Name: Tripsina Digest protocolo para analisar a vascularização da retina de um rato modelo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprenda o método de digestão com tripsina para analisar a vascularização retiniana em modelos de rato. Esta técnica otimizada permite visualizar microaneurismas e degeneração capilar com clareza superior aos montados planos tradicionais.

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Este trabalho foi parcialmente financiado pelo NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Sociedade para a Prevenção da Cegueira (JCC, AAF), fundos irrestrito ao Departamento de Oftalmologia da investigação para prevenir a cegueira (RPB), NY e RPB Medical Student Fellowship Grant (JCC).

1. Preparação da retina <ol><li> Enuclear o olho mouse. Usando um lado, abrir as pálpebras para que o olho é visível. Com a outra mão, usando uma pinça curva (curvas virada para cima), aplicar pressão sobre aspectos superior e inferior da órbita até que se projeta globo. Com cuidado, feche fórceps no aspecto posterior do olho e levante em um movimento contínuo para enuclear o olho. </li><li> Corrigir olhos com 10% de formalina tamponada neutra por pelo menos 24 horas. </li><li> Lugar olho em solução PBS em uma pequena placa de Petri. </li><li> Dissecar retina cuidadosamente sob um microscópio, tendo o cuidado de evitar induzir grandes lágrimas. Faça um corte inicial na córnea com uma tesoura de dissecção. Em seguida, mantendo a área de corte com uma pinça reta, use uma tesoura para cortar ao longo da fronteira da córnea e esclera remoção da córnea. Usando pinça fina curvas e retas, cuidadosamente descascar a esclera e coróide longe da retina para o nervo óptico. Esta etapa exige paciência,libertando rapidamente a retina pode levar às lágrimas. Remover a lente e qualquer excesso de detritos da íris e a retina 16. </li></ol> 2. A água lava <ol><li> Ponto retina num prato de 24 cavidades e cobrir com água (aproximadamente 500 mL, filtrado com pelo menos um filtro de 45 mm). </li><li> Troque a água a cada 30 min-1 hora, pelo menos 4-5 vezes. </li><li> Deixe durante a noite em água com agitação suave à temperatura ambiente. </li></ol> Nota: Os passos de lavagem são muito importantes, pois ajudam a separar as camadas da retina neural a partir dos vasos sanguíneos. 3. Tripsina Digest <ol><li> Remover a água e retina incubar numa solução de 3% de tripsina (Difco 1:250) em tampão Tris 0,1 M (pH 7,8) a 37 ° C com agitação suave para não. Tripsina digestão é completado quando o tecido começa a exibir sinais de desintegração (aproximadamente 1,5 horas). Nota: Evite agitação rápidapois isso pode danificar a vasculatura. </li><li> Cuidadosamente, pipetar a tripsina em separado bem usando um microscópio para evitar tocar a retina. Este excesso de tripsina pode ser usado mais tarde, quando manipular os navios sob o microscópio, no passo 4.3. </li></ol> 4. Separar a vasculatura <ol><li> Adicionar água filtrada para a retina. Em seguida, tentar descolar a membrana limitante interna com uma pinça, usando uma tesoura, se necessário. Agite com agitação suave durante 5 min. Cuidadosamente, pipeta a água sob o microscópio para evitar danificar a retina. </li><li> Repita lavagens com água (por 5 min cada) para ajudar a libertar a rede de vasos do tecido da retina aderente. Lavagens de água são completados quando existe pouca ou nenhuma detritos remanescentes na água após a lavagem. </li><li> Manipulações cuidadosas sob um microscópio de dissecação são agora necessários para liberar ainda mais a rede de vasos. Estes são várias técnicas úteis, que podem ser usados ​​em sequência ou individually para atingir o resultado desejado com base na preferência do técnico: <ol class="lalpha"><li> Usando uma pipeta de 200 mL, pipetar cuidadosamente água para cima e para baixo ao lado de vasos, soprando água em vasos, causando agitação suave. </li><li> Usando uma pipeta de 200 mL, pipeta a tripsina cima e para baixo para ajudar paredes casaco da pipeta. Então, com cuidado pipeta toda a rede de vasos cima e para baixo uma vez para ajudar a quebrar tecido não vascular. Nota: centragem da ponta da pipeta no nervo óptico, em vez de as bordas da rede vascular pode também prevenir a vascularização de furar a ponta. </li><li> Levante cuidadosamente vasculatura com uma pinça fina de água para desalojar os componentes não-vasculares. </li><li> Se as etapas acima não funcionarem, adicione tripsina para a retina para ajudar a quebrar o tecido, e incubar a 37 ° C por alguns minutos. Em seguida, retire de tripsina e repita os passos de 4,1-4,3. </li></ol></li></ol> &lt;strong&gt; Nota: Certifique-se de casaco de todos os instrumentos que entrarão em contato com os vasos em tripsina (por exemplo, a ponta da pipeta, fórceps). Isto irá ajudar a evitar a adesão da vasculatura para o equipamento. 5. Visualizando a vasculatura <ol><li> Colocar uma gota de água sobre uma lâmina de limpeza. Usando uma pipeta ou uma pinça 200 ul, transferir os vasos digeridos na água. Verifique se o plano de montagem vascular é desdobrada. A tensão superficial da água ajuda a desdobrar a rede vascular agora diáfano. Se o tecido não se desdobra, adicione mais água e agitar suavemente a lâmina para facilitar desdobramento. </li><li> Retire o excesso de água muito lentamente por pipetagem ou usando uma toalha de papel. </li><li> Deixar as lâminas para secar completamente. </li><li> Mancha lâminas via protocolo apropriado tanto com PAS / Hematoxilina ou H &amp; E mancha. Nota: PAS / hematoxilina é útil para a identificação da parede do vaso e núcleos celulares, H &amp; E é útil para o demonstration de RBC bem. </li><li> Desidratar e montar (Permount meio de montagem). </li></ol>

