Name: Melhoria da preparação e preservação de fatias do hipocampo de camundongos para uma gravação muito estável e reprodutível de potenciação de longa duração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a preparar fatias agudas do hipocampo de camundongos para gravações estáveis de potenciação de longa duração por mais de 8 horas. Este protocolo confiável de eletrofisiologia apresenta taxa de sucesso de 95%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos Bernard Foucart para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Belga para a Investigação Científica (FRS-FNRS) e pelo Fundo Rainha Elisabeth de Pesquisa Médica. Agnès Villers é pesquisador do Fundo Belga para a Investigação Científica.

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o National Institutes of regulamentos de saúde para o cuidado e uso de animais em pesquisa e com o consentimento do comitê de ética local. 1. Preparação de Artificial líquido cefalorraquidiano Os mesmos meios de comunicação é utilizado para dissecar, cortar e perfundir fatias (1 ml / min) durante o período de repouso e as gravações eletrofisiológicas. Este meio é composto por NaCl 124 mM, KCl 4,4 mM, NaHCO 3 26, 1 mM de NaH 2 PO 4, 2,5 mM CaCl2, 1,3 mM de MgSO4 e 10 mM de D-glucose. <ol><li> Pesar os componentes diferentes para 2 L de MgSO4 ACSF excepto que já se encontra em solução (1 M). Usando uma solução padrão permite ter a certeza da exata concentração de Mg 2 + porque MgSO4 em pó é altamente higroscópico. Ca 2 + e Mg 2 + rácio influencia grandemente a indução e manutenção da LTP14 e, assim, as proporções devem ser sempre respeitados. </li><li> Coloque todos os componentes, exceto CaCl2 num cilindro de vidro graduado e trazer a 2 L com H2O destilada </li><li> Mexa vigorosamente. Quando tudo está dissolvido, adiciona carbogénio através de um borbulhador de aquário e tubo ligado ao tanque (95% O2, 5% de CO 2). Espere alguns minutos e adicionar cloreto de cálcio, quando o pH é fixado em 7,4 por acção de tampão de bicarbonato. </li><li> Manter a 600 ml num prato de vidro rectangular refrigerado e arrefecer a 4 ° C com gelo em volta do prato. Este meio será utilizada para dissecação do hipocampo. </li><li> Filtre os restantes 1.400 ml e manter-se em um erlenmeyer. </li></ol> 2. Preparação do Rig eletrofisiológica ea Slice câmara de gravação Cérebro O circuito de perfusão é feita de duas bombas peristálticas, um bombeamento de fluidos frescos de um tanque de reserva e outro de bombeamento de fluido usado de tele gravar câmara a um bin. Fluido fresco é adicionada a um sistema de perfusão caseira, onde é re-oxigenada e aquecida antes de atingir a câmara de registo de interface, por gravidade (Figura 1A). A câmara de gravação interface foi projetada pelo FST (Belas Tools Ciência, em Vancouver, Canadá, Figura 1B). Fatias de tecido são colocados em rede tecida filtro ligado a um anel bem removível e pode ser mantida continuamente sob condições de interface, ajustando a altura da agulha de aspiração bem. Um tubo de plástico caseira bloqueado na sua extremidade e perfuradas lateralmente (0.5 mm) é fixada à agulha de sucção para aumentar a estabilidade do nível da câmara. A cabeça de gravação é montada sobre um banho de água contendo uma pedra de dispersão de gás que ajuda a manter um ambiente húmido passando o ar húmido através de portas de deflexão da cabeça de gravação (para diminuir a formação de gotículas de água). Banho e temperatura do meio é controlado por variação contínua do nível de corrente DC tháspero um silicone de borracha incorporado elemento de aquecimento em banho-maria. Termistores em banho de água e poços de gravação permitir que a temperatura da câmara para ser fixado e precisamente controlada nestes locais. O sistema de aquecimento da câmara é completado por um sistema de aquecimento global, controlando a temperatura de toda a plataforma. O software desenvolvido por pesquisadores da University of Edinburgh ( <a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a> ) monitora e equilibra a temperatura do ar oxigenado, a fatia do cérebro, os eletrodos eo equipamento restante proporcionando um ambiente estável para gravações de longa duração (Figura 1C) . A temperatura utilizada para fatias de hipocampo de ratos é de 28 ° C. <ol><li> Lavar todo o circuito de perfusão com H 2 O destilada por um período mínimo de 20 min e iniciar os sistemas de aquecimento. </li><li> Iniciar o borbulhamento carbogénio no circuito. Carbogen chega nas home-made tubos de perfusão através de fvelas ILTER e no banho de água abaixo da câmara de gravação. O caudal do banho de água é controlada por um medidor de fluxo. Se o caudal for demasiado lento, o tecido pode tornar-se hipóxico. Por outro lado, se o caudal for demasiado elevado, o gás pode não ser suficientemente aquecido e