Digital em linha Holographic Microscopy (Dihm) de Assuntos Fracamente de dispersão
February 8th, 2014
As localizações tridimensionais dos objectos fracamente espalhamento pode ser identificada exclusivamente com linha digital de microscopia holográfica (Dihm), que envolve uma modificação menor para um microscópio padrão. Nosso software utiliza uma heurística de imagens simples juntamente com Rayleigh-Sommerfeld back-propagação para ceder a posição tridimensional e geometria de um objeto fase microscópica.
O objetivo geral do experimento a seguir é reconstruir a posição 3D na geometria de uma cadeia de células bacterianas nadadoras. Isso é conseguido primeiro cultivando células bacterianas na concentração correta para fornecer uma amostra adequada para imagem. Como segundo passo, a fonte de luz LED é configurada e alinhada, permitindo a obtenção de imagens holográficas.
Em seguida, o software de reconstrução é usado para obter as coordenadas 3D de uma cadeia de células bacterianas. Os resultados mostram a capacidade de reconstruir a posição 3D e a configuração das células bacterianas com base em imagens holográficas. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a microscopia confocal, é que a imagem volumétrica sem rótulos é possível em altas taxas de quadros.
Para começar a inocular, 10 mililitros de meio KTY com cristais de gelo de um estoque congelado de estreptococos cepa V 4 0 5 1 1 97 incubam a cultura inicial em um agitador rotativo durante a noite a 35 graus Celsius e 150 RPM. Depois de crescer, inocular 10 mililitros de meio KTY fresco com 500 microlitros da cultura inicial saturada. Incube por 3,5 horas a 35 graus Celsius e 150 RPM até que as células atinjam uma densidade óptica em um comprimento de onda de 600 nanômetros de 0,8 a 1,0.
Isso representa aproximadamente cinco vezes 10 elevado a oitavo células por mililitro. Em seguida, dilua as células em um a 400 em meio fresco para obter a concentração final de aproximadamente 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, encha uma seringa com vaselina e faça um anel de graxa de um milímetro de altura em uma lâmina de microscópio.
Em seguida, coloque uma gota da solução de amostra no centro. Coloque suavemente uma lamínula sobre a amostra e pressione levemente o vidro para selar as bordas, garantindo que o líquido esteja em contato com a lâmina e a lamínula. A câmara de amostra resultante deve ter 100 a 200 micrômetros de profundidade.
Gire uma lente de imersão em óleo de 60 x no lugar e adicione uma gota de óleo. Em seguida, coloque a câmara de amostra no microscópio stage com a lamínula voltada para baixo. Certifique-se de que não se formam bolhas de ar entre a lamínula de vidro e a lente.
Concentre-se na superfície inferior da câmara de amostra e, em seguida, concentre o condensador. Em seguida, desligue a iluminação padrão e coloque a cabeça de LED atrás da abertura do condensador do microscópio. Certifique-se de que o condensador esteja configurado para o modo de campo claro e defina a fonte de alimentação do LED para a saída máxima.
Em seguida, feche a abertura do condensador em toda a sua extensão e empurre o LED em seu suporte até que a iluminação esteja centralizada na abertura da lente objetiva. Ligue o computador e redirecione o caminho da luz para a porta da câmera do microscópio. Ajuste a taxa de quadros para 30 quadros por segundo e o tamanho da imagem para cinco 12 por cinco 12 pixels no software de aquisição de imagens.
Verifique um histograma de intensidade de imagem para garantir que nenhuma parte da imagem esteja saturada ou subexposta. O tempo de exposição do quadro deve ser o mais curto possível, mantendo um bom contraste. Se as células se acumularem perto de uma interface, refocalize o microscópio para que as células bacterianas fiquem ligeiramente desfocadas.
As células devem estar a cerca de 10 a 30 mícrons do plano focal para uma reconstrução ideal. Depois de refocar, adquira uma série de quadros de vídeo e salve como um arquivo VI descompactado. Em seguida, inicie o software DIHM disponível para download gratuito para converter um quadro de vídeo em uma pilha de imagens refocadas numericamente.
Exemplos de quadros são fornecidos com o software para iniciar a reconstrução. Insira o quadro de interesse e seu plano de fundo como arquivos de imagem separados nas caixas. A imagem de fundo representa de forma justa o plano de fundo do vídeo na ausência do holograma e será usada para suprimir qualquer ruído de padrão fixo que possa interferir na localização e análise holográfica.
Em seguida, insira os parâmetros da pilha de saída nas caixas de configurações globais. Primeiro, insira a posição axial do primeiro quadro no foco inicial. Em seguida, insira o número de fatias na pilha reconstruída em número de etapas e, finalmente, insira a distância real entre cada fatia na pilha em tamanho da etapa.
