Name: O Utilitário de Estágio específico-Mid-de-final Drosophila Folículo Isolamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-02T20:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprenda a isolar folículos de Drosophila em estágios médio a tardio para análises moleculares, imagens em tempo real e ensaios de desenvolvimento in vitro. Este método permite estudar oogênese e biologia celular.

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Gostaríamos de agradecer a Thomas Lecuit (SQH-utrophin :: linha GFP), o Bloomington Stock Center, ea Developmental Studies Hybridoma Banco de reagentes. Agradecemos ainda todos os membros do Laboratório Tootle para discussões úteis e críticas do manuscrito. O financiamento da National Science Foundation MCB-1158527, e fundos de arranque da Anatomia e Departamento de Biologia Celular da Universidade de Iowa apoiaram este trabalho. National Institutes of Health Predoctoral Training Grant em Ciências Farmacológicas T32GM067795 apoiado AJS. Suporte de armazenamento de dados foi fornecido pela ICTS, que é financiado através do CTSA apoiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos e do Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translacional, Institutos Nacionais de Saúde, através Grant UL1RR024979.

1. Preparando Drosophila Antes de encenar isolamento <ol><li> Faça molhado pasta levedura, combinando 50 g de fermento seco ativo com 90 ml de água destilada. Misture com uma espátula para combinar. Deixe a mistura repousar por ~ 30 min antes de avaliar a consistência. A consistência deve ser apenas espessa o suficiente para aderir ao lado de um frasco de voar, mas não correr para o lado. Para atingir a consistência desejada, pode ser necessário adicionar-se a 10 ml de água adicional, ou uma pequena quantidade de fermento seco. Guarde em um recipiente coberto a 4 ° C. A levedura armazenada pode ser usada para a ~ 1-2 semanas. </li><li> Colete &lt;24 hr velhas moscas adultas (ambos machos e fêmeas) dos genótipos desejáveis ​​e colocá-los em um frasco com alimentos voar mais molhado pasta levedura manchada no lado do frasco. A temperatura a que as moscas são mantidas irá variar, dependendo da experiência. Para as experiências de rotina, as moscas são mantidas à temperatura ambiente. Considerando que as experiências em que um gene ésendo sobre-expresso utilizando o sistema 15 de maio UAS/GAL4 requerem manutenção das moscas, a 25 ° C ou mais, conforme apropriado. </li><li> Fornecer as moscas com uma nova mancha de levedura pasta por dia durante 2 dias. NOTA: Como o desenvolvimento folicular é rigidamente controlado pelo estado nutricional da mosca fêmea, é essencial para fornecer a voar com o nutriente rico colar leveduras por pelo menos 36 horas antes da dissecção. </li></ol> 2. Isolando Mid-de-final Encenado Drosophila Folículos <ol><li> Permita que os meios de comunicação para atingir a temperatura ambiente (~ 30 min). Se os folículos encenadas vai ser utilizado para ensaios in vitro de desenvolvimento, recentemente preparar meios de IVEM (meios de insecto de Grace, 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor, e 1x penicilina / estreptomicina). Se os folículos encenadas vão ser utilizados para mRNA ou isolamento de proteínas usar qualquer inseto de Grace ou mídia IVEM. IMPORTANTE: temperatura de mídia é fundamental. Se a mídia é frio que vai alterartanto o citoesqueleto de actina e de microtúbulos e desenvolvimento do bloco. </li><li> Anestesiar as moscas no frasco yeasted injetando CO 2 gás e coloque 3-5 moscas fêmeas em uma almofada de mosca sob CO 2. IMPORTANTE: Não deixe mais mulheres do que pode ser dissecados em um período de tempo de 10 minutos na plataforma de fly como a exposição prolongada ao CO 2 pode causar esterilidade e à morte. </li><li> Encha um poço de uma placa 9-ponto com a mídia e coloque-o em cima de uma superfície escura (um pedaço de acrílico preto funciona bem). Concentre o escopo de dissecação sobre a parte inferior do poço. </li><li> Usando # 5 fórceps Dumont pegar uma única fêmea com uma mão (este é o melhor feito usando a mão dominante). Muitas vezes, é mais fácil de pegar a fêmea pelas asas, pernas, tórax ou abdômen para a transição. Submergir o feminino na mídia bem cheios. Ajustar a focagem do microscópio, conforme necessário. </li><li> Usando um segundo par de fórceps na mão não dominante, pegue a fêmea na extremidade anterior do abdômende modo que a extremidade posterior é posicionada para o lado dominante (Figura 2A). Certifique-se de manter a mosca submerso na mídia. </li><li> Com a mão dominante, use a