Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Este procedimento envolve a colonização da nasofaringe murnal com pneumonia estreptocócica e a subsequente extração de bactérias colonizadoras, bem como células aderentes ou recrutadas. Isso é feito preparando primeiro um inóculo bacteriano da pneumonia S. Tensão de interesse.

As bactérias vivas são então administradas por via intranasal em camundongos anestesiados enquanto eles estão em um aparelho de contenção Após a duração desejada da colonização, os camundongos são então sacrificados e as lavagens nasais são realizadas canulando suas traqueias expostas e liberando o conteúdo através do nas. O número de bactérias presentes nas lavagens nasais pode ser quantificado por meio de técnicas microbiológicas. Alternativamente, as respostas imunes podem ser testadas usando técnicas de citometria de fluxo para fenotipar células recrutadas ou técnicas quantitativas de PCR.

Para medir os níveis de mRNA expresso de interesse antes do início, você precisará preparar contenções de camundongos para a parte de colonização intranasal do procedimento e agulhas canuladas para as lavagens nasais. Um limitador de camundongo pode ser preparado simplesmente cortando a ponta cônica de um tubo de falcão de 50 mililitros. Depois de criar a abertura, certifique-se de usar uma tesoura para polir as pontas afiadas.

Para a preparação de agulhas canuladas, você precisará do seguinte tubo de polietileno PE 20 com um diâmetro interno de 0,38 milímetros. Uma seringa mil é tampada com agulhas chanfradas de calibre 26 e três de calibre oito, um par de íris afiada e fina, tesoura e um par de pinças. Corte o tubo PE 20 com a tesoura fina em pedaços de aproximadamente 2,5 centímetros ou uma polegada de comprimento, garantindo que cada extremidade tenha uma ponta chanfrada.

Usando a pinça, deslize cuidadosamente uma dessas peças na ponta da agulha. Evitando perfurar o lado do tubo, as agulhas canuladas podem ser mantidas em etanol a 70% até que sejam necessárias e lavadas com PBS diretamente antes do uso. Para colonização intranasal de camundongos com S pmo, recomendamos o uso de uma concentração de 10 elevado a nove unidades formadoras de colônias por mil entregues em 10 microlitros.

Para uma dose final de 10 a sete UFC, mantenha o inóculo no gelo até pouco antes do uso e certifique-se de agitar entre cada colonização. Além do inóculo, você também precisará de uma pipeta P 10 ou P 20, pontas de pipeta esterilizadas e seu limitador de mouse. Isole um camundongo individual pela cauda e contenha-o colocando-o em seu aparelho de contenção de camundongos previamente preparado.

Se você estiver tendo problemas para direcionar o mouse para o retentor, pode ser útil posicioná-lo na frente e acima do mouse, permitindo que o animal rasteje para cima. Assim que o mouse estiver dentro do limitador, prenda-o pela base do corpo, empurrando-o suavemente para cima, de modo que o nariz saia da extremidade cônica do limitador. Usando uma pipeta P 10 ou P 20, inocule cada camundongo depositando 10 microlitros da cultura preparada, distribuindo-a uniformemente entre ambos. Nares.

Deixe o inóculo pingar no nariz pulsando a inoculação gradualmente, levando o tempo necessário para o camundongo inalar o inóculo. O camundongo pode espirrar um pouco do inóculo do nariz, o que é esperado. Observe que os camundongos devem ser anestesiados para este procedimento para garantir que a bactéria permaneça localizada na nasofaringe e não se espalhe para o trato respiratório inferior.

Para os fins desta demonstração, estamos inoculando com PBS, mas sempre que trabalharmos com bactérias vivas, certifique-se de realizar o procedimento de acordo com as diretrizes aprovadas pelo instituto. Por exemplo, a maioria das instituições exigirá que a colonização seja conduzida em um capô de nível dois de biossegurança. Se estiver utilizando indicadores de peso como parte de sua forma de monitoramento de endpoint, MA imediatamente após a colonização, monitore os camundongos a cada 12 a 24 horas quanto a sintomas clínicos, incluindo letargia, pêlo eriçado e perda de peso.

Depois que os camundongos forem colonizados, mantenha-os pelo tempo desejado. Ao final desse período, os camundongos serão sacrificados e a lavagem nasal será realizada, pois a luxação cervical pode danificar a traqueia. Este método de eutanásia deve ser evitado.

Antes de realizar lavagens nasais, certifique-se de ter o seguinte em mãos. Agulhas canuladas previamente preparadas, etanol aquoso a 70%, um par de pinças, uma tesoura de íris fina e afiada, fosfato, solução salina tamponada, tampão de lise de RNA e tubos de um mil. Quando estiver pronto para começar, coloque o animal de costas e, usando etanol aquoso a 70%, esterilize a frente de seu pelo, principalmente a área do pescoço.

