Digital em linha Holographic Microscopy (Dihm) de Assuntos Fracamente de dispersão
8 de fevereiro de 2014
As localizações tridimensionais dos objectos fracamente espalhamento pode ser identificada exclusivamente com linha digital de microscopia holográfica (Dihm), que envolve uma modificação menor para um microscópio padrão. Nosso software utiliza uma heurística de imagens simples juntamente com Rayleigh-Sommerfeld back-propagação para ceder a posição tridimensional e geometria de um objeto fase microscópica.
O objetivo geral do experimento a seguir é reconstruir a posição 3D na geometria de uma cadeia de células bacterianas nadadoras. Isso é conseguido primeiro cultivando células bacterianas na concentração correta para fornecer uma amostra adequada para imagem. Como segundo passo, a fonte de luz LED é configurada e alinhada, permitindo a obtenção de imagens holográficas.
Em seguida, o software de reconstrução é usado para obter as coordenadas 3D de uma cadeia de células bacterianas. Os resultados mostram a capacidade de reconstruir a posição 3D e a configuração das células bacterianas com base em imagens holográficas. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a microscopia confocal, é que a imagem volumétrica sem rótulos é possível em altas taxas de quadros.
Para começar a inocular, 10 mililitros de meio KTY com cristais de gelo de um estoque congelado de estreptococos cepa V 4 0 5 1 1 97 incubam a cultura inicial em um agitador rotativo durante a noite a 35 graus Celsius e 150 RPM. Depois de crescer, inocular 10 mililitros de meio KTY fresco com 500 microlitros da cultura inicial saturada. Incube por 3,5 horas a 35 graus Celsius e 150 RPM até que as células atinjam uma densidade óptica em um comprimento de onda de 600 nanômetros de 0,8 a 1,0.
Isso representa aproximadamente cinco vezes 10 elevado a oitavo células por mililitro. Em seguida, dilua as células em um a 400 em meio fresco para obter a concentração final de aproximadamente 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, encha uma seringa com vaselina e faça um anel de graxa de um milímetro de altura em uma lâmina de microscópio.
Em seguida, coloque uma gota da solução de amostra no centro. Coloque suavemente uma lamínula sobre a amostra e pressione levemente o vidro para selar as bordas, garantindo que o líquido esteja em contato com a lâmina e a lamínula. A câmara de amostra resultante deve ter 100 a 200 micrômetros de profundidade.
Gire uma lente de imersão em óleo de 60 x no lugar e adicione uma gota de óleo. Em seguida, coloque a câmara de amostra no microscópio stage com a lamínula voltada para baixo. Certifique-se de que não se formam bolhas de ar entre a lamínula de vidro e a lente.
Concentre-se na superfície inferior da câmara de amostra e, em seguida, concentre o condensador. Em seguida, desligue a iluminação padrão e coloque a cabeça de LED atrás da abertura do condensador do microscópio. Certifique-se de que o condensador esteja configurado para o modo de campo claro e defina a fonte de alimentação do LED para a saída máxima.
Em seguida, feche a abertura do condensador em toda a sua extensão e empurre o LED em seu suporte até que a iluminação esteja centralizada na abertura da lente objetiva. Ligue o computador e redirecione o caminho da luz para a porta da câmera do microscópio. Ajuste a taxa de quadros para 30 quadros por segundo e o tamanho da imagem para cinco 12 por cinco 12 pixels no software de aquisição de imagens.
Verifique um histograma de intensidade de imagem para garantir que nenhuma parte da imagem esteja saturada ou subexposta. O tempo de exposição do quadro deve ser o mais curto possível, mantendo um bom contraste. Se as células se acumularem perto de uma interface, refocalize o microscópio para que as células bacterianas fiquem ligeiramente desfocadas.
As células devem estar a cerca de 10 a 30 mícrons do plano focal para uma reconstrução ideal. Depois de refocar, adquira uma série de quadros de vídeo e salve como um arquivo VI descompactado. Em seguida, inicie o software DIHM disponível para download gratuito para converter um quadro de vídeo em uma pilha de imagens refocadas numericamente.
Exemplos de quadros são fornecidos com o software para iniciar a reconstrução. Insira o quadro de interesse e seu plano de fundo como arquivos de imagem separados nas caixas. A imagem de fundo representa de forma justa o plano de fundo do vídeo na ausência do holograma e será usada para suprimir qualquer ruído de padrão fixo que possa interferir na localização e análise holográfica.
Em seguida, insira os parâmetros da pilha de saída nas caixas de configurações globais. Primeiro, insira a posição axial do primeiro quadro no foco inicial. Em seguida, insira o número de fatias na pilha reconstruída em número de etapas e, finalmente, insira a distância real entre cada fatia na pilha em tamanho da etapa.
Defina o tamanho da etapa para ser igual ao espaçamento lateral entre pixels para reconstruir objetos com as proporções corretas usando os dados de exemplo. Esse valor deve ser de 0,233 micrômetros. Em seguida, insira a iluminação, o comprimento de onda e o índice de refração do meio da câmera e a frequência de amostragem lateral.