pinça para agarrar a cutícula no 2 º segmento pigmentada mais posterior e rasgá-lo longe do resto do abdômen (Figuras 2B-C). </li><li> Usando a pinça na mão dominante, aperte delicadamente a extremidade anterior do abdome até os ovários emergir (Figuras 2D-E). Se necessário, coloque a pinça entre os dois ovários e puxá-los para fora da carcaça. </li><li> Ou mover os ovários para um novo poço com meio fresco (Figura 2F) ou remover a carcaça de uma toalha ou papel Kimwipe. Isto é particularmente importante se os folículos são isolados para o desenvolvimento in vitro. </li><li> Repita até 3-5 pares de ovários têm sido isolados. NOTA: Cada ovário é composto de ~ 16 ovaríolos ou cadeias de folículos sequencialmente amadurecendo. Cada ovaríoloestá contido dentro de uma bainha de músculo. </li><li> Usando tornos de pinos e as agulhas fornecidas com eles, puxe para além do ovário, executando as agulhas entre os ovaríolos (Figura 2G). Isso às vezes vai liberar os folículos individuais também. </li><li> Ovaríolos individuais e os estágios morfológicos facilmente distinguíveis de desenvolvimento folicular agora deve ser visível (Figura 2G, brincou além ovário). Referem-se Figuras 1 e 2H para diferenças morfológicas que podem ser utilizados para distinguir as diferentes fases. Para isolar os folículos que estão dentro ovarioles intactas e ainda contidos dentro de um invólucro do músculo, utilizar uma agulha de atravessar a ovaríolo no anterior do folículo anterior e na parte posterior do folículo imediatamente após o folículo de interesse. Isto vai quebrar a bainha do músculo e do folículo de interesse distância pode agora ser cortado a partir dos folículos vizinhas, sem danificá-la. </li&gt; <li> Como etapas individuais são separados, mova os folículos de interesse, com uma pipeta de vidro, para um novo poço com meios frescos. Isto é particularmente importante quando se isola folículos para o desenvolvimento in vitro. NOTA: É importante apertar o bulbo da pipeta antes de entrar nos meios de comunicação para evitar que as bolhas de ar de redistribuir os folículos de interesse ao longo do poço. Além disso, se os folículos estão aderindo à pipeta de vidro, a pipeta pode ser pré-revestido com 3% de albumina sérica bovina (BSA), pipetando a solução de BSA cima e para baixo várias vezes e lavagem com meio de dissecação. </li><li> Uma vez que os folículos suficientes têm sido isolados, prosseguir com as experiências posteriores. </li></ol> 3. Desenvolvimento in vitro de folículos S10B <ol><li> Isolar folículos S10B utilizando o protocolo de isolamento de fase (passo 2) em meios IVEM. Certifique-se de que os folículos estão rapidamente se afastou de detritos. Como estes folículos continuará a amadurecer, é important S10Bs que são recolhidos durante 30-60 minutos e, em seguida, colocado no meio de maturação de escolha. NOTA: S10B precisam ser cuidadosamente distinguida de folículos S10A (Figura 1C, em comparação com 1B), como folículos S10A não vencerão nos meios de cultura IVEM. Em ambos S10A e S10B folículos, metade do comprimento é constituído por células de enfermagem e a outra metade é o oócito, mas em S10B o comprimento do folículo é igual à dos folículos S14. </li><li> Usando uma pipeta de vidro, mover ~ 30 folículos S10B para um poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. NOTA: Certifique-se de verificar se todos os folículos sendo transferidos são S10B e não amadureceram para S11. </li><li> Prepare 1 ml de meio de maturação por bem, ou seja, mídia IVEM mais reagentes farmacológicos. </li><li> Usando uma pipeta de vidro * puxado, retire o máximo de mídia do bem (passo 3.2) possível, e rapidamente adicionar mídia maturação de escolha. NOTA: É essencial usar um pip vidro puxadoette como folículos encenado pode ser facilmente absorvido tanto com pipetas de vidro ou pontas de pipeta com um Pipetman. * Para fazer pipetas puxados: 1) aquecer a parte fina de, pipetas de vidro longas na chama de um bico de Bunsen apenas até que o vidro começa a amolecer, 2) mover imediatamente a pipeta para fora da chama e puxar horizontalmente para desenhar a pipeta um tubo fino, 3) quebrar para gerar uma ponta fina. CUIDADO: Use proteção para os olhos como fragmentos de vidro pode voar. </li><li> Repita os passos de 3,1-3,4 para o maior número de poços como o experimento exige. </li><li> Permitir folículos desenvolver para&gt; 10 hr e marcar a progressão do desenvolvimento sob um escopo de dissecação. NOTA: As experiências são geralmente marcados no dia seguinte para dar tempo suficiente para que os folículos se desenvolvem. S10B é ~ 5 horas, S11 é ~ 30 min, S12 é ~ 2 horas, e S13 é ~ 1 hora de duração a 25 ° C 1 e desenvolvimento à temperatura ambiente vai demorar um pouco mais. Experiências semelhantes à descrita para a folículos S10B pode serrealizada utilizando folículos S11-S13. </li></ol> 4. Isolamento Stage for Imaging ao vivo <ol><li> Isolar folículos de fase tardia (S10B-14) expressando o marcador fluorescente de preferência utilizando o protocolo de isolamento de fase (passo 2) em meios IVEM, movendo-se rapidamente para longe folículos de detritos. </li><li> Mova folículos de interesse para novas mídias e, em seguida, transferir, com uma pipeta de vidro para uma placa de Petri inferior lamela. Tome o cuidado de adicionar mídia de modo que bolhas na área de fundo lamela, mas não está sobrando. </li><li> Para filmes de lapso de tempo mais longos, às vezes é necessário para manter a umidade dentro da placa de Petri, adicionando um enrolado Kimwipe, umedecido com água, até a borda interior da placa de Petri. Coloque a tampa na parte superior. </li><li> Imagem de um microscópio invertido. Resolução detalhada exigirá microscopia confocal. É necessário equilibrar a frequência de imagem, a força da iluminação, eo comprimento da imagem, o que terá de ser trabalhado de forma independente para cada lferramenta Abeling e processo de desenvolvimento. </li></ol> 5. Isolamento Estágio de Preparação mRNA <ol><li> Isolar folículos dos estágios individuais usando o protocolo de isolamento de fase (passo 2), quer com meios de comunicação de Grace ou IVEM. </li><li> Usando uma pipeta de vidro, mova os estágios individuais de interesse em novos poços com mídia, é possível coletar vários estágios de uma só vez. </li><li> Mantenha horários de coleta em 1 hora. Mover os folículos, utilizando uma pipeta de vidro, para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Girar o tubo brevemente, em mini-microcentrífuga para sedimentar todas as folículos. Usando uma pipeta de vidro puxado (veja o passo 3.4) remova cuidadosamente todos os meios de comunicação. NOTA: Se estiver usando um tamanho microcentrifuge completo, girar os folículos em baixa velocidade. </li><li> Adicione 100 ml de Trizol e triturar com a mão para ~ 20 segundos usando um pilão de plástico. Gire para baixo em full-speed em uma microcentrífuga e mover Trizol para um novo tubo de 1,5 ml de microcentrífuga com cuidado para não perturbar qualquer d peletizadaebris. Armazenar a -80 ° C. </li><li> Repita os passos de 5,1-5,5 até folículos suficientes foram obtidos para o experimento. Rotineiramente, ~ 75 S10B, ~ 75 S12, S14 e ~ 100 folículos rendimento ~ 10 ug de ARN. </li><li> Descongelar as amostras em gelo. Combinar as amostras, conforme apropriado, em um tubo de microcentrífuga e levar o volume até 800 Trizol ul. Prossiga com o isolamento do RNA, conforme indicado pelo fabricante. IMPORTANTE: Lembre-se de DNase tratar o RNA isolado com RNase DNase livre. </li></ol> 6. Isolamento Stage para Western Blotting <ol><li> Pré-aqueça um bloco de aquecimento a 100 ° C. </li><li> Isolar folículos dos estágios individuais usando o protocolo de isolamento de fase (passo 2), quer com meios de comunicação de Grace ou IVEM. NOTA: É necessário determinar empiricamente quantos de um folículo estágio particular são necessários para observar cada proteína específica. Para proteínas altamente expressas 1-3 S10B folículos / assim é o suficiente para ver um sinal forte em um western blot. No entanto, é importante para fazer umamostra representativa, tendo os folículos de várias fêmeas. Assim, 15-20 folículos de um determinado estágio são normalmente coletados. </li><li> Mover folículos, utilizando uma pipeta de vidro, para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Gire brevemente em um mini-microcentrifuge para agregar os folículos (veja o passo 5.4). Com cuidado, retire toda a mídia usando uma pipeta de vidro puxado (veja o passo 3.4) e adicionar 50 mL de PBS 1x e 50 mL de tampão de Laemmli 2x. </li><li> Moer a mão para ~ 20 segundos com um pilão de plástico. NOTA: pilões de plástico pode ser reutilizado para a moagem de amostras ocidentais por lavagem e o tratamento em autoclave elas. </li><li> Ferver as amostras durante 10 min, no bloco de calor. </li><li> Descontraia brevemente no gelo, girando em velocidade total por 15 segundos em uma microcentrífuga. Ou coloque imediatamente em um gel SDS-PAGE ou armazenar a -20 ° C. NOTA: Se as amostras são armazenadas, lembre-se referver as amostras antes de carregar no gel. </li><li> Realizar análise de western blot seguindo protocolos padrão. </li></ol>