hidratada levando a secagem do tecido. Taxa de fluxo de gás de alta poderia também aumentar a possibilidade de a pulverização de água sobre o tecido a partir do banho de água abaixo levando ao choque osmótico. Isto pode ser evitado pela adição de pedaços de rede de nylon (100 um) na saída das portas de deflexão. </li><li> Escorra o circuito e encher com ACSF filtrada. </li><li> Coloque o anel que irá apoiar a fatia na câmara de retenção. Um filtro de rede tecida com aberturas de malha de 500 a 750 um é esticado e ligado ao anel com resina de duas partes de cola epóxi. O filtro de rede de tecido é feito de 87% de poliamida e 13% elastano (calça 15 den). Cola deve ser aplicado com cuidado para evitar a formação de relevos na superfície da ring. </li><li> Remova cuidadosamente todas as bolhas de ar do circuito. </li><li> Ajustar o nível de ACSF na câmara de registo com o parafuso da agulha de aspiração. A velocidade das bombas peristálticas é ajustado para 1 ml / min para a entrada da bomba e a 5 ml / min, para a saída da bomba. </li></ol> O sistema de perfusão é colocado sobre uma mesa de vibração rígida resistente e rodeado por uma gaiola de Faraday. 3. Preparação da área de dissecção Instrumentos cirúrgicos: um bisturi com lâmina n º 11, tesoura pequena padrão de dissecação, tesouras, pinças de mola curvas, duas Heidemann espátulas e uma colher. Material suplementar: uma guilhotina, um resguardo, um triturador de tecido Mcllwain, com uma lâmina de barbear, papel de filtro, uma pipeta de Pasteur de vidro com uma tetina de borracha, duas pipetas de Pasteur de plástico uma das quais com uma boca larga, uma placa de Petri, um cilindro metálico 7 mm de diâmetro (Figura 2A). <ol><li&gt; no prato de dissecação enchido com ACSF gelado (preparada no Passo 1), mergulhar uma tampa de vidro refrigerado a partir de uma placa de coloração, embrulhado em papel de filtro. Cuidadosamente remover bolhas de ar e oxigenar a ACSF através de um borbulhador de aquário (Figura 2A). </li><li> Lay out instrumentos em ordem de uso. Adicionar três camadas de papel de filtro na placa de triturador de tecido e uma lâmina nova lavados com água destilada e com éter (Figura 2B). A lâmina deve ser horizontal quando toca o papel. Força da lâmina é ajustada a metade do valor da velocidade máxima e a cerca de um terço do valor máximo. </li><li> Atentamente verificar se tudo está pronto (instrumentos, temperatura ...), porque você não vai ter tempo depois. </li><li> Peça a alguém para pulverizar a dissecção com uma pipeta Pasteur preenchido com ACSF frio. </li><li> Anestesiar o rato com IP Nembutal (100 mg / kg) antes de decapitação. Anestesia halotano também podem ser usadas. Comparamos os dois métodos e obtainada mesmos resultados. Decapitação deve ser realizada sob anestesia mas deslocamento cervical também podem ser utilizados. No entanto deslocamento cervical precisa de uma boa prática para evitar o sofrimento do animal. </li><li> Dissecar no resguardo tão rapidamente quanto possível, sob frio ACSF contínuo banho. </li></ol> 4. Remoção cérebro <ol><li> Enquanto ainda segurando a cabeça com o dedo indicador eo polegar de uma das mãos sobre a boca, fazer uma incisão com a tesoura de dissecção ao longo do meio do topo da cabeça começando na borda do corte guilhotina e funcionando rostralmente até o osso frontal . </li><li> Cortar o músculo cutâneo em cada lado da cabeça para expor totalmente as placas do crânio e remover os músculos na parte lateral da cabeça do caudal. </li><li> Com as tesouras de dissecação, cortados do músculo temporal de cada lado, ao longo da placa temporal, depois cortar as placas frontais no meio, transversalmente. Em seguida, fazer um pequeno corte no osso occipital, entre os dois plates. </li><li> Para cada um dos lados, cortadas na base caudal das placas occipitais. </li><li> Corte ao longo da sutura sagital com uma tesoura de mola. </li><li> Com uma pinça, retire as metades do crânio, espalhando-los longe um do outro. </li><li> Com o bisturi, cortar transversalmente logo após o bulbo olfatório e pouco antes do cerebelo, em seguida, mergulhar o cérebro extraído no prato de dissecação com ACSF frio. </li></ol> 5. Dissecção do hipocampo <ol><li> Uma vez que o cérebro está imersa no prato de dissecação, separar os dois hemisférios do outro com um bisturi inserido no meio. </li><li> A dissecção do hipocampo é realizada com espátulas sob controle visual por meio de um microscópio cirúrgico binocular (X25, Figura 2A). Em um hemisfério, cuidadosamente espalhar as estruturas para ver o ventrículo lateral. Remover o tronco cerebral e diencéfalo. Isto é feito pela aplicação da espátulas no córtex frontal de um lado e do diencéfalo naoutro lado. Tome cuidado para não tocar no hipocampo com o espátulas e não esticá-lo durante o corte do