Tripsina Digest protocolo para analisar a vascularização da retina de um rato modelo

O objetivo geral deste procedimento é isolar a rede vascular retiniana. Isso é realizado primeiramente realizando uma série de lavagens com água na retina isolada. Na segunda etapa, a retina é digerida em tripsina a 37 graus Celsius por cerca de uma a uma hora e meia, dependendo do tamanho da retina.

Em seguida, a vasculatura é isolada por meio de lavagens adicionais com água e dissecação sob microscópio. Por fim, alterações vasculares patológicas, como microaneurismas, degeneração capilar e razão anormal entre células endoteliais e parasitas, podem ser visualizadas. Assim, a principal vantagem do método try and digest em relação a métodos existentes, como o preparo de montagens planas da retina, é que toda a rede vascular pode ser destacada com grande clareza.

De modo geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois ele é tecnicamente desafiador e difícil de realizar de forma consistente. A demonstração visual deste método é essencial, já que os passos de isolamento vascular são difíceis de aprender apenas com palavras. Esta é uma ferramenta muito valiosa em qualquer laboratório que realize estudos de biologia vascular da retina, como em doenças como a retinopatia diabética. Jonathan Chow, um talentoso estudante de medicina do meu laboratório, será quem demonstrará esta técnica.

Após fixar o olho enucleado de camundongo em formalina tamponada neutra a 10% por 24 horas, coloque o olho em uma placa de Petri e cubra com uma pequena quantidade de água. Inicie a dissecação fazendo um corte inicial cuidadosamente na córnea com um par de tesouras de dissecação. Em seguida, segurando a região cortada com pinças retas, use um par de tesouras para cortar ao longo da borda da córnea e da esclera, removendo a córnea.

Em seguida, utilize pinças finas, curvas e retas para remover lentamente e com cuidado a esclera e a coroide da retina em direção ao nervo óptico. Depois, remova o cristalino e qualquer íris excedente e detritos da retina para auxiliar na separação das camadas da retina neural dos vasos sanguíneos.

Adicione aproximadamente 500 microlitros de água filtrada em 45 micrômetros a uma placa de 24 poços e coloque a retina em um poço, agitando suavemente por quatro a cinco horas à temperatura ambiente, trocando a água a cada 30 a 60 minutos. Continue lavando a retina em água durante a noite com agitação suave. No dia seguinte, à temperatura ambiente, remova a água e adicione tripsina a 3%, verificando ao microscópio para garantir que não haja detritos no poço. Para evitar que a vasculatura adira a ela, incube o tecido a 37 graus Celsius com agitação suave ou nenhuma agitação por uma a uma hora e meia.

Quando o tecido começar a apresentar sinais de desintegração, coloque a placa sobre o estágio do microscópio e, em seguida, evitando a retina, remova cuidadosamente a tripsina para separar a vasculatura. Primeiro, adicione água filtrada à retina utilizando pinças.

Retire a membrana limitante interna, que aparece como uma camada fina e transparente. Agite a placa com movimentos suaves. Após cinco minutos, coloque novamente a placa sobre a platina do microscópio e substitua cuidadosamente a água, evitando danificar a retina, para ajudar a liberar a rede de vasos do tecido retiniano aderente.

Lave a retina conforme acabou de ser demonstrado até que reste pouco ou nenhum resíduo na água após a última lavagem. Em geral, remover todo o tecido não vascular é a parte mais difícil do procedimento. As seguintes técnicas podem ser usadas em sequência ou individualmente para facilitar o isolamento da rede vascular; uma dica importante é mergulhar todas as ferramentas e a tripsina antes de manipular a retina.

Isso pode ajudar a evitar que um tecido adere ao equipamento. Revesta a ponteira de uma micropipeta de 200 microlitros com tripsina reservada e, em seguida, pipete cuidadosamente água para cima e para baixo, nas adjacências e soprando em direção aos vasos retinianos, causando uma agitação suave. Se o tecido não vascular ainda estiver resistente, utilize uma ponteira de micropipeta revestida com tripsina no nervo óptico e pipete cuidadosamente toda a rede vascular para cima e para baixo para ajudar a degradar o tecido não vascular.

Por fim, uma pinça fina pode ser usada para levantar suavemente a vasculatura para fora da água, a fim de soltar quaisquer componentes não vasculares aderidos. O resultado final deve ser uma rede vascular retiniana intacta e livre de detritos.

Para visualizar a vasculatura, coloque inicialmente uma gota de água sobre uma lâmina limpa. Em seguida, transfira os vasos digeridos para a água sob análise microscópica. Se o monte dos vasos estiver dobrado ou desdobrado, os vasos dobrados levam a uma visualização deficiente.

Quando corada, se o tecido estiver dobrado, adicione água adicional e agite suavemente a lâmina para facilitar o desdobramento. Em seguida, use uma micropipeta para remover lentamente qualquer excesso de água. O produto final de um procedimento bem-sucedido é uma preparação plana do conjunto da rede vascular da retina de camundongo, com a arquitetura preservada e corada com hematoxilina, eosina e eoina.

Como mostrado aqui, pode-se observar nesta imagem uma distinção clara entre as células endoteliais e as pericitas na retina. Os núcleos das células endoteliais, indicados pela seta branca, são ovais ou alongados e situam-se inteiramente dentro da parede do vaso. Os núcleos dos parasitas, indicados pela seta preta, são pequenos, esféricos, coram-se intensamente e geralmente possuem uma posição proeminente ao longo da parede do capilar.

A tripsina e a digestão são um procedimento comum utilizado para analisar a patologia vascular em modelos animais de diabetes. Esta imagem mostra um exemplo de degeneração capilar, indicada pela seta branca, observada em um camundongo DB DB, um modelo para diabetes tipo dois. Embora este procedimento tenha sido otimizado para retinas de camundongo, resultados semelhantes também podem ser obtidos em retinas de rato.

É importante observar que as retinas de rato, como mostradas nestas imagens, são maiores do que as retinas de camundongo e exigem placas de 12 em vez de 24 poços. A rede vascular da retina de rato também é menos frágil do que a do camundongo. É extremamente crucial remover o máximo possível do tecido não vascular.

Quaisquer remanescentes levarão a marcação inespecífica e resultarão em uma visualização inadequada da vasculatura. Nesta imagem, por exemplo, pode-se observar a remoção incompleta de todo o tecido não vascular. Da mesma forma, também é importante que a retina esteja desenrolada durante a montagem, a fim de melhorar a visualização da vasculatura.

Esta imagem mostra uma tentativa fracassada de desdobramento do preparado vascular plano. Após dominar este procedimento tecnicamente difícil, os cortes e as digestões podem ser um método extremamente valioso que permite a visualização detalhada de toda a rede vascular.

Ao aperfeiçoar esta técnica no olho do camundongo, os pesquisadores podem aproveitar camundongos geneticamente modificados para estudar diversas vias que possam controlar a vasculatura retiniana e permitir-nos compreender a fisiopatologia de várias doenças retinianas. Como resultado disso, podemos aprimorar nosso entendimento das patologias de doenças como a retinopatia diabética. Ao estudar modelos de camundongos como o camundongo DVDB, isso poderá, em última instância, proporcionar a oportunidade de descobrir novas intervenções terapêuticas potenciais direcionadas à vasculatura retiniana.