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</ol>

Não há nada a divulgar.

O folículo Drosophila é composto de apenas um pequeno número de tipos de células, tornando-o ideal para ambos morfológica e análises moleculares. Além disso, devido à estrutura do ovário, é relativamente fácil de obter um grande número de fases específicas do desenvolvimento folicular com um escopo de dissecação comum e uma formação mínima. À medida que cada estágio representa uma janela temporal, curto, isolamento fase pode fornecer informações moleculares significativas nos processos de desenvolvimento que oc...

Cada ovário Drosophila é composto de ~ 16 ovaríolos, ou cadeias de sequencialmente amadurecimento câmaras de ovos ou folículos. Cada folículo é composta por um único oócito, células derivadas de enfermagem ou de suporte 15 da linha germinal, e ~ 650 células somáticas denominadas células foliculares (Figura 1A). Drosophila oogénese é dividido em 14 etapas morfologicamente definidas de desenvolvimento 1. Cada fase de desenvolvimento folicular é observado muitas vezes dentro de um único mosca, tornando relativamente fácil de isolar um número substancial dos folículos específica da fase. Os meio-de-final etapas da ovogênese (Stages 10B-14) são particularmente adequados para o isolamento de fase (Figura 1). Na Fase 10B (S10B), o folículo é totalmente alongada (isto é, o seu comprimento é igual à de uma Fase 14 (S14) folículo, ver Figura 1 e Figura 2H) e metade do comprimento do folículo é composto de células enfermeiraenquanto que a outra metade é o ovócito (Figura 1C). Nesta fase, as células passam por enfermeira dramática remodelação da actina, o reforço da actina cortical e gerar feixes paralelos de dois filamentos de actina. Ao mesmo tempo, uma população de células foliculares, chamadas de células centrípetas, migram entre as células e a enfermeira de oócitos, e dois grupos dorsais de células foliculares de tornar especificado para sofrer a migração para formar os apêndices dorsais, aparelhos respiratórios tubulares para o embrião 3 . As células de enfermagem, em seguida, contrato (S11), apertando seu conteúdo citoplasmático para o oócito em um processo chamado de célula enfermeira dumping, que fornece o oócito com os fatores necessários para a conclusão da embriogênese (Figura 1D). As células, em seguida, submetidos a enfermeira morte celular (S12-S13) 4, e as células do folículo e secretar padrão da casca de ovo 5 (Figuras 1E-G). Assim, o fim do oogenesis é rico com um desenvolvimento importanted processos morfogenéticos. Folículos isolados fase meio-de-final (S10B-S14) pode ser usado para uma variedade de fins, incluindo as análises moleculares. Por exemplo, o ARNm a partir de folículos encenadas pode ser isolado por RT-PCR, de microarray, ou análise de RNA-seq. Isto permite que se olhe para a expressão de genes dentro de uma janela de desenvolvimento curto, com apenas alguns tipos de células presentes, e determinar a expressão de genes é alterada por perturbações ou farmacológicas ou genéticas. Isolamento fase também pode ser usado para examinar as proteínas por transferência Western. Tal análise é importante porque ela permite quantificar o nível de expressão da proteína de tipo selvagem em relação mutantes em fases específicas. Apesar de se poder utilizar análises de imunofluorescência para conseguir resultados semelhantes, a quantificação de fluorescência é menos robusta, devido aos requisitos estritos que todos os pixels dentro da gama linear de detecção 6. Além disso, a análise de Western blot pode fornecer outras informações, tals, se a proteína for modificada posttranslationally ou é expressa a partir de uma isoforma específica de splicing. Isolado fases também pode ser utilizado para purificação de proteína, incluindo o fraccionamento subcelular ou coimmunoprecipitation. Isolamento folículo específico-Stage também pode ser usado para ensaios in vitro de desenvolvimento 7 e live-imaging 8. Isolados folículos S10B-S13 continuará a desenvolver a S14 em meios de cultura simples (veja abaixo). É importante notar que os folículos S10A não vai