Tomando cuidado para evitar que o etanol acesse as narinas. Faça um único corte longitudinal ao longo da linha média do pescoço do animal, permitindo-se criar uma abertura para visualizar a traqueia. Retire cuidadosamente a pele para ambos os lados, revelando o tecido do pescoço abaixo.

Neste ponto, a traqueia deve ser visível cercada por músculos longitudinais em ambos os lados. Corte-os cuidadosamente para fornecer uma visão clara da própria traqueia, tomando cuidado para não cortar a vasculatura circundante. No caso de você cortar acidentalmente a vasculatura e o sangue estiver presente na região antes de prosseguir.

Deixe o sangramento parar e, em seguida, limpe a área várias vezes, dispensando PBS estéril e usando gaze estéril para absorver suavemente o excesso de umidade. Assim que a traqueia estiver devidamente exposta, faça um corte semilunar transversal na traqueia na metade. Coloque PBS estéril em uma seringa canulada.

Insira a cânula na traqueia em direção ao nariz, mantendo a borda chanfrada apontando para baixo para facilitar a inserção. Assim que a cânula estiver no lugar, gire a 180 graus e sonde suavemente para cima até sentir resistência leve. Coloque o tubo EEND DPH designado para coleta de amostras logo abaixo do nariz do mouse.

Teste o posicionamento correto da cânula dispensando uma quantidade mínima de fluido de lavagem PBS. Em seguida, uma gota de fluido deve se formar ao redor do NAS do mouse se a cânula for colocada corretamente. Se o PBS de teste emergir diretamente da boca do animal, puxe a cânula para trás e reposicione-a novamente sondando suavemente para a frente até sentir uma resistência muito leve.

Tome cuidado para não empurrar a cânula muito além dessa resistência, pois você a moverá além do palato nasal e até a cavidade oral. Depois de confirmar que a cânula está posicionada corretamente, prossiga para dispensar 200 microlitros de PBS rapidamente para ajudar a deslocar e coletar a quantidade máxima de células. O conteúdo deve fluir pelas narinas do mouse e para o tubo de coleta.

Coloque a amostra imediatamente no gelo. Essas amostras podem ser posteriormente testadas quanto à carga bacteriana, bem como ao recrutamento celular. Para coletar amostras para análise de RNA, use uma agulha canulada separada contendo 500 microlitros de tampão de lise de RNA para realizar uma lavagem nasal secundária.

Observe que o tampão de lise de RNA desnudará o epitélio e destruirá o tecido circundante. Portanto, deve-se tomar cuidado para evitar o contato com órgãos como os pulmões. Se a retenção desses tecidos for desejada para quantificar a carga bacteriana nasofaríngea, você precisará do seguinte.

Os tubos Epicor, placas microbiológicas contendo ovo de soja tríptico são suplementados com 5% de sangue de ovelha. Um misturador de vórtice, pontas de pipeta estéreis PBS e pipetas P 20 e P 200. Primeiro trabalhando em um BSL de dois capuzes, prepare uma série de diluição em série para cada amostra de lavagem nasal de mirin.

Em geral, pode-se esperar que as concentrações de S pneumoniae na nasofaringe estejam entre zero e 10 elevado a quatro UFC. Portanto, conduza uma diluição em série de três vezes por dez, adicione 10 microlitros da amostra de lavagem nasal pura ao primeiro tubo até uma concentração de 10 a menos uma UFC por mil e continue para baixo até diluir três amostras excessivamente em vórtice completamente entre cada diluição. Observe que este vídeo é apenas para fins demonstrativos.

A técnica de laboratório adequada, incluindo a troca das pontas da pipeta entre diluídas, deve sempre ser respeitada Usando um sharpie, divida-o de volta à sua placa lógica em quadrantes e rotule os quadrantes com a diluição correspondente a ser plaqueada nele. Coloque três gotas de amostras de 10 microlitros de cada uma de suas diluições na placa de ágar. Deixe secar por 15 a 30 minutos descobertos, cubra as placas e coloque de cabeça para baixo em uma incubadora bacteriana com condições ideais para o crescimento pneumocócico, normalmente 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Incube essas placas por 24 a 48 horas. Após esse período de tempo, remova as placas e determine o número de bactérias colonizadoras pela média das colônias formadas na placa. Para cada diluição, as colônias de animo podem ser identificadas por sua cor bege distinta, suas zonas de hemólise alfa, que são pequenos halos ao redor de cada colônia, criados pela digestão bacteriana do suplemento sanguíneo no ágar.

E, finalmente, por pequenas depressões no centro de cada colônia que lhe dão a aparência de um eritrócito. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma sólida compreensão de como estabelecer um es pmo nasofaríngeo, colonização em um camundongo, como isolar bactérias e células da nasofaringe de um camundongo após a colonização, usando uma lavagem nasal e como quantificar a carga bacteriana correspondente usando técnicas microbiológicas. Esperamos que os métodos descritos neste vídeo o encorajem a usar um modelo intranasal de colonização para estudar as respostas do hospedeiro a patógenos no contexto desta região pouco estudada.