Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Este procedimento envolve a colonização do nasofaringe murino com Streptococcus pneumoniae e a subsequente extração das bactérias colonizadoras, bem como das células aderentes ou recrutadas. Isso é realizado primeiramente pela preparação de um inóculo bacteriano da cepa de S. pneumoniae de interesse.

As bactérias vivas são então administradas por via intranasal em camundongos anestesiados enquanto estão em um aparelho de contenção. Após o período desejado de colonização, os camundongos são eutanasiados e lavagens nasais são realizadas por meio da cânula inserida nas traqueias expostas, com a lavagem do conteúdo através das narinas. Os números bacterianos presentes nas lavagens nasais podem ser quantificados utilizando técnicas microbiológicas. Alternativamente, as respostas imunes podem ser analisadas utilizando técnicas de citometria de fluxo para fenotipar as células recrutadas ou técnicas de PCR quantitativa.

Para medir os níveis de mRNA expresso de interesse antes de iniciar, você precisará preparar restritores para camundongos para a parte de colonização intranasal do procedimento e agulhas canuladas para as lavagens nasais. Um restritor para camundongos pode ser preparado simplesmente cortando a ponta cônica de um tubo cônico de 50 mililitros. Após criar a abertura, certifique-se de usar uma tesoura para alisar quaisquer bordas afiadas.

Para a preparação de agulhas canuladas, você precisará do seguinte: tubo de polietileno PE 20 com diâmetro interno de 0,38 milímetros. Uma seringa de um mililitro é provida com agulhas biseladas de calibre 26 e três oitavos, uma tesoura fina e afiada do tipo iris e um par de pinças. Corte o tubo PE 20 com a tesoura fina em pedaços com aproximadamente 2,5 centímetros ou uma polegada de comprimento, garantindo que cada extremidade tenha uma ponta biselada.

Usando a pinça, deslize cuidadosamente um desses pedaços até a ponta da sua agulha. Evitando perfurar o lado do tubo, as agulhas canuladas podem ser mantidas em etanol 70% até o momento do uso e lavadas com PBS imediatamente antes da utilização. Para a colonização intranasal de camundongos com S. pmo, recomendamos o uso de uma concentração de 10⁹ unidades formadoras de colônia por mililitro administradas em 10 µL.

Para uma dose final de 10 elevado a sete UFC, mantenha o inóculo em gelo até pouco antes do uso e certifique-se de agitar entre cada colonização. Além do inóculo, você também precisará de uma pipeta P10 ou P20, ponteiras de pipeta esterilizadas e do seu dispositivo restritor de camundongo. Isole um camundongo individual pela cauda e restrinja-o colocando-o no aparelho restritor de camundongo previamente preparado.

Se você estiver com dificuldades para direcionar o camundongo para dentro do dispositivo de contenção, pode ser útil posicioná-lo na frente e acima do animal, permitindo que ele suba. Uma vez que o camundongo estiver dentro do dispositivo, fixe-o pela base do corpo, empurrando-o suavemente para cima, de modo que seu focinho saia pela extremidade afunilada do dispositivo. Utilizando uma pipeta P 10 ou P 20, inocule cada camundongo depositando 10 microlitros da cultura preparada, distribuindo-o uniformemente entre ambas as narinas.

Permita que o inóculo escorra pelo nariz pulsando a inoculação gradualmente, tomando o tempo necessário para que o camundongo aspire o inóculo. O camundongo pode espirrar parte do inóculo para fora do nariz, o que é esperado. Observe que os camundongos devem estar anestesiados durante este procedimento para garantir que as bactérias permaneçam localizadas na nasofaringe e não se espalhem para o trato respiratório inferior.

Para fins desta demonstração, estamos inoculando com PBS, mas sempre que trabalhar com bactérias vivas, certifique-se de realizar o procedimento de acordo com as diretrizes aprovadas pela instituição. Por exemplo, a maioria das instituições exigirá que a colonização seja realizada em uma cabine de segurança biológica nível dois. Se utilizar indicadores de peso como parte do seu método de monitoramento do ponto final, após a colonização, monitore os camundongos a cada 12 a 24 horas quanto a sintomas clínicos, incluindo letargia, pelagem eriçada e perda de peso.

Uma vez que os camundongos estejam colonizados, mantenha-os pelo tempo desejado. Ao final desse período, os camundongos serão submetidos à eutanásia e será realizada a lavagem nasal, pois a dislocação cervical pode potencialmente danificar a traqueia. Esse método de eutanásia deve ser evitado.

Antes de realizar lavagens nasais, certifique-se de ter os seguintes materiais à disposição: agulhas canuladas previamente preparadas, etanol aquoso a 70%, uma pinça, uma tesoura fina e afiada para íris, solução salina tamponada com fosfato, tampão de lise de RNA e tubos de 1 mL. Quando estiver pronto para começar, posicione o animal deitado de costas e, utilizando etanol aquoso a 70%, esterilize a região do pelo, especialmente a área do pescoço.

