Name: Microscopia intravital da Microcirculação no músculo Rato Cremaster de Análise de Migração Stem Peripheral celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprenda a usar microscopia intravital para analisar a migração de células-tronco periféricas na microcirculação do músculo cremaster de rato. Este método permite visualizar interações celulares em tempo real.

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O protocolo de todo após o isolamento das células leva cerca de 2 horas. 1. Microsurgical Preparação <ol><li> Realizar o isolamento de células estaminais da medula óssea do dador e marcação fluorescente da subpopulação isolado de acordo com protocolos padronizados 9,12 aceitam as células repousar durante o tempo que o animal é realizada a operação. Para marcação fluorescente recomendamos CFDA (Carboxifluoresceína diacetate éster succinimidyl). </li><li> Anestesiar um rato macho pesando 20-25 g, com cetamina (75 mg / kg) e xilazina (2,5 mg / kg). Durante os procedimentos cirúrgicos e protocolos experimentais, anestesia deve ser mantida por suplementos (10% de injecção inicial, ip), conforme necessário (normalmente a cada 30-60 min). </li><li> Raspe suavemente a face anterior do escroto direito, bem como a coxa e virilha direita. Colete todos perdem o cabelo com um cotonete umedecido. Coloque o mouse lado ventral em um palco de visualização plexiglass e fixar a taxat usando cortina elástica. A fase é feito à medida, que consiste em uma placa de base e uma segunda placa da extremidade caudal da placa de base para a elevação de ambas as pernas e o escroto. Coloque a fase de uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 ° C. Após a fixação no palco, coloque o animal sob um microscópio de operação e executar as seguintes etapas da operação por meio de 10 - a ampliação de 16 vezes. </li><li> Faça a incisão inicial usando uma tesoura de pele na coxa direita, logo anterior dos vasos femorais do joelho até a virilha. </li><li> Identificar a artéria femoral e segui-lo proximamente, mobilizando a artéria de tecidos moles circundantes. Identificar e cortou um grande ramo para o testículo esquerdo usando termocautério. Posteriormente colocar uma sutura de estadia superficialmente no testículo esquerdo. Tração suave vai facilitar ainda mais a mobilização proximal da artéria femoral. </li><li> Após a conclusão da mobilização proximal, identificar e cortar um grande ramo executando medially na coxa por termocautério. A partir de então ligar a artéria femoral, na parte distal da coxa direita. Tração suave na ligadura vai ajudar ainda mais a preparação. </li><li> Rode-se agora a atenção para a artéria femoral proximal e novamente colocar uma sutura em torno da artéria como proximalmente possível. Prepare um nó, mas não amarrá-lo para baixo ainda. Aplicar tração suave para a sutura e criar um kinking arterial. </li><li> Depois de estabelecer a dobras, inciso artéria é cuidadosamente usando uma microtesoura. Tome especial cuidado para não danificar a veia femoral. </li><li> Inserir um microcateter preparado (diâmetro interno 0,28 milímetro) através da incisão. O cateter deve ser deaired (cloreto de sódio a 0,9%, NaCl) e ligado a um inserção antes seringa de 1 ml. </li><li> Após a inserção com êxito do cateter, cuidadosamente solte o enroscamento, a fim de facilitar a passagem do cateter. Fluxo arterial deve ser imediatamente visível dentro do cateter. Delicadamente, avançar o cateter alguns milímetross além do kinking anterior. A partir de então, amarrar a ligadura preparado para fixação do cateter. </li><li> Lavar cuidadosamente o cateter (0,9% NaCl) e aspirado para confirmar a posição correta. Utilizar um pedaço de fita adesiva para prender ainda mais o cateter para a fase de operação. </li><li> Após a fixação adequada, colocar o cateter de lado para as seguintes etapas de preparação do músculo cremaster. Aplicar a lavagem regular e aspiração do cateter cada 5-10 min, a fim de impedir a formação de coágulos. </li><li> Vire a atenção agora para o escroto direito e fazer uma incisão, cortando a pele e fáscia acima do aspecto ventral do escroto direito. Tome cuidado para não tocar no tecido subjacente com quaisquer instrumentos. </li><li> Estender a incisão até a dobra inguinal e caudal para a extremidade