Defina o tamanho da etapa para ser igual ao espaçamento lateral entre pixels para reconstruir objetos com as proporções corretas usando os dados de exemplo. Esse valor deve ser de 0,233 micrômetros. Em seguida, insira a iluminação, o comprimento de onda e o índice de refração do meio da câmera e a frequência de amostragem lateral.
Na caixa de pixel por mícron, a frequência de amostragem lateral da câmera pode ser encontrada dividindo a ampliação da lente objetiva pelo tamanho do pixel do sensor da câmera. Usando os dados de exemplo, o número seria 60 x dividido por 14 micrômetros igual a 4,29 pixels por mícron. Em seguida, se o centro do objeto estiver escuro no holograma, pressione o botão inverter gradiente Z.
Isso aplicará um filtro que extrai objetos abaixo do plano focal na amostra original. Em seguida, ative o filtro passa-banda, que é responsável por suprimir a contribuição de pixel ruidoso para a imagem. Ele é aplicado a cada fatia de imagem imediatamente após a geração.
Em seguida, verifique o estado de ativação do interruptor de saída intermediário e certifique-se de que esteja ligado. Quando essas opções estiverem ativadas, isso fará com que dois vídeos sejam criados. A primeira saída é a pilha de refocalização com um nome de arquivo que termina na pilha a V.A segunda pilha é a operação de gradiente real com um nome de arquivo que termina em gradiente a VI.Idealmente, essa segunda pilha conterá o objeto de interesse destacado como um objeto brilhante contra um fundo escuro.
Depois de definir todos os parâmetros, pressione executar na janela principal para executar os comandos. O quadro selecionado aparecerá na caixa principal do software. Em seguida, use a ferramenta de lupa encontrada na barra de ferramentas à esquerda da imagem para aumentar e diminuir o zoom.
Use a ferramenta de retângulo para selecionar uma região de interesse ou ROI e capturar o maior número possível de franjas de hologramas dentro do retângulo para otimizar a reconstrução. Por fim, pressione o botão de processo para gerar as duas pilhas de imagens separadas. Inspecione as pilhas resultantes usando a Imagem J disponível neste site.
Se o objeto de interesse puder ser visto claramente na pilha de imagens de gradiente, vá para a seção de renderização para extrair as coordenadas do objeto. Para iniciar a renderização, pressione o botão de extração de recursos para habilitar a função de localização de coordenadas X, Y, Z. Em seguida, insira um caminho e uma extensão para o arquivo de coordenadas de saída, selecione Estilo de raio POV na caixa Estilo de coordenada de saída.
Isso faz com que o programa escreva um arquivo de objeto que pode ser visualizado usando o pacote de software gratuito de rastreamento de raios POV, que pode ser obtido neste site, reprocesse as imagens para extrair as coordenadas dos objetos. O programa fornecerá uma série de coordenadas X, Y, Z no ROI selecionado gravado no nome do arquivo na caixa de cabos de saída. A extração de coordenadas de objetos leva muito mais tempo do que a geração de pilhas.
Certifique-se de que o arquivo de raio POV de amostra fornecido com o código de reconstrução esteja presente na mesma pasta que o arquivo de coordenadas de saída. Edite o arquivo pov de ponto de amostra e substitua o nome do arquivo entre aspas na linha. Inclua meu arquivo NC com o nome do arquivo de dados gerado pelo código de reconstrução.
Em seguida, personalize a posição da câmera, iluminação, textura e opções de renderização no raio POV. Quando terminar, clique no botão Executar para renderizar uma imagem de bitmap. Esta é uma imagem de uma cadeia de bactérias estreptocócicas que foi momentaneamente orientada.
Termine no plano focal. Objetos nessa configuração são difíceis de reconstruir e normalmente produzem uma bolha próxima ao plano focal. Aqui é mostrada uma imagem renderizada corretamente representativa da maioria dos quadros desta série em que a cadeia não é orientada diretamente ao longo do eixo óptico.
A forma e a posição do objeto são reproduzidas fielmente na renderização, como visto no painel à direita. Uma vez que essa técnica tenha sido dominada, ela pode ser feita em minutos.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Visão Geral
Este estudo demonstra o uso da microscopia holográfica digital em linha (DIHM) para reconstruir as posições tridimensionais e geometrias das células bacterianas em movimento. A técnica permite a obtenção de imagens volumétricas sem marcadores em altas taxas de quadros, proporcionando uma vantagem significativa em relação aos métodos tradicionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biofísica
- Técnicas de Imagem
Fundo
- A microscopia holográfica digital em linha (DIHM) é uma técnica de microscopia modificada.