progredir através célula enfermeira despejo usando as condições de cultura discutidas no texto. Temos usado S10B ensaios in vitro de desenvolvimento para definir o papel das prostaglandinas, tanto farmacologicamente e geneticamente, ao regular a remodelação actina utilizando células enfermeira dumping e desenvolvimento como ler-outs 7,9. Do mesmo modo, as fases posteriores do desenvolvimento, também pode ser isolado para determinar os efeitos de tratamentos farmacológicos ou homem genéticaipulations sobre processos específicos, como a migração centrípeta celular, migração apêndice dorsal / formação 10, e morte celular enfermeira. Tais ensaios podem ser utilizados para realizar telas de interacção dominantes ou ensaios, por exemplo, enquanto a heterozigosidade para mutações em pxt ou fascina sozinho não tem nenhum efeito sobre o desenvolvimento in vitro S10B, os folículos de heterozigotos duplas célula enfermeira exposição de dumping defeitos e um bloco em desenvolvimento 9. Além disso, porque S10B-13 pode desenvolver-se em cultura, todos os processos que ocorrem durante este tempo pode ser observada por formação de imagens em directo. Essa imagem pode ser realizado simplesmente usando luz transmitida (se estiver interessado apenas em alterações macroscópicas na morfologia) ou com a microscopia confocal usando moscas transgênicos expressando sondas fluorescentes ou folículos corados com corantes de imagem ao vivo. Imagens ao vivo está sendo usado para fazer avançar substancialmente a nossa compreensão dos processos de desenvolvimento. De fato, imagin viverg de folículos fase tardia ampliou o conhecimento da migração apêndice dorsal, um exemplo de tubulogenesis 10. Esperamos que a imagem ao vivo de processos fase tardia adicionais, incluindo dinâmica de actina durante celular enfermeira dumping, vai fornecer novos insights sobre esses eventos de desenvolvimento. É importante notar que, enquanto S10A e estágios iniciais de desenvolvimento do folículo não vai continuar a evoluir para uma S14 na cultura, live-imagem dos eventos que ocorrem durante os estágios de desenvolvimento é possível, utilizando condições de cultura alternativos 11-14 (ver discussão mais informação). Aqui nós fornecemos protocolos detalhados para isolar folículos fase tardia para qualquer desenvolvimento in vitro e live-imagem, ou análises moleculares (mRNA e isolamento de proteínas).

<table><tbody><tr><td>Levedura Seca Ativa</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Qualquer fonte de Levedura Seca Ativa é boa</td></tr><tr><td>Grace' s Insect Media</td><td>Lonza</td><td>04-457F</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino Inativado por Calor</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050H</td><td>Qualquer FBS Inativado por Calor deve funcionar</td></tr><tr><td>10x Caneta/Strep</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tornos e Agulhas de Pino</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13561-10</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Spot, Nove Poços</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinça Dumont</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>24 placas de vários poços</td><td>Becton Dickinson</td><td>35 3226</td><td>Qualquer placa de cultura de tecidos de 24 poços deve funcionar</td></tr><tr><td>Placas de Fundo de Lamínula (35mm)</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td>A espessura da lamínula dependerá do microscópio/ objetiva sendo usada</td></tr><tr><td>Pipetas de vidro</td><td>Corning</td><td>7095B-5x (para transferência de folículos)</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidro - longas</td><td>Corning</td><td>7095B-9 (para produção de pipetas puxadas)</td><td></td></tr><tr><td>Pilão de amostra (1,5 &mu; l; Livre de RNase/DNase)</td><td>Research Products International</td><td>199228</td><td>Qualquer pilão de plástico que se encaixe em 1,5 &mu; l tubos de microfuge podem ser usados</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr></tbody></table>

o utilitário de estágio específico-mid-de-final<em&gt; drosophila</em&gt; folículo isolamento