distal do escroto. </li><li> Tecidos cuidadosamente separado subjacente suave e conjuntivo acima do saco cremaster, sem tocá-lo. Identificar a extremidade distal do cremaster, e colocar uma sutura de estadia a slightly estender o músculo. Ressecar agora tecido mole remanescente sob o saco muscular, puxando suavemente o músculo caudal e anteriormente. </li><li> Após a separação completa do tecido conjuntivo, abra o saco cremaster em um ponto na borda cranial com uma tesoura. Estender a incisão desta abertura para baixo a extremidade distal do músculo. </li><li> Selar a pequena embarcação que liga o testículo eo cremaster usando termocautério, depois cortar as conexões restantes entre o músculo eo testículo com uma tesoura. </li><li> Deixe de lado o testículo, fora do campo de microscopia. </li><li> O cremaster abriu agora está na horizontal no palco. Coloque quatro 6-0 estadia prolene nas bordas do tecido e corrigi-los com caimento elástico, a fim de espalhar o tecido do músculo cremaster. De agora em diante continuamente humedecer o tecido com solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma seringa de 1 ml (Figura 1). </li><li> Permitir agora a preparação para descansar por 15 min. Posteriormente injetar0,05-0,1 ml de 1% de Rodamina-dextrano através da artéria femoral esquerda para o realce do contraste da microvasculatura. Se algum quimiocinas ou agentes inflamatórios estão previstas para aplicação, você deve agora topicamente umedecer o músculo com o respectivo reagente usando uma seringa de 1 ml. No caso de uma experiência de controlo, continuar humedecendo com PBS. </li></ol> 2. Microscopia intravital <ol><li> Manter o rato fixado na fase de operação e mover-se sob um microscópio de fluorescência modificado para epi-iluminação e ligada a uma câmara CCD (charge-coupled device) da câmara de vídeo. Tome especial cuidado para não deslocar o cateter de artéria femoral. </li><li> Realizar experimentos usando uma objetiva de imersão em água. </li><li> Depois de ajustar o objetivo de visualização suficiente da microcirculação cremaster e antes da injeção das células, estocasticamente definir seis vênulas pós-capilares, para posterior análise da aderência de células-tronco firme. </li><li> Administrar as células estaminais marcado com fluorescentes,Dissolveu-se em 200 ul de PBS, a 0,4 x 10 6 culas por injecção, com um total de cinco injecções consecutivas, utilizando o cateter da artéria femoral e uma seringa de 1 ml. Agitar a amostra de células antes da primeira injecção. </li><li> Células estaminais da ficha de rolamento imediatamente após a injecção das células, definindo, assim, &quot;rolar&quot; como uma redução de mais de 50% da velocidade da célula ao longo do revestimento endotelial em combinação com típico celular &quot;vara e solte&quot; movimentos. Realizar contagem de células-tronco rolantes e todos as células-tronco que passam a uma distância pré-definida venular durante 1 min de observação após cada injeção única. A quantidade de rolamento de células estaminais é expressa como percentagem de todas as células que passam. Não conte células exibindo fenômenos amarrar breves aleatórios como células de rolamento. </li><li> Após a última injecção de células determinar o número de células estaminais, firmemente aderentes por contagem e expressar a quantidade em relação à superfície endotelial de th calculadoe seis vênulas predefinidos (diâmetro x comprimento x π) como células aderentes / mm 2. Adesão firme é considerado quando há movimento celular é detectável por 30 seg. </li><li> Após a conclusão da microscopia intravital remova cuidadosamente o músculo cremaster e armazená-lo em correspondência para posterior análise (imunohistoquímica e biologia molecular). Sacrificar o animal por deslocamento cervical. A análise de microscopia intravital gravações para a quantificação de células estaminais de rolamento e adesão celular endotelial firmes, bem como a hemodinâmica microvasculares, tais como a velocidade do sangue de células vermelhas (mm / s), o comprimento do vaso (mm), o diâmetro dos vasos (mM), a taxa de partes de parede (seg -1); deve ser realizada off-line por um investigador cego para o respectivo tratamento do tecido experimental utilizando um software de processamento de imagem. </li></ol>