- Ela permite a identificação única de objetos de baixo espalhamento em três dimensões.
- A imagem holográfica pode capturar processos dinâmicos em tempo real.
- Métodos existentes como a microscopia confocal frequentemente requerem marcação, o que pode alterar o comportamento das amostras biológicas.
Propósito do Estudo
- Reconstruir a posição 3D e a geometria das células bacterianas em movimento.
- Demonstrar a eficácia da DIHM na captura da dinâmica de células vivas.
- Comparar as vantagens da DIHM em relação aos métodos de imagem tradicionais.
Métodos Utilizados
- Preparação de culturas de células bacterianas em concentrações apropriadas.
- Alinhamento de uma fonte de luz LED para obtenção ideal de imagem holográfica.
- Utilização de software de reconstrução para obter coordenadas 3D.
- Análise das imagens holográficas resultantes para avaliação da configuração celular.
Principais Resultados
- As posições 3D das células bacterianas foram reconstruídas com sucesso.
- A técnica demonstrou alta taxa de quadros de imagem sem a necessidade de marcadores.
- Os resultados indicaram uma clara vantagem sobre a microscopia confocal em termos de velocidade de imagem e integridade da amostra.
- A imagem holográfica provou ser eficaz para processos biológicos dinâmicos.
Conclusões
- A DIHM é uma ferramenta poderosa para estudar a dinâmica de células bacterianas vivas.
- O método permite a obtenção de imagens 3D detalhadas sem alterar a amostra.
- Esta técnica pode ser aplicada a várias áreas de pesquisa biológica.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Digital inline holographic microscopy (DIHM) enables label-free volumetric imaging of weakly-scattering biological samples at high frame rates, addressing a key limitation in live-cell imaging where traditional methods require labeling or lack 3D spatial resolution. This capability supports early discovery workflows by providing quantitative, model-free measurements of cellular position and geometry in native conditions, reducing mechanistic ambiguity in target validation and phenotypic screening. The technique’s compatibility with standard imaging hardware and scalable sample volumes positions it as a reusable platform for de-risking therapeutic hypotheses in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables unambiguous, model-free measurement of object location and shape in microscopic samples, supporting therapeutic hypothesis interrogation without exogenous labels.
- Operational Value: Uses standard CMOS/CCD cameras and LED or laser illumination, allowing integration into existing microscopy workflows without specialized reagents.
- Predictive Value: Provides quantitative 3D coordinates of cellular structures, facilitating functional target validation and biological de-risking through direct observation of native dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Captures interference patterns that contain depth information for 3D reconstruction, enabling label-free assessment of cellular responses in complex microenvironments.
- Operational Value: Defines accessible sample volume via camera sensor size and illumination coherence, supporting standardization across platforms with volumes up to 5 mm³ using laser illumination.
- Predictive Value: Employs Rayleigh-Sommerfeld back propagation and Gouy phase anomaly heuristics to generate reproducible, quantitative outputs for assay readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling real-time observation of dynamic biological processes in disease-relevant systems.
- Operational Value: Allows high-frame-rate imaging without sample alteration, preserving native behavior for longitudinal tracking in preclinical models.
- Predictive Value: Delivers mechanistic de-risking by reducing ambiguity in cellular geometry and positioning, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
DIHM fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to lead identification and preclinical validation, particularly where label-free, volumetric, and dynamic imaging are required to compare experimental conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing model-free 3D localization of weakly-scattering objects like bacterial cells or subcellular structures.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, refocused image stacks that allow comparison of cellular configurations across conditions.
- Analytics: Generates X, Y, Z coordinate outputs via feature extraction, enabling statistical analysis of spatial distributions and motion patterns.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving sample integrity during longitudinal imaging of dynamic processes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability rather than a single-use technique, leveraging free reconstruction software and standard hardware.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free, model-free 3D reconstruction of object geometry and position.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via numerical refocusion and fixed-pattern noise suppression using background subtraction.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early, high-fidelity observation of native cellular dynamics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via quantitative spatial data that informs target confidence and lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in holographic image acquisition and numerical reconstruction using Rayleigh-Sommerfeld back propagation.
- Needs instrumentation capable of plane-wave illumination and CMOS/CCD image capture at defined frame rates and resolutions.
- Demands cross-team standardization of illumination coherence, step size, and lateral sampling frequency for reproducible 3D reconstruction.
- Requires adaptation of output stack parameters (start focus, number of steps, step size) to match experimental scale and magnification.
- Practical limitation: optimal reconstruction requires objects to lie 10–30 microns from the focal plane, necessitating precise sample preparation and focusing.