tecido. </li><li> Sever do fornix então empurre o hipocampo fora do córtex (rolar), através da inserção de uma espátula no ventrículo. </li><li> Quando o hipocampo é extraído, remover o excesso de tecido cortical e restantes vasos sanguíneos. </li></ol> 6. Corte das fatias <ol><li> Com um plástico de boca larga pipeta Pasteur, transferir o hipocampo em uma colher com seus Alvear para cima da superfície (lado convexo). </li><li> Remover o excesso de fluido com uma pipeta de Pasteur de plástico normal. </li><li> Dica a colher verticalmente quase tocando o papel de filtro do helicóptero (Figura 2B) e cair fora do hipocampo da colher, tocando rapidamente o papel de filtro, em seguida, voltar a colher. </li><li> Orientar o hipocampo e corta transversalmente a 400 m com o helicóptero (ver Figura 2C para orientação do hipocampopus em relação à lâmina de barbear). Aja tão rapidamente quanto possível. </li><li> Retire o papel de filtro com o hipocampo fatias e envolvê-la em torno do cilindro metálico para espalhar as fatias um pouco. Então, sem as fatias com sprays de ACSF usando um padrão de plástico pipeta Pasteur e coletá-los em uma placa de Petri cheia de ACSF frio. </li></ol> 7. Incubação de fatias em interface <ol><li> Seleccione fatias com uma pipeta de Pasteur de plástico padrão e colocá-los rapidamente na câmara de gravação. Fatias recuperar do trauma dissecção directamente na câmara de gravação, em relação a 28 ° C. </li><li> A fatia será mais provável pia. Diminuir o nível de fluido para atingir o nível fatia, e, em seguida, aumentá-lo para fazê-lo flutuar. </li><li> Vire a fatia na posição correta, baixando o nível. As fatias são sempre orientada da mesma forma a facilitar o posicionamento dos eléctrodos (2 estimulante e um eléctrodos de registo), na região CA1. </li><li> Pare quandoo fluido está na interface. Um &quot;menisco&quot; dos meios de comunicação em torno da fatia é indicativo de um nível suficiente de meios de comunicação. O filtro de rede deve ser saturado com a mídia, mas não completamente submerso. </li><li> Manter a câmara coberta com papel de filtro colocado sobre a tampa perfurada. </li><li> Deixe o resto fatia de pelo menos 1,5 horas a 28 ° C. </li></ol> 8. Gravação de respostas sinápticas <ol><li> Gravação de eletrodo: capilares de vidro são puxados para obter uma resistência de ponta de 2-5 mohms quando preenchidos com ACSF. Um pequeno pedaço de papel de filtro é colocado em torno da ponta do eléctrodo e cera óssea é aplicada na extremidade para reduzir a condensação. Eletrodos estimulantes: eletrodos bipolares de cluster de platina-irídio, com um diâmetro de 12,5 m são comprados de FHC (EUA). Com os devidos cuidados, cada eletrodo pode ser usado pelo menos 30 vezes (Figura 1B). </li><li> Posicione os eletrodos na radiatum estrato da região CA1, todos os eletrodos alinhadoscima (Figura 3A). Os eléctrodos são reduzidos 75-150 mM sob a superfície da fatia com micromanipuladores Narishige. Os dois eletrodos estimulantes são colocadas para estimular a dois pacotes distintos de Schaffer garantias. Quando os eletrodos são rebaixados para a fatia, papéis de filtro são cuidadosamente colocados ao redor para fechar a câmara. </li><li> Estimulação bifásica (0,08 ms de duração de pulso por meio de ondas) é realizada em tensão constante com um estimulador de grama ligado a unidades de isolamento SIU-V. Resposta máxima é verificada, aumentando a intensidade do estímulo de 2 V a 12 V. máximo EPSP de campo são amplificados 1000 vezes com um WPI ISO-amplificador 80 e filtrada em 10 Hz e 10 kHz. O sinal é então enviada para um PC através de uma National Instrument conversor A / D. Estimulação, aquisição e análise de dados são realizadas utilizando o programa WinLTP ( <a href="http://www.winltp.com">www.winltp.com</a> ). EPSP de campo são registados a 40% da amplitude máxima obtida numa entrada Saídacolocar curva. Para cada fatia, as encostas fEPSP são normalizados contra a inclinação média do min 30 precedendo indução da LTP. </li><li> A LTP é desencadeada pela aplicação de um único trem de estimulação (100 Hz) para testar a força de uma via enquanto o segundo percurso serve como controlo. </li></ol> 9. A limpeza do Setup <ol><li> Lavar todo o circuito, com uma solução a 3% de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) durante pelo menos 10 min, depois drenar. O circuito terá de ser cuidadosamente lavado com água destilada antes de começar cada experiência. O uso de H 2 O 2, não é absolutamente necessário que outros laboratórios utilizam apenas água destilada para a limpeza, mas notamos a deposição de resíduos escuras no sistema tubagem quando se utiliza apenas água. </li><li> Substituir a água em banho-maria sob a câmara de gravação. </li><li> Banheira as dicas eletrodos estimulantes no álcool por 5 min. </li></ol>