<ol><li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li>
<li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+stem+cells+find+their+way+home%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">How do stem cells find their way home?</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li>
<li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Endosc%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874(2011).</li>
<li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha%2FCXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit%2B+bone+marrow+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li>
<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB-1+induces+c-kit%2B+cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li>
<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe%3F+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li>
<li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133%28%2B%29+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li>
</ol>

Todos os experimentos com animais, realizados para este manuscrito ter sido aprovado pelo comitê de cuidados com os animais e uso local. Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

<html> Microscopia de fluorescência intravital permite a visualização direta e análise quantitativa de interações célula-tronco do endotélio. O modelo do músculo cremaster é particularmente útil, já que a exposição de microcirurgia e técnicas de visualização intravital têm sido bem estabelecidos durante a investigação sobre as interacções de leucócitos-endotélio e os vários componentes químicos podem ser selectivamente aplicado ao tecido alvo através de uma simples técnica de superfusão. Devido à ausência de artefatos de...

O objetivo do presente artigo é descrever a técnica de microscopia intravital (IVM), aplicada sobre a microcirculação cremaster rato para observação direta e análise de medula óssea migração de células-tronco periférica. Regeneração de tecidos e órgãos O conceito atual de células-tronco com base envolve o homing de medula óssea células-tronco derivadas do tecido lesado 1. Um passo crucial para a migração de células-tronco de sucesso inclui tronco interação célula com o endotélio local dentro do órgão lesionado seguido de migração transendotelial e, eventualmente, o enxerto de órgãos 2. Análise intravital destas células-tronco - as interações de células endoteliais formam um parâmetro ideal para a quantificação de uma resposta regenerativa com células-tronco com base em diferentes contextos fisiopatológicos in vivo. Além disso, parece concebível, que, no futuro, a análise intravital da capacidade migratória das células estaminais p específicoopulations dentro de ambientes microcirculação padronizadas, pode ser aplicado antes avanço dessas populações para mais testes clínicos. Microscopia intravital foi inicialmente desenvolvido para a observação e quantificação da interacção das células de leucócitos-células endoteliais in vivo, no campo da pesquisa inflamatória 3. As primeiras gravações de sucesso de estudos de microscopia intravital foram relatados por Cohnheim já no século 19, estudando línguas e mesentério de rã sob um microscópio de luz 4. Desde a sua primeira utilização IVM sofreu um desenvolvimento técnico enorme e hoje certos componentes essenciais formar os pré-requisitos para a realização de MIV quantitativa: (i) as preparações de tecidos que permitam o acesso óptico, (ii) as sondas moleculares que podem ser detectados por um microscópio, (iii ) um microscópio ligado a um sistema de detecção e (iv) a partir de sistemas de análise de computador que é capaz de extrair os parâmetros de interesse a partir dos dados de imagemset 4. Uma grande variedade de preparações de tecido tenha sido introduzida para estudos IVM incluindo os mesentério e no fígado do rato e na ratazana 5, as câmaras de dobras cutâneas dorsal de rato e hamster 6, a orelha de coelho e a bolsa jugal do hamster, para citar alguns. No entanto, a seguir vamos nos concentrar no músculo cremaster mouse, o que representa um tecido ideal para observações intravital, como são possíveis preparação e visualização por um procedimento cirúrgico bem padronizado, e em geral não ocorrem problemas de artefatos de movimento. A preparação do músculo cremaster aberto foi realizada pela primeira vez em 1970 por Baez e colegas 7. Originalmente descrito para ratos, tem sido adotado com sucesso também para o mouse 8. Após estudos anteriores haviam se concentrado principalmente nas interações leucócitos com a parede do vaso, o nosso próprio grupo introduziu recentemente a preparação do músculo cremaster mouse como um valuable ferramenta para a visualização direta e análise quantitativa de interações célula-tronco do endotélio dentro de um microambiente definida 9. Vários subpopulações de células estaminais têm sido estudada utilizando este modelo, incluindo murino células estaminais da medula óssea 133 + c-kit + de medula óssea em células estaminais e células estaminais mesenquimais, assim como humana CD 10-12. A seguir ao isolamento de células de medula óssea do dador e marcação fluorescente para visualização, as células estaminais são aplicadas selectivamente na microcirculação cremaster utilizando uma injecção arterial através da artéria femoral, evitando-se assim qualquer aprisionamento de células dentro de órgãos remotos. Além disso, o modelo do músculo cremaster é particularmente útil uma vez que várias quimiocinas potencialmente medeiam a migração de células estaminais local dentro das respectivas configurações, pode ser topicamente aplicada ao tecido alvo através de uma simples técnica de superfusão.

