Protocolos para Avaliação de radiofreqüência Interações com Nanopartículas de Ouro e Sistemas biológicos para terapia não-invasiva Câncer Hipertermia

O objetivo geral deste procedimento é avaliar as propriedades de aquecimento de nanopartículas de ouro em um campo elétrico de radiofrequência de 13,56 megahertz, in vitro e in vivo. Isso é feito avaliando primeiro a taxa de aquecimento de nanopartículas de ouro concentradas e seu tampão em um veterinário de quartzo. A segunda etapa do procedimento é realizar estudos de toxicidade in vitro de nanopartículas de ouro com células cancerígenas cultivadas.

O terceiro passo é realizar estudos in vivo de nanopartículas de ouro em um modelo de câncer de camundongo ectópico. Em última análise, os resultados podem mostrar se a nanopartícula investigada pode ou não ser um agente eficaz para uso com hipertermia mediada por RF por meio da análise das nanopartículas em suspensão, in vitro e in vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em um campo de hipotermia de radiofrequência não invasiva mediada por nanopartículas, como o aquecimento devido às próprias partículas e pode ser usado para fins terapêuticos?

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não existem muitos protocolos bem estabelecidos para realizar esse tipo de experimento. Demonstrando o procedimento estarão os nomes Cisneros, um assistente de pesquisa, Stuart Core, um cientista de pós-doutorado, e Leila Green, outra cientista de pós-doutorado. Como exemplo, comece com uma garrafa de 500 mililitros de nanopartículas de ouro disponível comercialmente com um diâmetro de cinco nanômetros.

Pegue cerca de 125 mililitros da solução de nanopartículas de ouro e divida-a entre seis tubos de filtro de centrífuga de 50 quilodaltons, centrifugue as nanopartículas a 3000 RPM por dois minutos e cinco segundos. Remova o sobrenadante que é o tampão filtrado e reabasteça cada filtro. Com mais solução de estoque.

Continue a centrifusão e remova o tampão e recarregue os tubos até que toda a solução de nanopartículas tenha sido filtrada. Após a última adição, substitua o tampão filtrado por um volume semelhante de água deionizada e repita o processo aproximadamente mais oito vezes após carregar a amostra de tampão filtrado na máquina de RF. Usando o software da câmera infravermelha, crie caixas sobre o QVE para capturar o perfil de aquecimento Após oito lavagens, os dados de aquecimento do filtrado de nanopartículas de ouro de cinco nanômetros estão se aproximando dos da água deionizada.

A análise de vis UV também pode ser usada para monitorar a absorção de contaminantes. Picos. Aqui é mostrado um espectro limpo. Uma vez que os contaminantes tampão tenham sido totalmente removidos, suspendemos as nanopartículas em 0,5 mililitros de água deionizada nos tubos do filtro que estão removendo as nanopartículas do filtro.

Em seguida, combine todas as seis suspensões em um tubo de 15 mililitros. Agora, analise a amostra usando VIS UV e potencial zeta para dados de estabilidade. Use I-C-P-O-E-S e / ou ICP especificação de massa para determinar a concentração de nanopartículas.

A análise SEM e/ou TEM também pode ser usada para obter dados morfológicos usando um sistema de RF do Kansas ou derivações de carga, uma seringa de quartzo vete de 1,3 mililitro e definir o campo elétrico de RF em cerca de 90 quilovolts por metro no ar onde o Q vete residiria. Para uma amostra salina padrão com cloreto de sódio a 0,9%, o campo elétrico seria reduzido para cerca de 1,1 quilovolts por metro. Estas são as condições aproximadas usadas para permitir comparações entre diferentes sistemas de RF.

Agora, carregue um quartzo limpo com 1,3 mililitros de suspensão de nanopartículas de ouro purificado a uma concentração de 1000 miligramas por litro. Exponha a amostra ao campo de RF por um período de 120 segundos ou até que a amostra atinja 70 graus Celsius. A exposição excessiva pode levar a arco elétrico ou ebulição rápida.

Capture os dados de imagens térmicas, bem como as áreas de controle usando uma câmera IR e o software associado. Repita este procedimento três vezes na mesma amostra. Agora filtre a amostra através de outro filtro centrífuga de 50 kilodalton para extrair as nanopartículas de ouro do tampão de água.

Em seguida, exponha novamente o buffer sozinho ao campo de RF. Novamente, três vezes a diferença nas horas entre o colóide de nanopartículas de ouro e o filtrado determina a HR devido às próprias nanopartículas de ouro. Finalmente, suspendemos as nanopartículas de ouro restantes do filtro em 1,3 mililitros de água para experimentos futuros.

Esses estudos in vitro podem ser aplicados a qualquer tipo de célula cancerígena que forme monocamadas 2D. Neste exemplo, as células B Hep três derivadas do carcinoma hepatocelular humano serão usadas com cerca de 50.000 células. Em três poços de uma placa de 12 poços com um mililitro de crescimento.

A mídia continua carregando células até que três placas sejam preenchidas para estudos de nanopartículas e três placas sejam preenchidas como controles. Incube as placas a 37,5 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, introduza 0,1 mililitro de uma solução de nanopartículas de ouro de 1000 miligramas por litro em cada poço das três placas de nanopartículas nas placas de controle.