<ol><li>Bliss, T. V., Lomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+potentiation+of+synaptic+transmission+in+the+dentate+area+of+the+anaesthetized+rabbit+following+stimulation+of+the+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path.</a> J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).</li>
<li>Douglas, R. M., Goddard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+of+the+perforant+path-granule+cell+synapse+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus.</a> Brain Res. 86, 205-215 (1975).</li>
<li>Squire, L., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSquire%2C+L+%22Memory%3A+From+mind+to+molecules%22">Memory: From mind to molecules</a>. , WH Freeman & Company. New York, New York, USA. (1999).</li>
<li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).</li>
<li>Frey, U., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging and long-term potentiation.</a> Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).</li>
<li>Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+protein+kinase+C+in+a+form+of+metaplasticity+that+regulates+the+induction+of+long-term+potentiation+at+CA1+synapses+of+the+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus.</a> Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).</li>
<li>Migues, P. V., Hardt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKMzeta+maintains+memories+by+regulating+GluR2-dependent+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking.</a> Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).</li>
<li>Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -C., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusional+trapping+of+GluR1+AMPA+receptors+by+input-specific+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity.</a> Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).</li>
<li>Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+maintenance+of+late-phase+long-term+potentiation+in+isolated+dendrites+of+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones.</a> J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).</li>
<li>Fonseca, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+actin+dynamics+are+required+for+the+maintenance+of+long-term+plasticity+and+for+synaptic+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture.</a> Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).</li>
<li>Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging+and+capture%3A+differential+role+of+distinct+calcium%2Fcalmodulin+kinases+in+protein+synthesis-dependent+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation.</a> J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).</li>
<li>Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis-dependent+long-term+functional+plasticity%3A+methods+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).</li>
<li>Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+beta-adrenergic+receptors+facilitates+heterosynaptic+translation-dependent+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation.</a> J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).</li>
<li>Villers, A., Godaux, E., Ris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+LTP+requires+neither+repeated+trains+for+its+induction+nor+protein+synthesis+for+its+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development.</a> PLoS One. 7 (7), e40823(2012).</li>
<li>Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+characteristics+of+LTP+induced+in+hippocampal+slices+are+dependent+on+slice-recovery+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions.</a> Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).</li>
<li>Villers, A., Godaux, E., Ris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+phase+of+L-LTP+elicited+in+isolated+CA1+dendrites+cannot+be+transferred+by+synaptic+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture.</a> Neuroreport. 21, 210-215 (2010).</li>
<li>Nguyen, P. V., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+theta-burst+stimulation+induces+a+transcription-dependent+late+phase+of+LTP+requiring+cAMP+in+area+CA1+of+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus.</a> Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).</li>
<li>Dewachter, I., Ris, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+plasticity+and+Tau+phosphorylation+by+wild-type+and+mutant+presenilin1%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1.</a> Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).</li>
<li>Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+NMDA-receptor+function+and+down-stream+signaling+in+APP%5BV717I%5D+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice.</a> Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Acute+Hippocampal+Slices+from+Rats+and+Transgenic+Mice+for+the+Study+of+Synaptic+Alterations+during+Aging+and+Amyloid+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology.</a> J. Vis. Exp. (49), e2330(2011).</li>
<li>Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slices+have+more+synapses+than+perfusion-fixed+hippocampus+from+both+young+and+mature+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats.</a> J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).</li>
<li>Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warmer+preparation+of+hippocampal+slices+prevents+synapse+proliferation+that+might+obscure+LTP-related+structural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity.</a> Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).</li>
<li>Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., et al. Appendix: Brain slice methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlger%2C+BE+%22Brain+Slices%22">Brain Slices</a>. Dingledine, R. , Plenum. New York. 381-437 (1984).</li>
<li>Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+variations+in+hippocampal+slice+preparation+protocol+on+the+electrophysiological+stability%2C+epileptogenicity+and+graded+hypoxia+responses+of+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons.</a> Brain Res. 775, 134-143 (1997).</li>
<li>Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisomycin%2C+an+inhibitor+of+protein+synthesis%2C+blocks+late+phases+of+LTP+phenomena+in+the+hippocampal+CA1+region+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro.</a> Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialogue+between+genes+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li>
<li>Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+determines+the+protein+synthesis+dependence+of+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation.</a> Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).</li>
<li>Rudy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+a+baby+in+the+bathwater%3F+Maybe%3A+some+methodological+issues+for+the+de+novo+protein+synthesis+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).</li>
<li>Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosilence%3A+Profound+Suppression+of+Neural+Activity+following+Intracerebral+Administration+of+the+Protein+Synthesis+Inhibitor+Anisomycin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin.</a> J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).</li>
<li>Volianskis, A., Jensen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+sustained+types+of+long-term+potentiation+in+the+CA1+area+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus.</a> J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).</li>
<li>Ris, L., Villers, A., Godaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+capture-mediated+long-lasting+long-term+potentiation+is+strongly+dependent+on+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation.</a> Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).</li>
<li>Abbas, A. -K., Dozmorov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+LTP+without+triggered+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Persistent LTP without triggered protein synthesis.</a> Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).</li>
<li>Ho, O. H., Delgado, J. Y., O'Dell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+proteins+involved+in+activity-dependent+forms+of+synaptic+plasticity+is+altered+in+hippocampal+slices+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro.</a> J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).</li>
<li>Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stability+of+hippocampal+slice+preparations+during+prolonged+incubation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation.</a> J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).</li>
<li>Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+protein+synthesis+in+incubated+slices+of+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain.</a> Brain Res. 99, 303-318 (1975).</li>
<li>Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+molecular+changes+following+hippocampal+slice+preparation%3A+loss+of+AMPA+receptor+subunits+and+uncoupled+mRNA%2Fprotein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression.</a> J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).</li>
<li>Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+CA3-CA1+synapse+in+the+acquisition+of+associative+learning+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice.</a> J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).</li>
<li>Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+induces+long-term+potentiation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Learning induces long-term potentiation in the hippocampus.</a> Science. 313, 1093-1097 (2006).</li>
<li>Grant, S. G. N., Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+learning%5BTitle%5D)+AND+%22TINS%22%5BJournal%5D)">Targeting learning.</a> TINS. 17 (2), 71-75 (1994).</li>
<li>Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separate+mechanisms+for+short-+and+long-term+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Separate mechanisms for short- and long-term memory.</a> Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).</li>
<li>Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+long-term+memory+and+synaptic+plasticity+despite+short-term+impairments+in+the+Tc1+mouse+model+of+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome.</a> Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).</li>
<li>Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+Slice+Protein+Degradation+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Brain Slice Protein Degradation and Development.</a> J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).</li>
<li>Izquierdo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+and+the+mechanisms+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation and the mechanisms of memory.</a> Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Temos desenvolvido no nosso laboratório um protocolo que resulta da combinação de métodos desenvolvidos e utilizados por outros laboratórios têm uma grande experiência na LTP gravações 11,17. Este protocolo é adaptado para hipocampo do rato adulto e pode ser usado em animais de qualquer idade e qualquer genótipo de fundo. Ele também permite a análise da LTP em camundongos transgênicos desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer 18,19. A uti...