<table><tbody><tr><td>Diacetato de carboxifluoresceína succinimidiléster (CFDA)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina 6 G (1%)</td><td>Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha</td><td>83697</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Ketanest)</td><td>Pfizer, Berlim, Alemanha</td><td>não disponível</td><td></td></tr><tr><td>Xylacin (Rompun)</td><td>Bayer, Leverkusen, Alemanha</td><td>não disponível</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Dulbecco - solução salina tamponada (PBS)</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Alemanha</td><td>P04-36500</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia intravital da microcirculação no músculo rato cremaster de análise de migração stem peripheral celular

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Na era de protocolos de aplicação intravascular de células no contexto da terapia celular regenerativa, os mecanismos subjacentes à migração de células-tronco para nonmarrow tecido não foram completamente esclarecidas. Descrevemos aqui a técnica de microscopia intravital aplicada a microcirculação cremaster rato para a análise de medula óssea a migração de células estaminais periféricas in vivo. Microscopia intravital do cremaster M. tenha sido previamente introduzido no campo da pesquisa inflamatória por observação directa de interacção de leucócitos com o endotélio vascular. Desde tronco periférica suficiente e migração de células progenitoras inclui passos iniciais semelhantes de rolando e adesão firme ao endotélio forro é concebível aplicar o modelo cremaster M. para a observação e quantificação da interação de células-tronco administrados intravasculary com o endotélio. Como vários componentes químicos pode ser aplicada selectivamente ao alvo tquestão por meio de técnicas de superfusão simples, é possível estabelecer um requisito essencial do microambiente, para o recrutamento de células-tronco inicial para ocorrer em um organismo vivo fora da medula óssea.

Em geral, a interação de injetado diretamente as células-tronco ou progenitoras com o endotélio vascular dentro da microcirculação músculo cremaster é um evento raro e ocorre exclusivamente em vênulas pós-capilares (diâmetro: 30-80 mm). Devido à fluorescência rotulagem de rolamento e as células-tronco, firmemente aderentes pode ser quantificada claramente na separação de leucócitos circulantes endógenos nas vénulas observados (Figura 2). As condições da microcirculação repre...

Microscopia intravital do cremaster microcirculação rato M. oferece um único e bem padronizados modelo in vivo para a análise de medula óssea a migração de células estaminais periféricas.

Microscopia intravital da Microcirculação no músculo Rato Cremaster de Análise de Migração Stem Peripheral celular

