo mutações e restrições biológicas. Como segundo passo, para definir o objetivo do projeto, é realizada uma otimização de seleção de sequência, que produz um grande número de possíveis sequências de proteínas ou peptídeos com propriedades aprimoradas de estabilidade e interação. Em seguida, dobrar.Realizam-se cálculos de especificidade e/ou afinidade de ligação aproximada na sequência projetada com o objetivo de validar as proteínas ou peptídeos projetados quanto às propriedades melhoradas desejadas. Obtêm-se resultados que demonstram propriedades aprimoradas das sequências projetadas com base na análise computacional das estruturas produzidas por meio do procedimento. Este protocolo foi desenvolvido no laboratório do Professor Chris Doles, flautista da Universidade de Princeton.Este protocolo computacional geral de design de proteínas de novo é capaz de abordar diversas áreas importantes do design de proteínas. Estas incluem o design de proteínas monoméricas para maior es

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