Hoje em dia, há uma compreensão limitada de como as memórias complexas são armazenados e recuperados no nível do circuito neuronal. No entanto, uma hipótese unificadora de armazenamento de memória disponível e largamente aceites: memórias são armazenadas como variações na força das conexões sinápticas entre neurónios no sistema nervoso central. Por si só, a pesquisa sobre a plasticidade sináptica foi amplamente beneficiado com duas descobertas revolucionárias. (1) Num experimento seminal, Bliss e Lomo 1, utilizando o coelho anestesiado intacto, descobriram que a entrega de uma breve alta frequência (1 s, 100 Hz), a estimulação do caminho perfurante do hipocampo causada uma longa duração (vários horas) aumento das conexões sinápticas relacionadas. Este fenômeno fascinante foi chamado de &quot;potencialização de longo prazo&quot;, ou PLP por Douglas e Goddard, em 1975 2. (2) Mais tarde, verificou-se que um fenómeno semelhante poderá ser desencadeada em fatias de cérebro (0,4 mm), mantido artificialmente vivo, in vitro </em&gt;. A LTP mais amplamente estudados foi observado in vitro, fornecendo um ou vários tetani a um feixe de axónios (os chamados colaterais de Schaffer) durante a gravação do campo resultante sináptica excitatória potencial evocado nos neurónios piramidais da região CA1 chamada. Os mecanismos de indução da LTP têm sido amplamente revelados. Basicamente, um influxo de Ca2 + através dos receptores NMDA activa enzimas com duas consequências: a fosforilação de receptores AMPA (o que aumenta a sua eficiência) e uma incorporação de receptores de AMPA extra na membrana pós-sináptica 3. Por outro lado, os mecanismos da fase de manutenção da LTP são em grande parte desconhecida, nomeadamente porque é experimentalmente muito mais difícil manter uma fatia saudável durante muitas horas de 30 a 60 min. Muitos estudos têm sido dedicados à compreensão dos mecanismos de LTP e teorias interessantes foram elaborados ao longo dos anos 4-11. Mas unaté agora, os mecanismos moleculares exactos subjacentes ao aumento estável na força sináptica não foram elucidados. Isto pode ser parcialmente devido à dificuldade para reproduzir os resultados obtidos em laboratórios diferentes, utilizando diferentes técnicas para a preparação e para a manutenção de fatias do hipocampo. Em seu papel metodologia, Sajikumar et al. 12 ressaltou a importância das condições experimentais para a preparação de fatias de hipocampo de ratos e ao registo das LTP estável. Neste vídeo, apresentamos todas as etapas de otimização desenvolvidos em nosso laboratório ao longo dos anos para poder gravar um LTP muito estável em fatias de hipocampo de ratos. Essa otimização foi feita a partir de protocolos desenvolvidos e utilizados com sucesso por outros laboratórios que estudam mecanismos de LTP em camundongos e ratos 13 11. Ele permite que os investigadores experientes para induzir e gravar uma LTP duradoura por muito tempo em ratos adultos com uma alta taxa de sucesso. O pbase hysiological da LTP induzida foi cuidadosamente verificada e demonstrada 14. Neste trabalho a metodologia, vamos mostrar que qualquer modificação das condições experimentais, como a temperatura ou a oxigenação pode ter um impacto profundo sobre a manutenção LTP enquanto o procedimento de dissecção pode modificar profundamente fatias excitabilidade. Também deve ser enfatizado que o controle preciso de todos estes parâmetros requer um treinamento de vários meses para os alunos novatos.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 </td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 1M</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>63126</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide (Bélgica)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capilares</td><td>WPI, Inc. (Reino Unido)</td><td>TW150-4</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos Estimulantes</td><td>FHC (EUA)</td><td>CE2B30</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas cirúrgicas</td><td>FST (Alemanha)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro 84 g/m2</td><td>Sartorius</td><td>FT-3-105-110</td><td></td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Lycra</td><td>15 den</td><td></td></tr><tr><td>Glue</td><td>UHU</td><td>plus endfest300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instrument</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>WPI, Inc. (Reino Unido)</td><td>ISO-80</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de gravação de interface</td><td>FST (Alemanha)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bombas peristálticas</td><td>Gilson (EUA)</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Universidade de Edimburgo</td><td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Helicóptero de tecidos</td><td>Mcllwain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estimuladores</td><td>Grass (USA)</td><td>S88X + SIU-V</td><td></td></tr><tr><td>Análise do programa</td><td>WinLTP</td><td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipuladores</td><td>Narishige</td><td>MM-3 e MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio cirúrgico</td><td>Leica Microsystem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>conversor A/D</td><td>National Instruments</td><td>NIPCI-6229 Série</td><td></td> M</tr></tbody></table>