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<li>The Jackson Laboratory [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html">http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html</a> (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Tripsina digest é um método padrão para avaliar a vasculatura da retina. Infelizmente, não é tecnicamente difícil e pode resultar numa elevada taxa de perda de amostra se não for realizado correctamente. Além disso, o procedimento é especialmente difícil, em ratos, o que pode limitar a aplicação desta técnica, os modelos animais genéticos usados ​​de doenças oculares. Este documento fornece orientação sobre como realizar o procedimento de forma eficaz e consistente no rato olhos. Existem vár...

A visualização da vascularização da retina é uma abordagem extremamente importante para dissecar os mecanismos de várias doenças oculares, tais como retinopatia diabética. Ele permite avaliar as anomalias vasculares, incluindo primeiros microaneurismas, degeneração e perda capilar, pericyte 8,9. Até à data, tem havido várias técnicas desenvolvidas para analisar a vascularização da retina. Perfusão de vários corantes foi utilizada para realçar os vasos, mas todos têm partilhado limitações semelhantes. Injeção raramente destaca toda a vascularização da retina, a menos dado a uma pressão elevada, o que corre o risco de se romper e danificar os vasos 1. Imunocoloração do endotélio vascular com fluorophore marcado G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 conjugado; I21413; Invitrogen; 1:100) e monta plano de retina pode-se destacar a arquitetura geral dos vasos, mas sem visualização detalhada dos capilares, membranas basais e pericitos . Foi notada pelosFriedenwald que os navios podem ser destacados pela coloração plana montagens de retina com ácido periódico de Schiff (PAS) ou hematoxilina e eosina (H &amp; E) coloração 10. No entanto, a coloração não foi específico para os vasos e destacada do tecido não-vascular, bem como, o que torna difícil a diferenciação dos vasos. Na década de 1960, Cogan e Kuwabara desenvolveu a técnica digest tripsina que tornou mais fácil a visualização da vascularização da retina através da digestão dos componentes não-vasculares da retina 1. Desde essa altura, a tripsina digest tornou-se o método padrão de ouro na análise da vasculatura da retina 2-5. No entanto, é importante notar que outras técnicas alternativas para isolar a vasculatura tenham sido descritas. A utilização de lise osmótica foi usado para isolar a vasculatura e permitir estudos bioquímicos do tecido 11,12, mas o procedimento não tem sido utilizada como um método primário para estudo anatómicos. O método de impressão de tecidos tem sidousado para isolar grandes segmentos da microvasculatura e permite a possibilidade de estudar a arquitectura electrotonic da vasculatura 13. Em teoria, esta técnica também pode ser usada para estudar alterações anatómicas, como a qualidade dos vasos é elevado. No entanto, só é capaz de isolar segmentos de toda a rede vascular. Embora estes métodos não podem substituir a tripsina digest, é importante notar que eles têm diferentes vantagens e desvantagens e são complementares a este respeito. O método digest tripsina é tecnicamente desafiador e é difícil de executar de forma consistente 6,7. Além disso, tem sido observado que a tripsina digest é especialmente difícil num modelo de ratinho, especialmente se se deseja preservar a arquitectura global vascular da retina 6,7. Os desafios incluem (1) sobre-digestão da retina que provoca a perda de ambas a vasculatura, bem como do tecido não-vascular, (2) sub-digestão, requerendoextensa dissecção mecânica que poderia levar a danos do leito do navio, (3) separação deficiente do tecido não vascular a partir da vasculatura levando a coloração não específica. Vários manuscritos têm destacado estes desafios, mas nenhum deles forneceu um protocolo detalhado e consistente para superá-los 14,15. Este manuscrito irá introduzir uma metodologia passo a passo detalhando a técnica para realizar a digestão da tripsina no rato e rato retinas com dicas específicas sobre o tratamento das etapas particularmente difíceis. Um esquema geral é mostrado na Figura 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>10% de formalina tamponada neutra</td><td>Fischer Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (1:250)</td><td>Amresco</td><td>0458-50G</td><td>Faça 3% de tripsina em 0.1 M Tris</td></tr><tr><td>TRIZMA base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Crie 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 &deg; C)</td></tr><tr><td>TRIZMA</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de vácuo estéril</td><td>Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td>Criar água</td></tr><tr> filtrada<td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td> de dissecação <td>Qualquer microscópio que permita uma boa visualização da retina é adequado. (10x é suficiente com distância de trabalho de 24 mm)</td></tr><tr><td>Tesoura reta</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td>Aresta de corte: 8 mm; Diâmetro da ponta: 0,2 mm; Pinça reta de 10 cm</td></tr><tr><td>(Inox)</td><td>Dumont #5</td><td>11252-20</td><td>Ponta de biologia; 0,05 x 0,02 mm; 11 cm</td></tr><tr><td>de forceptos curvos (Dumostar)</td><td>Dumont #7</td><td>11297-10</td><td>Ponta de biologia; 0,07 x 0,04 mm;</td></tr><tr><td>Incubadora de agitador metabólico Dubnoff</td> de 11,5 cm <td>Agitador</td><td>de BDG59442</td><td>de precisão opcional</td></tr><tr><td>Prato de 24 poços</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>VWR</td><td>82027-132</td><td></td></tr></tbody></table>