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis ou desenvolvimento folicular tem sido amplamente utilizada para fazer avançar a compreensão dos processos biológicos de desenvolvimento e celulares complexos. Este artigo descreve métodos de como isolar folículos estágio médio a tardio (Stage 10B-14) e utilizá-los para fornecer novos insights sobre os eventos moleculares e morfológicas que ocorrem durante as janelas apertados de tempo de desenvolvimento. Os folículos isolados podem ser utilizados para uma variedade de técnicas experimentais, incluindo ensaios in vitro de desenvolvimento, imagens em tempo real, a análise da expressão de mRNA e análise de Western blot de proteínas. Os folículos em estágio 10B (S10B) ou mais tarde vai completar o desenvolvimento da cultura, o que permite combinar perturbações genéticas ou farmacológicas com o desenvolvimento in vitro para definir os efeitos de tais manipulações sobre os processos que ocorrem durante períodos específicos do desenvolvimento. Além disso, porque estes folículos desenvolver-se em cultura, eles são idealmente apropriados para estudos de imagiologia em directo, Que muitas vezes revelar novos mecanismos que medeiam eventos morfológicos. Os folículos isolados também podem ser usadas para análises moleculares. Por exemplo, as alterações na expressão de genes que resultam de perturbações genéticas pode ser definido para janelas de desenvolvimento específicos. Além disso, o nível de proteína, estabilidade e / ou pós-tradução estado modificação durante um estágio específico do desenvolvimento folicular pode ser examinado através de western blot analisa. Assim, o isolamento específico do estágio de folículos Drosophila fornece uma rica fonte de informações em processos amplamente conservadas do desenvolvimento e morfogênese.

Quando o isolamento de fases específicas do desenvolvimento folicular Drosophila é essencial ser capaz de distinguir com precisão os diferentes estágios morfológicos. Isto é um pouco difícil de S10A e S10B, como as células de enfermagem e o oócito cada ocupar metade do comprimento do folículo nestas fases (Figura 1B em comparação com 1C). No entanto, os folículos S10A são mais curtos em comprimento do que os folículos S10B, como os folículos S10B são totalmente alongada e, port...

Isolamento específico do estágio de médio a tarde folículos de Drosophila é útil para uma variedade de fins. Esses folículos se desenvolvem na cultura, o que permite manipulações genéticas e / ou farmacológicos a ser, juntamente com ensaios in vitro de desenvolvimento e de imagem ao vivo. Adicionalmente, os folículos pode ser utilizado para estudos moleculares, tais como isolamento de ARNm e proteína.

O Utilitário de Estágio específico-Mid-de-final<em&gt; Drosophila</em&gt; Folículo Isolamento

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar estágios específicos de folículos oofórios de início a fim para uma variedade de experimentos, incluindo análises moleculares, imagem em tempo real e ensaios de desenvolvimento in vitro. Isso é realizado primeiramente pela dissecação dos ovários e, em seguida, pela separação dos ovários em folículos. Uma vez isolados os folículos de estágios específicos, eles podem ser utilizados para análises moleculares, imagem em tempo real ou desenvolvimento in vitro.No fim das contas, os resultados podem mostrar quais aspectos da oog&ecirc;nese tardia em dros&oacute;fila s&atilde;o regulados por fatores espec&iacute;ficos por meio de manipula&ccedil;&otilde;es farmacol&oacute;gicas e gen&eacute;ticas em combina&ccedil;&atilde;o com esses ensaios. Este m&eacute;todo pode ajudar a responder perguntas-chave nas &aacute;reas de desenvolvimento e biologia celular, tais como a&ccedil;&atilde;o, din&acirc;mica do citoesqueleto, processos morfol&oacute;gicos, g&ecirc;nese tubular e secre&ccedil;&atilde;o e padr&otilde;es da matriz extracelular. Para este protocolo, colete moscas adultas jovens bem nutridas de ambos os sexos dois dias antes do isolamento dos fol&iacute;culos.Se os folículos em estágio forem utilizados para desenvolvimento in vitro, os ensaios devem ter o Meio Ivan recém-preparado à

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Testículos Drosophila melanogaster pode ser rápida e eficiente isoladas dos machos adultos usando agulhas de dissecção. Com a prática, pode-se facilmente isolar em um ou dois dias uma quantidade de testes suficientes para a análise de DNA ou RNA por seqüenciamento de alto rendimento ou mais tradicionais métodos de biologia molecular ou de proteínas para ensaios de anticorpo ou enzima-based.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

Este vídeo descreve um método para remover mecanicamente as membranas córion e vitelina de oócitos maduros de Drosophila previamente fixados. O protocolo apresentado mostra uma demonstração detalhada do procedimento produzindo oócitos compatíveis com ensaios de hibridização in situ fluorescentes.