melhoria da preparação e preservação de fatias do hipocampo de camundongos para uma gravação muito estável e reprodutível de potenciação de longa duração

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

A potenciação de longa duração (LTP), um tipo de plasticidade sináptica, caracterizada por um aumento na força sináptica e acredita estar envolvida na codificação da memória. LTP provocada na região CA1 do hipocampo fatias agudas tem sido extensivamente estudada. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a fase de manutenção deste fenômeno ainda são pouco compreendidos. Isto pode ser em parte devido às várias condições experimentais utilizadas por laboratórios diferentes. Com efeito, a fase de manutenção da LTP é fortemente dependente de parâmetros externos como a oxigenação, temperatura e humidade. É também dependente dos parâmetros internos como orientação do plano de corte e de viabilidade após a dissecação fatia. A optimização de todos estes parâmetros permite a indução de potenciação de uma muito reprodutível e muito estável a longo prazo. Esta metodologia oferece a possibilidade de explorar os mecanismos moleculares envolvidos no aumento estávelna força sináptica em fatias de hipocampo. Ele também destaca a importância das condições experimentais na investigação in vitro de fenômenos neurofisiológicos.

Esta metodologia foi utilizada para analisar as propriedades de potenciação de longa duração a longo prazo induzida em fatias de hipocampo agudas a partir de ratos adultos (C57Bl/6J JANVIER SAS, França) 14. Surpreendentemente, a melhoria das condições experimentais levou a uma nova forma de olhar para a LTP. Nós mostramos que o aumento de longa duração em sináptica não exigem a síntese de novas proteínas. Aqui, vamos mostrar que a indução de LTP depende fatias de viabilidade e exc...

Este trabalho apresenta uma metodologia completa para se preparar e preservar<em&gt; In vitro</em&gt; Fatias de hipocampo agudos de ratos adultos. Este protocolo permite a gravação de potenciação de longa duração de longa duração muito estável (LTP), durante mais de 8 horas, com uma taxa de sucesso de 95%.

Melhoria da preparação e preservação de fatias do hipocampo de camundongos para uma gravação muito estável e reprodutível de potenciação de longa duração