Na caixa de pixel por mícron, a frequência de amostragem lateral da câmera pode ser encontrada dividindo a ampliação da lente objetiva pelo tamanho do pixel do sensor da câmera. Usando os dados de exemplo, o número seria 60 x dividido por 14 micrômetros igual a 4,29 pixels por mícron. Em seguida, se o centro do objeto estiver escuro no holograma, pressione o botão inverter gradiente Z.
Isso aplicará um filtro que extrai objetos abaixo do plano focal na amostra original. Em seguida, ative o filtro passa-banda, que é responsável por suprimir a contribuição de pixel ruidoso para a imagem. Ele é aplicado a cada fatia de imagem imediatamente após a geração.
Em seguida, verifique o estado de ativação do interruptor de saída intermediário e certifique-se de que esteja ligado. Quando essas opções estiverem ativadas, isso fará com que dois vídeos sejam criados. A primeira saída é a pilha de refocalização com um nome de arquivo que termina na pilha a V.A segunda pilha é a operação de gradiente real com um nome de arquivo que termina em gradiente a VI.Idealmente, essa segunda pilha conterá o objeto de interesse destacado como um objeto brilhante contra um fundo escuro.
Depois de definir todos os parâmetros, pressione executar na janela principal para executar os comandos. O quadro selecionado aparecerá na caixa principal do software. Em seguida, use a ferramenta de lupa encontrada na barra de ferramentas à esquerda da imagem para aumentar e diminuir o zoom.
Use a ferramenta de retângulo para selecionar uma região de interesse ou ROI e capturar o maior número possível de franjas de hologramas dentro do retângulo para otimizar a reconstrução. Por fim, pressione o botão de processo para gerar as duas pilhas de imagens separadas. Inspecione as pilhas resultantes usando a Imagem J disponível neste site.
Se o objeto de interesse puder ser visto claramente na pilha de imagens de gradiente, vá para a seção de renderização para extrair as coordenadas do objeto. Para iniciar a renderização, pressione o botão de extração de recursos para habilitar a função de localização de coordenadas X, Y, Z. Em seguida, insira um caminho e uma extensão para o arquivo de coordenadas de saída, selecione Estilo de raio POV na caixa Estilo de coordenada de saída.
Isso faz com que o programa escreva um arquivo de objeto que pode ser visualizado usando o pacote de software gratuito de rastreamento de raios POV, que pode ser obtido neste site, reprocesse as imagens para extrair as coordenadas dos objetos. O programa fornecerá uma série de coordenadas X, Y, Z no ROI selecionado gravado no nome do arquivo na caixa de cabos de saída. A extração de coordenadas de objetos leva muito mais tempo do que a geração de pilhas.
Certifique-se de que o arquivo de raio POV de amostra fornecido com o código de reconstrução esteja presente na mesma pasta que o arquivo de coordenadas de saída. Edite o arquivo pov de ponto de amostra e substitua o nome do arquivo entre aspas na linha. Inclua meu arquivo NC com o nome do arquivo de dados gerado pelo código de reconstrução.
Em seguida, personalize a posição da câmera, iluminação, textura e opções de renderização no raio POV. Quando terminar, clique no botão Executar para renderizar uma imagem de bitmap. Esta é uma imagem de uma cadeia de bactérias estreptocócicas que foi momentaneamente orientada.
Termine no plano focal. Objetos nessa configuração são difíceis de reconstruir e normalmente produzem uma bolha próxima ao plano focal. Aqui é mostrada uma imagem renderizada corretamente representativa da maioria dos quadros desta série em que a cadeia não é orientada diretamente ao longo do eixo óptico.
A forma e a posição do objeto são reproduzidas fielmente na renderização, como visto no painel à direita. Uma vez que essa técnica tenha sido dominada, ela pode ser feita em minutos.
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Visão Geral
Este estudo demonstra o uso da microscopia holográfica digital em linha (DIHM) para reconstruir as posições tridimensionais e as geometrias de células bacterianas em natação. A técnica permite a obtenção de imagens volumétricas sem marcação a altas taxas de quadros, oferecendo uma vantagem significativa em relação aos métodos tradicionais.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biofísica
- Técnicas de Imagem
Contexto
- A microscopia holográfica digital em linha (DIHM) é uma técnica de microscopia modificada.
- Ela permite a identificação única de objetos fracamente dispersivos em três dimensões.
- A imagem holográfica pode capturar processos dinâmicos em tempo real.
- Métodos existentes, como a microscopia confocal, frequentemente exigem marcação, o que pode alterar o comportamento de amostras biológicas.
Objetivo do Estudo
- Reconstruir a posição e a geometria tridimensionais de células bacterianas em natação.
- Demonstrar a eficácia da DIHM na captura da dinâmica de células vivas.
- Comparar as vantagens da DIHM em relação aos métodos tradicionais de imagem.
Métodos Utilizados
- Preparação de culturas de células bacterianas em concentrações apropriadas.
- Alinhamento de uma fonte de luz LED para obtenção ideal de imagens holográficas.
- Utilização de software de reconstrução para obter coordenadas tridimensionais.
- Análise das imagens holográficas resultantes para avaliar a configuração celular.