Remoção mecânica de córion e membrana vitelina: um método para preparar oócitos de Drosophila para observação direta

Tecidos de Drosophila contêm muitas vezes uma mistura heterogénea de tipos celulares. Para examinar a expressão de genes em tipos específicos de células a partir de um tecido em particular, os núcleos podem ser geneticamente marcado e, subsequentemente, isolado usando uma abordagem baseada em afinidade. Isolado núcleos pode ser utilizado para aplicações a jusante, tais como a análise de expressão génica e imunoprecipitação da cromatina.

Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos para Análise de Expressão Gênica

A imunocoloração é uma técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células e proteínas dentro dos tecidos. Ao utilizar a sonicação, o protocolo descrito aqui alivia a necessidade de dissecar tecidos de Drosophila melanogaster de embriões e larvas em estágio avançado antes da imunocoloração. Fornecemos uma metodologia eficiente para a imunocoloração de larvas de montagem inteira fixadas em formaldeído.

Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Este protocolo descreve a dissecção e o cultivo de testículos intactos e cistos germinativos de pupas de Drosophila melanogaster. Este método permite a observação microscópica da espermatogênese ex vivo. Além disso, descrevemos um ensaio farmacológico do efeito dos inibidores em estágios específicos do desenvolvimento de células germinativas em testículos de pupa.

Ex vivo Cultura de Drosophila Pupal Testículo e único macho da linha germinal Cistos: Dissection, Imaging, eo tratamento farmacológico

O método de imagem vertical descrito neste protocolo permite a visualização detalhada dos pólos de um ovo de Drosophila melanogaster em desenvolvimento.  Essa visão final fornece uma nova perspectiva sobre os arranjos e morfologias de vários tipos de células no epitélio folicular.

Imagem Vertical de<em&gt; Drosophila</em&gt; Câmaras de ovo

Apresentamos protocolos para coleta, preparação e imagem de oócitos maduros de Drosophila. Esses métodos permitem a visualização do comportamento cromossômico e da montagem e função do fuso durante a meiose.

Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; oócitos

O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem direta e econômica para a coleta de embriões de Drosophila em escala média (0,5-1 g) e a preparação de extratos de proteínas que podem ser utilizados em aplicações proteômicas a jusante, como a purificação por afinidade - espectrometria de massa (AP-MS ).

Preparação em média<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embrião para experiências proteômicas

Aqui, nós apresentamos um protocolo para dissociar e classificar uma população específica da pilha das glândulas acessórias masculinas de Drosophila (pilhas secundárias) para o sequenciamento do RNA e o RT-qPCR. A isolação da pilha é conseguida com a purificação de FACS de pilhas secundárias GFP-expressando após um processo multistep-dissociation que exige a dissecção, a digestão dos proteases e a dispersão mecânica.

Um protocolo baseado em FACS para isolar o RNA das células secundárias de glândulas acessórias masculinas de Drosophila

Aqui, fornecemos um protocolo de dissecção necessário para a imagem viva da gônada masculina Drosophila . Este protocolo permitirá a observação de processos celulares dinâmicos em condições normais ou após manipulação transgênica ou farmacológica.

Dissecção e Live-Imaging do Drosophila Gonad embrionário tardio

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para realizar imagens ao vivo da divisão assimétrica de células-tronco germinativas (GSCs) no nicho ovariano de Drosophila. Usamos uma linhagem transgênica que expressa de forma ubíqua uma fusão de proteína fluorescente verde (GFP) da proteína do espectrossomo Par-1.

Imagem ao vivo estendida de nichos de células-tronco germinativas de Drosophila melanogaster fêmea

Aprenda a isolar folículos de Drosophila em estágios médio a tardio para análises moleculares, imagens em tempo real e ensaios de desenvolvimento in vitro. Este método permite estudar oogênese e biologia celular.

O Utilitário de Estágio específico-Mid-de-final

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