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

O objetivo geral deste procedimento é conseguir registrar uma potenciação de longa duração muito estável e reprodutível em fatias hipocampais agudas. Isso é conseguido primeiramente removendo o cérebro do camundongo e dissecando o hipocampo em um LCR frio sob o microscópio. O segundo passo é cortar fatias hipocampais transversais com um cortador de tecidos.Em seguida, o corte é colocado na câmara de registro de interface, que será perfundida com fluido cerebroespinhal artificial oxigenado. O passo final é posicionar os eletrodos e registrar a atividade sináptica na região CA1 do hipocampo. Por fim, um protocolo de estimulação de alta frequência é utilizado para demonstrar a indução de uma potenciação de longa duração muito estável.Por meio deste método, é possível obter informações sobre o mecanismo subjacente à plasticidade sináptica. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como modelos animais de doenças neurodegenerativas ou do sistema nervoso, ou a doenças imunológicas. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois todas as manipulações exigem grande habilidade e muita prática.Inicie este procedimento lavando o circuito de perfusão com água destilada por um mínimo de 20 minutos. Em seguida, ligue os sistemas de aquecimento. Inicie a borbulhagem de carbogênio no circuito.O carbogênio é fornecido ao banho de água abaixo da câmara de gravação por meio de difusores de ar. Em seguida, controle a vazão no banho de água por um medidor de fluxo. Posteriormente, drene o circuito e preencha-o com LCR filtrado para remover as bolhas. Então, coloque o anel, que irá suportar o fragmento na câmara de espera.Remova cuidadosamente todas as bolhas de ar do circuito. Em seguida, ajuste o nível de LCR A na câmara de gravação com o parafuso da agulha de sucção; a velocidade da bomba de entrada é ajustada para um mililitro por minuto, e a da bomba de saída é ajustada para cinco mililitros por minuto. Antes da dissecção, prepare todos os instrumentos cirúrgicos.Para remover o cérebro de um camundongo sacrificado. Segure a cabeça com o indicador e o polegar, e faça uma incisão com a tesoura de dissecação ao longo da linha média do topo da cabeça, começando na borda da guilhotina, cortando até o osso frontal. Em seguida, corte o músculo cutâneo em cada lado da cabeça para expor completamente as placas do crânio.Em seguida, remova os músculos do lado occipital da cabeça. Posteriormente, corte o músculo temporal de cada lado ao longo da placa temporal. Depois, corte as placas frontais no meio, transversalmente.Agora, faça um pequeno corte no osso occipital entre as duas placas. Corte na base do códilo das placas occipitais de cada lado. Em seguida, com a tesoura de mola, corte ao longo da sutura sagital.Finalmente, remova o crânio separando as metades em sentidos opostos com uma pinça. Em seguida, com o bisturi, corte logo antes do cerebelo e logo após o bulbo olfatório, transversalmente, e então transfira o cérebro extraído para a cuba de dissecação contendo A CSF frio. Uma vez que o cérebro esteja imerso na cuba de dissecação, separe os dois hemisférios entre si com um bisturi inserido no meio, sob um microscópio cirúrgico binocular, e cuidadosamente afaste a estrutura de um dos hemisférios para expor o ventrículo lateral.Remova o tronco encefálico e o céfalo posicionando uma espátula sobre o córtex frontal e outra espátula sobre o céfalo. Tenha cuidado para não tocar o hipocampo com a espátula e para não esticá-lo durante o corte do tecido. Em seguida, corte o fórnice.Em seguida, empurre suavemente o hipocampo para fora do córtex inserindo uma espátula no ventrículo. Quando o hipocampo for extraído, remova o tecido cortical excedente e os vasos sanguíneos remanescentes com uma pipeta Pasteur de boca larga em plástico. Transfira o hipocampo em uma colher, com sua superfície alvi voltada para cima, para a plataforma do cortador.Remova o excesso de fluido da colher com uma pipeta Pasteur plástica comum. Em seguida, incline a colher verticalmente, aproximando-a quase até tocar o papel de filtro no cortador. Solte o hipocampo tocando rapidamente o papel de filtro.Em seguida, retire a colher. Depois, oriente o hipocampo e corte-o transversalmente com o cortador em fatias de 400 micrômetros.Realize o procedimento o mais rapidamente possível. Em seguida, remova o papel-filtro com os cortes hipocampais e enrole-o ao redor do cilindro metálico para espalhar um pouco os cortes. Então, solte os cortes com pulverizações de A CSF utilizando uma pipeta plástica Pasteur comum e colete-os em uma placa de Petri preenchida com líquido frio.Uma LCR. Transfira o corte selecionado para a câmara de registro com uma pipeta de plástico padrão. Permita que o corte se recupere do trauma da dissecção na câmara de interface de registro a 28 graus Celsius.Se o corte afundar abaixo do nível de LCS, eleve novamente o nível de LCS para que o corte flutue. Em seguida, posicione o corte na orientação que facilite o posicionamento dos eletrodos na região CA1. Interrompa a descida do nível de LCS quando este atingir a interface.O menisco do meio ao redor do fragmento indica um nível suficiente de LCR. A malha deve estar saturada com o meio, mas não completamente submersa. Em seguida, mantenha a câmara coberta com papéis-filtro sobre a tampa perfurada.Deixe a fatia repousar por pelo menos uma hora e trinta minutos a 28 graus Celsius antes da gravação. Abaixo há um esboço que mostra duas entradas sinápticas independentes, S um e S dois, para a mesma população neuronal. A via S um foi utilizada para induzir a PTL, enquanto a via S dois atuou como controle.Estes são os traços amostrais de F-E-P-S-P registrados logo antes da indução da PTL, indicados pelos traços vermelhos, e uma hora após a indução da PDL, indicados pelos traços azuis. Aqui estão os F-E-P-S-P de um corte perfeitamente saudável, e aqui estão os F-E-P-S-P de um corte que apresenta um alto nível de excitabilidade quando os cortes não são perfeitamente saudáveis. São observadas respostas polissinápticas, e a potenciação da inclinação do F-E-P-S-P é reduzida.Aqui está uma comparação dos cursos temporais da inclinação F-E-P-S-P após a PTL induzida por um único trem de estimulação de alta frequência, registrada em 2005, 2010 e 2011 em nosso laboratório. Os primeiros experimentos foram registrados em 2005, indicados por círculos preenchidos. Os registros subsequentes, indicados por quadrados preenchidos, se beneficiaram de um procedimento de dissecação aprimorado.Os resultados atuais decorrem da otimização da oxigenação da interface e do controle de temperatura, juntamente com a padronização dos eletrodos, conforme indicado pelos círculos abertos. Aqui demonstramos que aumentar a taxa de fluxo de oxigênio no banho de água sob a câmara de registro de 0,15 para 0,25 litros por minuto, conforme indicado pela curva azul, induz uma diminuição de 20% na inclinação do F-E-P-S-P quando a temperatura aumenta de 28 para 29 graus Celsius. Conforme indicado, a curva verde induz um aumento superior a 50% na inclinação do F-E-P-S-P.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que cada etapa é crucial e erros no protocolo podem levar a resultados diferentes. Após assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como obter uma potenciação de longa duração muito estável. Gravação em fatias hipocampais agudas.