tripsina digest protocolo para analisar a vascularização da retina de um rato modelo

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Tripsina digest é o método padrão de ouro para analisar a vasculatura retiniana 1-5. Ela permite a visualização de toda a rede de vasos complexas tridimensionais retina sanguíneos e capilares, criando um bidimensional plana de montagem dos canais vasculares interligados após digestão dos componentes não-vasculares da retina. Isto permite estudar várias alterações patológicas vasculares, tais como a degeneração capilar, microaneurismas, e anormal endoteliais rácios pericyte. No entanto, o método é tecnicamente difícil, especialmente em ratos, que se tenham tornado o modelo animal mais amplamente disponíveis para estudar a retina por causa da facilidade de manipulações genéticas 6,7. No olho do rato, é particularmente difícil de remover completamente os componentes não-vasculares, mantendo a arquitectura geral dos vasos sanguíneos da retina. Até o momento, há uma escassez de literatura que descreve a técnica de digestão de tripsina em detalhe in o mouse. Este manuscrito fornece uma metodologia detalhada passo-a-passo da tripsina digest no rato retina, além de fornecer dicas sobre solução de problemas etapas difíceis.

O produto final de um processo bem sucedido é um plano de montagem de toda a rede da vasculatura da retina do rato, com a arquitectura mantida, coradas quer com PAS / hematoxilina ou H &amp; E, tal como mostrado nas Figuras 2-4. Limpar a diferenciação das células endoteliais e pericitos pode ser visto como mostrado na Figura 3. Na retina, os núcleos das células endoteliais são ovais ou alongadas e ficar inteiramente dentro da parede do vaso. Pericyte núcleos são pequenos, esférico, manc...

A tripsina é uma compilação dos métodos mais utilizados para analisar a vasculatura retiniana. Este manuscrito descreve o método em detalhes, incluindo alterações importantes para otimizar a técnica e remover o tecido não-vascular, preservando a arquitetura geral dos vasos.