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar as interações entre células-tronco e células endoteliais in vivo. Isso é realizado primeiramente introduzindo um cateter na artéria femoral de um animal sedado para acesso intra-arterial. Na segunda etapa, o músculo crural é cirurgicamente preparado para microscopia de fluorescência intravital.Em seguida, a população de células-tronco de interesse é injetada por meio de cateter na artéria femoral. Em última análise, as interações entre as células-tronco transferidas adotivamente e o endotélio da microcirculação do músculo principal podem ser visualizadas e quantificadas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de medicina regenerativa, como, por exemplo, como é regulada a migração de células-tronco aplicadas terapeuticamente dentro de um organismo vivo?Antes de iniciar a microcirurgia, prepare um cateter conectado a uma seringa de um mililitro contendo cloreto de sódio a 0,9%. Em seguida, depile suavemente a face anterior do escroto direito, bem como a coxa direita e a virilha de um camundongo macho anestesiado de 20 a 25 gramas. Recolha todos os pelos soltos com um cotonete umedecido e, então, posicione o camundongo com a face ventral voltada para cima sobre uma plataforma de visualização personalizada de plexiglass, composta por uma placa de base e uma segunda placa na borda da base para elevação das duas patas traseiras e do escroto.Após fixar as patas com um campo elástico, coloque o animal sobre uma bolsa de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 graus Celsius. Em seguida, utilizando uma ampliação de 10 a 16 vezes, use um microscópio estereoscópico e uma tesoura para fazer uma incisão inicial na coxa direita, logo anteriormente aos vasos femorais, da articulação do joelho até a virilha. Identifique a artéria femoral e siga-a em direção proximal, mobilizando a artéria do tecido mole circundante.Em seguida, utilizando cauterização térmica, identifique e corte um ramo arterial grande que leva ao testículo esquerdo. Coloque um fio de seda prolene 6-0 como ponto de fixação superficialmente no testículo esquerdo. Em seguida, identifique e cauterize termicamente o grande ramo arterial que percorre medialmente a coxa.Em seguida, usando tração suave, ligue a artéria femoral na parte distal da coxa direita e, então, coloque um ponto em torno da artéria femoral proximal o mais próximo possível do centro do animal. Agora, faça um nó solto ao redor da artéria femoral, mas não o aperte. Em seguida, aplique tração suave ao fio para criar uma angulação arterial.Após estabelecer a angulação, use um par de tesoura microcirúrgica para dimensionar cuidadosamente a artéria, tomando especial cuidado para não danificar a veia femoral. Em seguida, insira o microcateter previamente preparado na incisão. Afrouxe cuidadosamente a angulação para facilitar a passagem do cateter.O fluxo sanguíneo arterial deve ser imediatamente visível dentro do cateter. Avance lentamente o cateter alguns milímetros além da dobra anterior. Em seguida, amarre a ligadura preparada para fixação do cateter.Agora, lave suavemente o cateter com cloreto de sódio e, em seguida, aspire a solução para confirmar a posição correta do cateter. Use um pedaço de fita adesiva para fixar ainda mais o cateter na plataforma cirúrgica. Depois que o cateter tiver sido adequadamente fixado e deslocado, corte a pele e a fáscia acima da face ventral do escroto direito.Tendo o cuidado de não tocar o tecido subjacente com nenhum instrumento. Estenda o corte até o dobramento inguinal e lateralmente até a extremidade distal do escroto. Em seguida, separe cuidadosamente os tecidos moles e conjuntivos subjacentes acima do saco cremastérico sem tocar o tecido em si.Em seguida, coloque um fio de seda de seis oh na extremidade distal do cremástero para levemente estender o músculo. Depois, puxe suavemente o músculo para cima e anteriormente para ressecar os tecidos moles remanescentes sob o saco do cremástero. Após a completa separação do tecido conjuntivo, use uma tesoura para abrir o saco do cremástero na borda cranial e estenda a incisão dessa abertura até a extremidade distal do músculo.Após cauterizar termicamente o pequeno vaso que conecta o testículo ao cremaster, use uma tesoura para cortar as conexões restantes entre o músculo e o testículo. O cremaster aberto agora ficará plano sobre a superfície. Em seguida, posicione quatro pontos de sutura de prolene 6-0 nos bordos do tecido e fixe-os com o campo elástico.Para espalhar o tecido muscular cremasteriano a partir deste ponto, utilize uma seringa de um mililitro para umedecer continuamente o tecido com PBS. Após o preparo ter repousado por 15 minutos, injete 0,05 a 0,1 mililitro de dextrina a 1% via artéria femoral esquerda para realce do contraste da microvasculatura. Agora, mova o mouse e a platina para sob um dispositivo acoplado a carga.Câmera de vídeo conectada a microscópio com fluorescência, modificado para iluminação epi, tomando cuidado especial para não deslocar o cateter da artéria femoral. Após ajustar o objetivo com imersão em água para uma visualização suficiente da microcirculação do chma, definiram-se estocasticamente seis vênulas pós-capilares para análise posterior da aderência firme das células-tronco. Em seguida, carregue uma seringa de um mililitro com 200 microlitros das células-tronco da medula óssea doadoras previamente marcadas com fluorescência.Toque suavemente na seringa para ressuspendê-la, suspenda a suspensão celular e, em seguida, administre as células através do cateter femoral em injeções de 40 microlitros, totalizando cinco injeções consecutivas. Registre o rolamento das células-tronco imediatamente após a injeção celular. Defina rolamento como uma redução superior a 50% da velocidade celular ao longo do revestimento endotelial, em combinação com os movimentos típicos de adesão e liberação celular.Após a conclusão da microscopia intravital, remova cuidadosamente o músculo cremastérico e armazene-o para análises posteriores. Em geral, a interação de células-tronco ou progenitoras injetadas diretamente com o endotélio vascular na microcirculação do músculo cremastérico é um evento raro e ocorre exclusivamente nos vênulas pós-capilares devido à marcação fluorescente. As células que rolam, indicadas pela seta preta, e as células-tronco firmemente aderidas, indicadas pelas setas brancas, podem ser claramente distinguidas dos leucócitos endógenos em circulação nos vênulas.As condições microcirculatórias representadas pela velocidade do fluxo sanguíneo e pela taxa de cisalhamento na parede geralmente não diferem significativamente entre os respectivos grupos experimentais com diferentes tratamentos de quimiocinas. O tratamento local do tecido muscular do músculo ker com diferentes quimiocinas ou mediadores da resposta inflamatória. Por exemplo, o fator de células estromais um alfa ou o fator de necrose tumoral alfa são capazes de imitar condições microambientais específicas.Essas condições aumentam as interações entre células-tronco e células endoteliais em graus variáveis, dependendo do quimioatraente ou mediador específico aplicado e da população de células-tronco injetada. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como visualizar as interações entre células-tronco e células endoteliais in vivo por meio da microscopia intravitai da microcirculação muscular CreER.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um novo método versátil para a observação da microcirculação é apresentado. Ele é considerado adequado para observação a longo prazo, e para combinação com pharmacophysiological ou molecular intervenções biológicas.

