Microscopia intravital da Microcirculação no músculo Rato Cremaster de Análise de Migração Stem Peripheral celular

O objetivo geral deste procedimento é visualizar as interações das células-tronco endoteliais in vivo. Isso é feito introduzindo primeiro um cateter de artéria femoral em um animal sedado para acesso intra-arterial. Durante a segunda etapa, o músculo cromático é preparado cirurgicamente para microscopia de fluorescência intravital.

Em seguida, a população de células-tronco de interesse é injetada através do cateter da artéria femoral. Em última análise, as interações entre as células-tronco transferidas adotivamente e o endotélio da microcirculação do músculo mestre podem ser visualizadas e quantificadas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da medicina regenerativa, como como a migração de células-tronco aplicadas terapeuticamente é regulada dentro de um organismo vivo?

Antes de iniciar a microcirurgia D air, foi feito um cateter conectado a uma seringa de um mililitro com cloreto de sódio a 0,9%. Em seguida, raspe suavemente o aspecto anterior do escroto direito, bem como a coxa direita e a virilha de um camundongo macho anestesiado de 20 a 25 miligramas. Colete todo o cabelo solto com um cotonete umedecido e, em seguida, coloque o lado ventral do rato para cima em um plexiglass, feito sob medida, consistindo de uma placa de base e uma segunda placa na borda do mimo da placa de base para elevação de ambas as patas traseiras e o escroto.

Depois de fixar os pés com um caimento elástico, coloque o palco em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do animal em 37 graus Celsius. Em seguida, usando uma ampliação de 10 a 16 vezes, use um microscópio de dissecção e uma tesoura para fazer uma incisão inicial na coxa direita, logo anterior aos vasos femorais do joelho à virilha. Identifique a artéria femoral e siga-a proximalmente, mobilizando a artéria do tecido mole circundante.

Em seguida, usando termocauterização, identifique e corte um grande ramo arterial que leva ao testículo esquerdo. Coloque uma sutura de seis oh prolene superficialmente no testículo esquerdo. Em seguida, identifique e cauterize termicamente o grande ramo arterial que corre medialmente na coxa.

Em seguida, usando tração suave, ligue a artéria femoral na parte distal da coxa direita e, em seguida, coloque uma sutura ao redor da artéria femoral proximal o mais próximo possível do centro do animal. Agora, coloque um nó solto ao redor da artéria femoral, mas não o amarre. Em seguida, aplique uma tração suave na sutura para criar uma torção arterial.

Depois de estabelecer a torção, use uma microtesoura para dimensionar cuidadosamente a artéria, tomando cuidado especial para não danificar a veia femoral. Em seguida, insira o microcateter previamente preparado na incisão. Afrouxar cuidadosamente a dobra para facilitar a passagem do cateter.

O fluxo sanguíneo arterial deve ser imediatamente visível dentro do cateter. Avance lentamente o cateter alguns milímetros além da dobra anterior. Em seguida, amarre a ligadura preparada para fixação do cateter.

Agora lave suavemente o cateter com o cloreto de sódio e aspire a solução para confirmar a posição correta do cateter. Use um pedaço de fita adesiva para prender ainda mais o cateter ao estágio de operação. Depois que o cateter tiver sido adequadamente fixado e afastado, corte a pele e a fáscia acima da face ventral do escroto direito.

Tomando cuidado para não tocar no tecido subjacente com nenhum instrumento. Estenda a incisão até a prega inguinal e coddly até a extremidade distal do escroto. Em seguida, separe cuidadosamente os tecidos moles e conjuntivos subjacentes acima do saco cremaster sem tocar no próprio tecido.

Em seguida, coloque uma sutura de seis oh prolene na extremidade distal do cremaster para estender ligeiramente o músculo. Em seguida, puxe suavemente o músculo coddly e anteriormente para ressecar o tecido mole restante abaixo do saco muscular. Após a separação completa do tecido conjuntivo, use uma tesoura para abrir o saco mestre C na borda cranial e estenda a incisão dessa abertura até a extremidade distal do músculo.

Após a cauterização térmica do pequeno vaso que conecta o testículo no cremaster, use uma tesoura para cortar as conexões restantes entre o músculo e o testículo. O cremaster aberto agora ficará plano no palco. Agora coloque quatro seis suturas de prolene nas bordas do tecido e fixe-as com a cortina elástica.

Para espalhar o tecido muscular cremaster a partir deste ponto, use uma seringa de um mililitro para umedecer continuamente o tecido com PBS. Após o preparo ter descansado por 15 minutos, injete 0,05 a 0,1 mililitro de dextrina de rodina a 1% através da artéria femoral esquerda para realce da microvasculatura. Agora, mova o mouse e o palco sob um dispositivo de carga acoplada.

Microscópio de fluorescência conectado por câmera de vídeo, modificado para epiiluminação, tomando cuidado especial para não deslocar o cateter da artéria femoral. Depois de ajustar a objetiva de imersão em água para visualização suficiente da microcirculação chma, seis ES capilares estocásticas definidas estocasticamente para análise posterior da aderência firme das células-tronco. Em seguida, carregue uma seringa de um mililitro com 200 microlitros das células-tronco fluorescentes da medula óssea do doador previamente marcadas.

Bata suavemente na seringa para resus, suspenda a suspensão celular e, em seguida, administre as células através do cateter femoral em injeções de 40 microlitros para um total de cinco injeções consecutivas. Registre o rolamento das células-tronco imediatamente após a injeção celular. Definindo o rolamento como uma redução de mais de 50% da velocidade celular ao longo do revestimento endotelial em combinação com os movimentos típicos de bastão celular e liberação.

Após a conclusão da microscopia intravital, remova cuidadosamente o músculo cremaster e guarde-o para análise posterior. Em geral, a interação de células-tronco ou progenitoras injetadas diretamente com o endotélio vascular dentro da microcirculação do músculo cremaster é um evento raro e ocorre exclusivamente nas células pós-capilares devido à marcação fluorescente. As células rolantes, indicadas pela ponta da seta preta, e as células-tronco firmemente aderentes, indicadas pelas setas brancas, podem ser claramente distinguidas dos leucócitos endógenos circulantes nos es.

As condições microcirculatórias representadas pela velocidade do fluxo sanguíneo e taxa de cisalhamento da parede geralmente não diferem significativamente entre os respectivos grupos experimentais com diferentes tratamentos com quimiocinas. Tratamento local do tecido muscular mestre de ker com diferentes quimiocinas ou mediadores da resposta inflamatória. Por exemplo, o fator alfa derivado de células estromais ou o fator de necrose tumoral alfa são capazes de imitar condições microambientais específicas.

Tais condições aumentam as interações das células-tronco endoteliais em graus variados, dependendo da quimiocina ou mediador específico aplicado e da população de células-tronco injetadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar as interações de células-tronco e células in vivo por meio de microscopia intravital da microcirculação muscular CreER.