Tripsina Digest protocolo para analisar a vascularização da retina de um rato modelo

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar a rede vascular retiniana. Isso é realizado primeiramente realizando uma série de lavagens com água na retina isolada. Na segunda etapa, a retina é digerida em tripsina a 37 graus Celsius por cerca de uma a uma hora e meia, dependendo do tamanho da retina.Em seguida, a vasculatura é isolada por meio de lavagens adicionais com água e dissecação sob microscópio. Por fim, alterações vasculares patológicas, como microaneurismas, degeneração capilar e razão anormal entre células endoteliais e parasitas, podem ser visualizadas. Assim, a principal vantagem do método try and digest em relação a métodos existentes, como o preparo de montagens planas da retina, é que toda a rede vascular pode ser destacada com grande clareza.De modo geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois ele é tecnicamente desafiador e difícil de realizar de forma consistente. A demonstração visual deste método é essencial, já que os passos de isolamento vascular são difíceis de aprender apenas com palavras. Esta é uma ferramenta muito valiosa em qualquer laboratório que realize estudos de biologia vascular da retina, como em doenças como a retinopatia diabé

trypsin-digest-protocol-to-analyze-retinal-vasculature-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A retina de roedores tem sido reconhecida como uma janela de acesso para o cérebro. Neste documento técnico que proporcionam um protocolo que utiliza o modelo de ratinho de retinopatia induzida por oxigénio para estudar os mecanismos que levam à insuficiência de regeneração vascular dentro do sistema nervoso central após a lesão isquémica. O sistema descrito também pode ser aproveitada para explorar estratégias para promover o crescimento de vasos sanguíneos funcionais dentro da retina e do...

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

Muitas doenças oculares visão em risco estão associadas com microvessels da retina disfuncional. Portanto, a medição das respostas arteríola retinal é importante para investigar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes. Este artigo descreve um protocolo detalhado para isolamento de rato arteríola retinal e preparação para avaliar os efeitos de substâncias vasoativas no diâmetro vascular.

Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

Este protocolo descreve um método detalhado para a preparação e a coloração da imunofluorescência de montagem e análise plana de retina de camundongos. O uso de fluoresceína fundus angiography (FFA) para filhotes de camundongos e processamento de imagem também são descritos em detalhes.

Monitoramento do crescimento dinâmico dos vasos retinais no modelo de rato de retinopatia induzido pelo oxigênio

A retinopatia diabética é uma das principais causas de cegueira. Histologia, ensaio de quebra da barreira hemorrânica e angiografia de fluorescência são técnicas valiosas para entender a fisiopatologia da retina, o que poderia aumentar ainda mais o rastreamento eficiente de drogas contra a retinopatia diabética.

Avaliação fisiofisiológica da retina em um modelo de rato

Este artigo descreve um ensaio bem estabelecido e reprodutível de manchas de lectina para toda a preparação da retina do montagem e os protocolos necessários para a medição quantitativa dos parâmetros vasculares frequentemente alterados em retinopatias proliferativas e não proliferativas.

Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

Apresenta-se aqui um protocolo imuno-histoquímico detalhado para identificar, validar e direcionar caspases funcionalmente relevantes em tecidos complexos.

Quantificação da Caspase-9 Imunocorada em Tecido Retiniano

Modelos murinos podem ser ferramentas úteis para investigar a biologia do epitélio pigmentado da retina (EPR). Foi estabelecido que camundongos podem desenvolver uma série de patologias do EPR. Aqui, descrevemos um protocolo de fenotipagem para elucidar e quantificar patologias do EPR em camundongos usando microscopia de luz, elétron de transmissão e confocal.

Protocolo para Avaliação e Quantificação de Patologias do Epitélio Pigmentado da Retina em Modelos Murinos de Degeneração Macular Relacionada à Idade

Um ensaio de proteção foi desenvolvido para monitorar a resiliência da vasculatura retiniana à morte por diabetes/insultos relacionados à retinopatia diabética, como estresse oxidativo e citocinas.

Um ensaio para detectar a proteção da vasculatura retiniana contra a morte relacionada ao diabetes em camundongos

Recentemente, identificamos o enrijecimento capilar da retina como um novo paradigma para a disfunção retiniana associada ao diabetes. Este protocolo elabora as etapas para o isolamento dos capilares retinianos de camundongos e da matriz subendotelial das culturas endoteliais da retina, seguidas de uma descrição da técnica de medição da rigidez usando microscopia de força atômica.

Isolamento de capilares retinianos de camundongos e matriz subendotelial para medição de rigidez usando microscopia de força atômica

Os pericitos na vasculatura retiniana foram examinados por coloração imunofluorescente com receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β após injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate. A retina marcada foi posteriormente tratada com o método de limpeza de tecido e toda montada para visualizar as vistas tridimensionais dos pericitos ao redor da vasculatura retiniana sob um microscópio confocal.

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração 

Aprenda o método de digestão com tripsina para analisar a vascularização retiniana em modelos de rato. Esta técnica otimizada permite visualizar microaneurismas e degeneração capilar com clareza superior aos montados planos tradicionais.

Tripsina Digest protocolo para analisar a vascularização da retina de um rato modelo

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