Medição in vivo Micro-circulação no músculo esquelético por Intra-vital Microscopia

Microscopia intravital para seguir temporal e espacial eventos inflamatória e hemodinâmica na microcirculação pial.

Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

A preparação do tecido é descrito para visualização e manipulação experimental da microcirculação vida. Anestesiados em camundongos machos, o fino, altamente vascularizado do músculo cremaster está preparado para microscopia intravital para estudar redes microvasculares incluindo arteríolas, vênulas e capilares. Esta preparação é facilmente adaptada para ratos e hamsters.

O Mouse Preparação Muscle Cremaster for Imaging intravital da Microcirculação

Microiontophoresis implica movimento de íons de uma micropipeta, em resposta a uma diferença de potencial elétrico entre o interior eo exterior da micropipeta. Moléculas biologicamente ativas são, assim, entregue em proporção à corrente elétrica. Nós ilustramos microiontophoresis acetilcolina em conjunto com micromanipulação para estudar vasodilatação dependente do endotélio na microcirculação.

Microiontophoresis e Micromanipulação para imagens de fluorescência intravital da Microcirculação

Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

Microscopia de epifluorescência intravital Digital de vênulas na microcirculação cremastérico é um método conveniente para obter insights sobre leucócito-endotelial...

Real-time Digital Imaging de leucócito-endotélio Interação em isquemia-reperfusão (IRI) do músculo cremaster de rato

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Esta aplicação simplificada de microscopia intravital de veias mesentérias em camundongos pode ser usada em diferentes modelos de inflamação para observar as interações leucócitos-endoteliais e plaquetas-leucócitos.

Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

Aqui, mostramos como realizar microscopia intravital em venulos pós-capilar esfarelados do músculo cremaster do rato. Comumente aplicada a diferentes modelos de inflamação e sepse, particularmente aqueles induzidos por quimiocinas e citocinas, destacamos sua relevância no estudo de muscolopatias envolvendo infiltração exagerada de leucócitos musculares.

Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital

O recrutamento de leucócitos e plaquetas constitui um componente essencial necessário para o crescimento efetivo das artérias colaterais durante a arteriogênese. A microscopia multifóton é uma ferramenta eficiente para rastrear a dinâmica celular com alta resolução espaço-temporal in vivo e menor fototoxicidade para estudar o recrutamento e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

Aprenda a usar microscopia intravital para analisar a migração de células-tronco periféricas na microcirculação do músculo cremaster de rato. Este método permite visualizar interações celulares em tempo real.

Microscopia intravital da Microcirculação no músculo Rato Cremaster de Análise de Migração Stem Peripheral celular

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