Tendo cuidado para evitar que o etanol entre nas narinas. Faça um único corte longitudinal ao longo da linha média do pescoço do animal, permitindo criar uma abertura para visualizar a traqueia. Retire cuidadosamente a pele para os lados, expondo o tecido do pescoço subjacente.

Neste momento, a traqueia deve estar visível, cercada pelos músculos longitudinais em ambos os lados. Corte cuidadosamente esses músculos para obter uma visão clara da própria traqueia, tomando cuidado para não seccionar a vasculatura circundante. Caso você acidentalmente corte a vasculatura e haja presença de sangue na região antes de prosseguir.

Deixe a hemorragia parar e, em seguida, limpe a área várias vezes dispensando PBS estéril e usando gaze estéril para absorver suavemente o excesso de umidade. Uma vez que a traqueia esteja adequadamente exposta, faça um corte semilunar transversal na traqueia aproximadamente na metade do caminho. Coloque PBS estéril em uma seringa canulada.

Insira a cânula na traqueia em direção ao nariz, mantendo a borda biselada voltada para baixo para facilitar a inserção. Uma vez que a cânula estiver no lugar, gire-a 180 graus e sonda suavemente para cima até sentir uma leve resistência. Coloque o tubo DPH EEND designado para coleta de amostra logo abaixo do nariz do camundongo.

Teste a posição correta da cânula dispensando uma quantidade mínima de fluido de lavagem PBS. Após isso, uma gota de fluido deve se formar ao redor da abertura nasal (NAS) do camundongo se a cânula estiver posicionada corretamente. Se o PBS de teste sair diretamente pela boca do animal, recue a cânula e reposicione-a novamente avançando suavemente até sentir uma leve resistência.

Tenha cuidado para não empurrar o cateter muito além dessa resistência, pois isso fará com que ele ultrapasse o palato nasal e entre na cavidade oral. Após confirmar que o cateter está corretamente posicionado, proceda com a administração rápida de 200 microlitros de PBS para ajudar a deslocar e coletar a quantidade máxima de células. O conteúdo deve fluir para fora pelas narinas do camundongo e para dentro do tubo de coleta.

Coloque a amostra imediatamente no gelo. Essas amostras podem ser posteriormente analisadas quanto à carga bacteriana, bem como ao recrutamento celular. Para coletar amostras para análise de RNA, use uma agulha canulada separada contendo 500 microlitros de tampão de lise de RNA para realizar uma lavagem nasal secundária.

Observe que o tampão de lise de RNA desnudará o epitélio e destruirá os tecidos circundantes. Portanto, deve-se ter cuidado para evitar o contato com órgãos como os pulmões. Se for desejada a retenção desses tecidos para quantificar a carga bacteriana nasofaríngea, serão necessários os seguintes itens.

Tubos Epicor, placas microbiológicas contendo triptona de soja com ovo são suplementadas com 5% de sangue de ovelha. Um vórtex, ponteiras estéreis de pipeta para PBS e pipetas P20 e P200. Primeiro, trabalhando em uma cabine de segurança biológica nível dois, prepare uma série de diluições seriadas para cada amostra de lavado nasal de mirin.

Em geral, espera-se que as concentrações de S. pneumoniae na nasofaringe estejam entre zero e 10 à quarta CFU. Portanto, realize três diluições seriadas de dez vezes, adicione 10 microlitros da amostra de lavado nasal puro ao primeiro tubo, obtendo uma concentração de 10 à menos um CFU por mililitro, e continue diluindo sucessivamente até que três amostras sejam excessivamente diluídas, agitando bem com vortex entre cada diluição. Observe que este vídeo é apenas para fins demonstrativos.

Técnica laboratorial adequada, incluindo a troca de ponteiras de pipeta entre diluições, deve sempre ser seguida. Com uma caneta marcadora, divida a placa em quadrantes e rotule os quadrantes com a respectiva diluição a ser plaqueada. Plaque três gotas de 10 microlitros de cada uma das suas diluições na placa de ágar. Deixe secar por 15 a 30 minutos descobertas, depois cubra as placas e coloque-as de cabeça para baixo em uma estufa bacteriológica com condições ideais para o crescimento pneumocócico, tipicamente 37 graus Celsius e 5%CO2.

Incube essas placas por 24 a 48 horas. Após esse período, remova as placas e determine o número de bactérias colonizantes calculando a média das colônias formadas na placa. Para cada diluição, as colônias de animo podem ser identificadas pela sua cor bege distinta e pelas zonas de hemólise alfa, que são halos pequenos ao redor de cada colônia, formados pela digestão bacteriana do suplemento sanguíneo no ágar.

E, finalmente, por pequenas depressões no centro de cada colônia que lhe conferem a aparência de um eritrócito. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão sólida de como estabelecer um modelo de colonização nasofaríngea em camundongo, como isolar bactérias e células da nasofaringe de um camundongo após a colonização, utilizando uma lavagem nasal, e como quantificar a carga bacteriana correspondente por meio de técnicas microbiológicas. Esperamos que os métodos descritos neste vídeo incentivem você a utilizar um modelo de colonização intranasal para estudar as respostas do hospedeiro a patógenos no contexto dessa região pouco estudada.