improved-preparation-preservation-hippocampal-mouse-slices-for-very

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este artigo descreve procedimentos para preparar fatias do hipocampo de ratos e camundongos transgênicos para o estudo de alterações sinápticas do cérebro associadas ao envelhecimento e relacionadas com a idade as doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer.

Preparação de fatias do hipocampo aguda de ratos e camundongos transgênicos para o Estudo das Alterações Synaptic durante o envelhecimento e amilóide Patologia

Este artigo em vídeo descreve procedimentos experimentais para estudar a plasticidade de longo prazo e seus processos associativos, como marcação sináptica, captura e marcação cruzada nos neurônios piramidais CA1 usando fatias agudas do hipocampo de roedores.

Investigação de Synaptic Tagging / Captura e-captura Cruz usando aguda fatias do hipocampo de roedores

Este protocolo demonstra a implementação de um otimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de recuperação protetora de preparação de fatia do cérebro. Uma formulação única mídia é usada para obter confiavelmente fatias de cérebro saudável de animais de qualquer idade e para diversas aplicações experimentais.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

Este protocolo descreve a estabilização do nível de oxigênio em um pequeno volume de tampão reciclado e aspectos metodológicos da plasticidade sináptica dependente de atividade de gravação em fatias hippocampal agudas submersas.

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Utilizamos eletrodos de gravação e estimulação em fatias de cérebro hipocampal longitudinal e eletrodos de gravação e estimulação longitudinalmente posicionados no hipocampo dorsal in vivo para evocar potenciais pós-sinápticos extracelulares e demonstrar plasticidade sináptica de longo prazo ao longo do CA1 interlamelar longitudinal.

Investigando a plasticidade sináptica de longo prazo no hipocampo interlamelar CA1 por gravação de campo eletrofisiológico

O protocolo apresentado descreve o transporte e a preparação de tecido hipocampal humano ressecado com o objetivo final de usar fatias cerebrais vitais como uma ferramenta de avaliação pré-clínico para potenciais substâncias antiepilépticas.

Preparação de fatias hipocampais humanas agudas para gravações eletrofisiológicas

Este é um protocolo para preparação aguda de fatias de hipocampi de camundongos adultos e envelhecidos que se aproveita da perfusão transcárrica e corte de fatias com NMDG-aCSF gelado para reduzir danos hipóxicos ao tecido. As fatias resultantes permanecem saudáveis durante muitas horas, e são adequadas para grampos de remendo de longo prazo e gravações de campo.

Minimizando a hipóxia em fatias hipocampais de camundongos adultos e envelhecidos

Este protocolo descreve a preparação de fatias horizontais do córtex hipocampal-entorhinal (HEC) de camundongos que exibem atividade espontânea de ondulação de ondas afiadas. As fatias são incubadas em uma câmara de realização de interface simplificada e as gravações são realizadas em condições submersas com fluido cerebrospinal artificial de fluxo rápido para promover a oxigenação tecidual e o surgimento espontâneo da atividade em nível de rede.

Corte cerebral aguda do rato para investigar atividade espontânea da rede hipocampal

Este artigo tem como objetivo descrever um protocolo sistemático para obter fatias cerebrais hipocampais horizontais em camundongos. O objetivo desta metodologia é preservar a integridade das vias de fibra hipocampal, como o caminho perfurante e o trato de fibra de musgo para avaliar processos neurológicos relacionados ao giro dento.

Fatias hipocampais horizontais do cérebro do rato

Apresentamos um protocolo para preparar fatias agudas do hipocampo dorsal-intermediário de camundongos. Comparamos esta preparação transversal com o corte coronal em termos de qualidade de gravações e preservação de características morfológicas de neurônios registrados.

Preparação de fatias agudas do hipocampo dorsal para gravação de células inteiras e reconstrução neuronal no giro dentado de camundongos adultos

Aprenda a preparar fatias agudas do hipocampo de camundongos para gravações estáveis de potenciação de longa duração por mais de 8 horas. Este protocolo confiável de eletrofisiologia apresenta taxa de sucesso de 95%.

Melhoria da preparação e preservação de fatias do hipocampo de camundongos para uma gravação muito estável e reprodutível de potenciação de longa duração (Vídeo) | JoVE Journal

Melhoria da preparação e preservação de fatias do hipocampo de camundongos para uma gravação muito estável e reprodutível de potenciação de longa duração

Explorar mais vídeos