Resultados Principais
- As posições 3D de células bacterianas foram reconstruídas com sucesso.
- A técnica demonstrou imagem com alta taxa de quadros sem a necessidade de marcadores.
- Os resultados indicaram uma vantagem clara em relação à microscopia confocal em termos de velocidade de imagem e integridade da amostra.
- A imagem holográfica mostrou-se eficaz para processos biológicos dinâmicos.
Conclusões
- DIHM é uma ferramenta poderosa para o estudo da dinâmica de células bacterianas vivas.
- O método permite imagens tridimensionais detalhadas sem alterar a amostra.
- Essa técnica pode ser aplicada a diversas áreas de pesquisa biológica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia holográfica inline digital (DIHM) permite a obtenção de imagens volumétricas sem marcação de amostras biológicas fracamente dispersivas com altas taxas de quadros, superando uma limitação fundamental na imagem de células vivas, onde métodos tradicionais exigem marcação ou carecem de resolução espacial tridimensional. Essa capacidade apoia fluxos de trabalho de descoberta precoce ao fornecer medidas quantitativas e independentes de modelos sobre a posição e geometria celulares em condições nativas, reduzindo a ambiguidade mecanicista na validação de alvos e na triagem fenotípica. A compatibilidade da técnica com equipamentos de imagem padrão e volumes amostrais escalonáveis a posiciona como uma plataforma reutilizável para reduzir riscos em hipóteses terapêuticas na biologia de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a medição inequívoca e independente de modelo da localização e forma de objetos em amostras microscópicas, apoiando a investigação de hipóteses terapêuticas sem rótulos exógenos.
- Valor Operacional: Utiliza câmeras CMOS/CCD padrão e iluminação por LED ou laser, permitindo a integração em fluxos de trabalho de microscopia existentes sem reagentes especializados.
- Valor Preditivo: Fornece coordenadas tridimensionais quantitativas de estruturas celulares, facilitando a validação de alvos funcionais e a redução de riscos biológicos por meio da observação direta da dinâmica nativa.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Captura padrões de interferência que contêm informações de profundidade para reconstrução 3D, permitindo avaliação livre de marcadores das respostas celulares em microambientes complexos.
- Valor Operacional: Define o volume de amostra acessível por meio do tamanho do sensor da câmera e da coerência da iluminação, apoiando a padronização entre plataformas com volumes de até 5 mm³ utilizando iluminação a laser.
- Valor Preditivo: Utiliza a propagação inversa de Rayleigh-Sommerfeld e heurísticas da anomalia de fase de Gouy para gerar saídas reprodutíveis e quantitativas para prontidão e escalabilidade de ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, permitindo a observação em tempo real de processos biológicos dinâmicos em sistemas relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Permite a aquisição de imagens com alta taxa de quadros sem alteração da amostra, preservando o comportamento nativo para acompanhamento longitudinal em modelos pré-clínicos.
- Valor Preditivo: Oferece desvio de risco mecanicista ao reduzir ambiguidades na geometria e posicionamento celulares, orientando decisões de avanço ajustadas ao risco.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
DIHM insere-se no continuum de descoberta, desde a verificação de hipóteses na biologia inicial até a identificação de compostos promissores e validação pré-clínica, especialmente nos casos em que a imagem volumétrica, dinâmica e sem marcação é necessária para comparar condições experimentais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao fornecer localização tridimensional independente de modelos de objetos fracamente espalhadores, como células bacterianas ou estruturas subcelulares.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de pilhas de imagens quantitativas e refratadas, que possibilitam a comparação de configurações celulares entre diferentes condições.
- Análises: Gera saídas de coordenadas X, Y, Z por meio da extração de características, permitindo a análise estatística de distribuições espaciais e padrões de movimento.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao preservar a integridade da amostra durante a imagem longitudinal de processos dinâmicos.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma capacidade de imagem reutilizável, e não como uma técnica de uso único, aproveitando software gratuito de reconstrução e hardware padrão.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da reconstrução tridimensional, livre de marcadores e independente de modelos, da geometria e posição do objeto.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio do refoco numérico e supressão de ruídos de padrão fixo utilizando subtração de fundo.
- Valor Estratégico: Tomada de decisões mais eficaz sobre prosseguir ou interromper projetos, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados por meio de observação precoce e de alta fidelidade da dinâmica celular nativa.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco por meio de dados espaciais quantitativos que informam a confiança no alvo e a seleção de candidatos promissores.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em aquisição de imagens holográficas e reconstrução numérica utilizando a retropropagação de Rayleigh-Sommerfeld.
- Exige instrumentação capaz de iluminação com onda plana e captura de imagem por CMOS/CCD em taxas de quadros e resoluções definidas.
- Exige padronização entre equipes quanto à coerência da iluminação, tamanho do passo e frequência de amostragem lateral para reconstrução 3D reprodutível.
- Requer adaptação dos parâmetros da pilha de saída (foco inicial, número de passos, tamanho do passo) para corresponder à escala experimental e à ampliação.
- Limitação prática: o reconstrução ideal exige que os objetos estejam localizados entre 10 e 30 mícrons do plano focal, o que exige preparação e focalização precisas da amostra.
