Melhoria da preparação e preservação de fatias do hipocampo de camundongos para uma gravação muito estável e reprodutível de potenciação de longa duração

Este trabalho apresenta uma metodologia completa para se preparar e preservar

O objetivo geral deste procedimento é ser capaz de registrar potenciação de longo prazo muito estável e reprodutível em cortes agudos do hipocampo. Isso é feito primeiro extraindo o cérebro do camundongo e dissecando o hipocampo em LCR A frio ao microscópio. O segundo passo é cortar fatias transversais do hipocampo com um picador de tecido.

Em seguida, o corte é colocado na câmara de registro da interface, que será perfundida com líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado. A etapa final é colocar os eletrodos e registrar a atividade sináptica na região CA um do hipocampo. Em última análise, um protocolo de estimulação de alta frequência é usado para mostrar a indução de uma potenciação de longo prazo muito estável.

Através deste método pode fornecer informações sobre o mecanismo subjacente à plasticidade sináptica. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como modelos animais do sistema neurodegenerativo ou nervoso, ou a doenças imunológicas. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque todas as manipulações precisam de grande habilidade e muita prática.

Inicie este procedimento enxaguando o circuito de perfusão com água destilada por no mínimo 20 minutos. Em seguida, ligue os sistemas de aquecimento. Comece o carbogênio borbulhando no circuito.

O carbogênio é entregue ao banho-maria abaixo da câmara de registro por meio de difusores de ar. Em seguida, controle a vazão no banho-maria por um medidor de vazão Depois, drene o circuito e encha-o com uma torneira filtrada de A CSF para remover as bolhas. Em seguida, coloque o anel, que sustentará a fatia na câmara de retenção.

Remova cuidadosamente todas as bolhas de ar do circuito. Em seguida, ajuste o nível de A CSF na câmara de registro com o parafuso da agulha de sucção, a velocidade da bomba de entrada é ajustada para um mililitro por minuto e a bomba de saída é ajustada para cinco mililitros por minuto. Antes da dissecção, prepare todos os instrumentos cirúrgicos.

Para remover o cérebro de um rato sacrificado. Segure a cabeça com o dedo indicador e o polegar e faça uma incisão com a tesoura de dissecação ao longo do meio do topo da cabeça, começando na borda da guilhotina, corte e corra até o osso frontal. Em seguida, corte o músculo cutâneo de cada lado da cabeça para expor totalmente as placas do crânio.

Em seguida, remova os músculos do lado do mimo da cabeça. Em seguida, corte o músculo temporal de cada lado ao longo da placa temporal. Em seguida, corte as placas frontais no meio transversalmente.

Agora faça um pequeno corte no osso occipital entre as duas placas. Corte na base do mimo das placas occipitais de cada lado. Em seguida, com a tesoura de mola, corte ao longo da sutura sagital.

Finalmente, remova o crânio afastando as metades uma da outra com uma pinça. Agora, com o bisturi cortado pouco antes do cerebelo e logo após o bulbo olfatório, transversalmente e transfira o cérebro extraído para a placa de dissecação com A CSF frio. Uma vez que o cérebro é emergido na placa de dissecação, separe os dois hemisférios um do outro com um bisturi inserido no meio sob um microscópio cirúrgico binocular, espalhe cuidadosamente a estrutura de um hemisfério para revelar o ventrículo lateral.

Remova o tronco cerebral e o céfalo colocando uma espátula no córtex frontal e a outra espátula no céfalo. Tenha cuidado para não tocar no hipocampo com a espátula e não esticá-lo durante a secção do tecido. Depois disso, corte o fórnix.

Em seguida, empurre suavemente o hipocampo para fora do córtex, inserindo uma espátula no ventrículo. Quando o hipocampo for extraído, remova o excesso de tecido cortical e os vasos sanguíneos restantes com uma pipeta de pastagem de plástico de boca larga. Transfira o hipocampo em uma colher com a superfície alvi para cima até a plataforma do picador.

Remova o excesso de líquido da colher com uma pipeta de pastagem de plástico padrão. Depois disso, incline a colher verticalmente e quase tocando o papel de filtro no picador. Solte o hipocampo tocando rapidamente no papel de filtro.

Em seguida, retire a colher. Em seguida, oriente o hipocampo e corte-o. Transversalmente a 400 mícrons com o helicóptero.

Execute o procedimento o mais rápido possível. Em seguida, retire o papel de filtro com as fatias do hipocampo e enrole-o ao redor do cilindro metálico para espalhar um pouco as fatias. Em seguida, libere as fatias com sprays de A CSF usando uma pipeta pastoral de plástico padrão e colete-as em uma placa de Petri cheia de frio.

Um CSF. Transfira a fatia selecionada para a câmara de registro com uma pipeta de plástico padrão. Permita que a fatia se recupere do trauma de dissecção na câmara de interface de gravação a 28 graus Celsius.

Se a fatia afundar, abaixe o nível de A CSF para o nível de fatia, aumente o nível de A CSF novamente para fazer a fatia flutuar. Em seguida, oriente o corte para a posição que facilitaria o posicionamento dos eletrodos na região CA um. Pare de diminuir o nível de A CSF quando ele estiver na interface.

O menisco da média ao redor da fatia é indicativo de um nível suficiente de A CSF. A malha deve estar saturada com meios, mas não completamente submersa. Em seguida, mantenha a câmara coberta com papéis de filtro sobre a tampa perfurada.

Deixe a fatia descansar por pelo menos uma hora e 30 minutos a 28 graus Celsius antes de gravar. Aqui está um esboço que mostra duas entradas sinápticas independentes como uma e S dois para a mesma população neuronal. A via S uma foi usada para induzir LTP, enquanto a via S duas atuou como controle.

Estes são os traços F-E-P-S-P da amostra registrados imediatamente antes da indução LTP, conforme indicado pelos traços vermelhos e uma hora após a indução LDP indicada pelos traços azuis. Aqui estão os F EPSPs de uma fatia perfeitamente saudável, e aqui estão os F EPSPs de uma fatia que apresenta um alto nível de excitabilidade quando as fatias não estão perfeitamente saudáveis. Respostas sinápticas de polis são observadas e a potenciação da inclinação F-E-P-S-P é reduzida.

Aqui está uma comparação dos cursos de tempo da inclinação F-E-P-S-P após LTP induzida por um único trem de estimulação de alta frequência registrado em 2005, 2010 e 2011 em nosso laboratório. Os primeiros experimentos foram registrados em 2005, indicados por círculos preenchidos. Os registros subsequentes indicados por quadrados preenchidos se beneficiaram de um procedimento de dissecção aprimorado.

Os resultados atuais surgem da otimização da oxigenação da interface e do controle de temperatura, juntamente com a padronização do eletrodo, conforme indicado por círculos abertos. Aqui mostramos que o aumento da taxa de fluxo de oxigênio no banho-maria abaixo da câmara de registro de 0,15 para 0,25 litros por minuto, conforme indicado pela curva azul, induz uma diminuição na inclinação do F-E-P-S-P em 20%, aumentando a temperatura de 28 para 29 graus Celsius. Conforme indicado, a curva verde induz um aumento de mais de 50% na inclinação do F-E-P-S-P.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que cada etapa é crucial e erros no protocolo podem levar a resultados diferentes. Depois de assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como obter uma potenciação de longo prazo muito estável. Registro em cortes agudos do hipocampo.