Com 0,1 mililitro de água em cada um, incube todas as placas por mais 24 horas. Após mais 24 horas, aspire o meio celular e lave as células com PBS para remover quaisquer nanopartículas de ouro ligadas à superfície. Em seguida, substitua a mídia celular.

As células agora estão prontas para exposição à RF. Coloque cada pacote de células de 12 poços dentro do campo de RF e espere até que as células esfriem a 31 graus Celsius. Depois de ligeiramente resfriado, exponha as células a 3,5 minutos de rf.

A temperatura final do meio celular será de cerca de 37 graus Celsius. Transfira as células para uma incubadora e aguarde 24 horas antes de analisá-las. Quando as células estiverem prontas, aspire o meio e substitua-o por dois mililitros de reagente 25% MTT no meio.

Em seguida, deixe as células incubarem por mais quatro horas. Em seguida, substitua o meio MTT por dois mililitros de DMSO. Coloque as placas celulares em um balancim de bancada por 10 minutos para permitir que o DMSO solubilize os reagentes MTT.

Finalmente, pipete amostras de 100 microlitros de cada poço para uma placa de 96 poços e leia opticamente a placa a 570 nanômetros. Esses estudos in vivo podem ser aplicados a qualquer tipo de câncer que forme tumores sólidos em um modelo de espelhamento ortotópico ou ectópico. Neste exemplo, as células de câncer de fígado Hep três B são usadas com camundongos nus BPC.

Comece com aproximadamente 100.000 células de tripsina congelando as células e produza uma solução de 2 milhões de células por 25 microlitros. Adicione uma quantidade igual de gel de matriz gelada à suspensão celular e misture bem por aspiração repetida em uma pipeta. Agora injete a suspensão mista na posição desejada nas costas de cada animal.

Após algumas semanas, os tumores terão de meio a um centímetro de diâmetro neste momento, iniciarão o tratamento com RF e anestesiarão os camundongos com a solução de cetamina e xilazina por injeção IP e os manterão aquecidos. Em seguida, injete as nanopartículas de ouro diretamente em metade dos tumores usando uma seringa de um cc com uma agulha de calibre 27 ou 30. Use um cotonete cirúrgico para absorver o sangue e limpe o local da injeção com um lenço umedecido em álcool.

Como controle, injete apenas PBS na outra metade dos tumores. Agora, trate metade dos ratos em cada grupo. Monte o mouse na cabeça receptora do gerador de RF e proteja as áreas não tratadas com fita de cobre, incluindo os olhos, ouvidos e dedos dos pés.

A parte mais importante deste experimento é o aterramento adequado de seus ratos. Sem o aterramento adequado, o acúmulo de carga nos animais pode causar lesões térmicas ou eletrodérmicas. Isso pode ser facilmente evitado.

Posicione o tumor fora da cabeça de transmissão em pelo menos um centímetro a mais do que a largura do local de tratamento desejado. Agora, posicione a câmera térmica IR de forma que o tumor e a área de tratamento fiquem visíveis. Ligue o RF por cinco minutos e registre a curva de temperatura resultante.

Se a temperatura da superfície da pele subir acima de 42 graus Celsius, interrompa o tratamento imediatamente após a exposição à RF. Deixe os ratos se recuperarem em uma câmara quente até que estejam conscientes. Repita os tratamentos duas vezes por semana durante três semanas.

Em seguida, eutanasiar os camundongos 48 horas após a exposição final à RF e processar os tumores. O aquecimento por RF das nanopartículas de ouro purificadas foi determinado pela diferença de horas entre elas e a solução tampão de água deionizada de fundo. Os resultados foram os esperados para nanopartículas de cinco nanômetros e 10 nanômetros.

As nanopartículas de ouro purificadas integradas ao carcinoma hepatocelular humano derivaram células B Hep três. Quando essas células são expostas a um campo de RF, elas geralmente se tornam menos viáveis do que aquelas expostas a RF sem nanopartículas internalizadas. A Figura três mostra um cenário idealizado em que as nanopartículas de ouro usadas têm toxicidade limitada por si mesmas, mas excelentes propriedades citotóxicas iniciadas por RF consulte a literatura para uma revisão abrangente dos resultados in vitro até o momento usando vários tipos de nanomateriais.

Hep três B. Células cancerígenas do fígado foram usadas para gerar tumores nas costas de camundongos nus babsi. Esses tumores foram injetados com nanopartículas de ouro suspensas por PBS, seguidas de exposição à RF. A análise pós-tratamento de Thomas revelou que o tratamento controlou o crescimento do tumor e diminuiu a massa tumoral.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar nanopartículas para uso em hipotermia mediada por RF, determinando suas propriedades responsivas a RF e solução in vitro e in vivo. Não se esqueça de que trabalhar com campos elétricos de RF de alta potência pode ser extremamente perigoso. Nunca toque ou alcance dentro de um campo elétrico ativo.

Faça medições do campo elétrico e, se necessário, use uma blindagem adequada, como uma gaiola de Faraday. Em geral, sempre minimize sua exposição a campos elétricos sustentados de alta resistência.