Name: Exame Drosophila Larval células terminais traqueais por microscopia de luz (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a analisar células terminais traqueais em larvas de Drosophila por microscopia de luz. Este método rápido de fixação térmica permite examinar morfologia de ramificações e lúmens em animais inteiros.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos Gillian Stanfield para comentários sobre o manuscrito. TAJ é apoiado pela Universidade de Utah Genetics Training Grant T32-GM007464 do NIH NIGMS.

1. Geração de Mosaico <ol><li> Cruzamento genético w FRT 19A banheira: GAL80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (do sexo masculino) X * FRT 19A / Bal (fêmeas), onde * representa o mutante para ser examinado. Nota: Configurar atravessar pelo menos um dia antes da experiência, pois isso permite que os animais se acasalar adequadamente. </li><li> Pré-lay: Cruz transferência para frascos voar alimentares com uma pequena mancha de pasta de fermento fresco colocado na mídia. Permitir fixar durante 1 hora a 25 ° C. </li><li> Lay: animais de Transferência de pré-configuração frasco para um novo frasco com uma pequena mancha de pasta de fermento fresco. Permitir a deitar por 6 h a 25 ° C. </li><li> Adultos de transferência de volta ao frasco pré-configuração para armazenamento e uso em experimentos posteriores. Imediatamente choque de calor do frasco contendo leigo 0-6 hr embriões velhos durante 45 min a 38 ° C, num banho de água circulante. Nota: A superfície do alimento deve estar abaixo do nível de água para verificar todosembriões são adequadamente aquecer chocado. </li><li> Incubar calor frascos chocou a 25 ° C por 4-5 dias até larvas de terceiro instar começar a vagar. </li></ol> 2. Tela para Mosaico Animais <ol><li> Usando fórceps finos escolher cuidadosamente errante larvas de terceiro instar a partir dos lados do frasco e colocá-los em refrigeradas glicerol 100% numa pequena placa de plástico. </li><li> Examinar larvas usando um microscópio de alta ampliação de dissecação equipado com óptica fluorescentes. Identificar larvas com expressão mosaico de células de traquéia fluorescente etiquetado. Tipicamente, isto pode ser feito em 10-20X de ampliação. </li></ol> 3. Fixação de calor <ol><li> Utilizando uma pinça fina escolher cuidadosamente os animais mosaico fora do prato e coloque em uma gota de fresco 100% de glicerol em um mm branco vidro lâmina de microscópio 75x25x1. Nota: vários animais podem ser colocados na gota (Figura 1A). Os animais também podem ser colocados numa gota de glicerol sobre uma lamela directamente,mas cuidado deve ser tomado durante a fixação (passo 3.2), já que os animais vão aquecer muito rapidamente e pode tornar-se mais fixo. </li><li> Lugar lâmina de vidro para 70 ° C em bloco de calor até que os animais só parar de se mover, não mais do que 20 segundos para um slide, e 10 seg para uma lamela (Figura 1B). Animais vão torcer inicialmente, mas parar e tornar-se rígida e alongada, uma vez morto. Nota: A exposição prolongada ao calor pode danificar ramos terminais e lúmens, bem como fazer o sinal GFP fraca e difusa. Para a máxima eficiência recomenda-se que o bloco de calor no mesmo quarto que os microscópios. </li><li> Usando fórceps finos orientar cuidadosamente todas as larvas na gota num único sentido, de tal modo que todas as larvas do slide são orientados paralelamente uns aos outros (Figura 1C). </li><li> Suavemente colocar uma tampa de vidro de micro 18x18mm no topo das larvas (ou a lamela invertido sobre uma lâmina de vidro) e evitar a formação de bolhas (Figura 1D). Nota: lamela pode não estar exatamenteplana sobre larvas, isto não é um problema. </li><li> Larvas de Imagem dentro de 30 min. Células terminais fixas de calor irá degradar o sinal de GFP e irá tornar-se muito difusa. </li></ol> 4. Imagem in vivo de células terminais traqueais <ol><li> Coloque deslize no palco de um microscópio estereoscópico composto. Usando um objetivo 5X localizar os dois troncos dorsal paralelas que correm de anterior para posterior na superfície dorsal do animal (Figura 1F). Localize as duas células terminais dorsal, diretamente entre os dois troncos dorsal. Isso ajuda a identificar o segmento apropriado para análise. </li><li> Uma vez orientada, rodar os animais para as células da imagem de terminais desejados. Para fazer isso, empurrar cuidadosamente a lamela na extremidade com a pinça perpendicular ao eixo longo das larvas, rolando lentamente as larvas sob a lamela (Figuras 1E e 1G). </li><li> Selecionando as células terminais apropriados é fundamental para resultados consistentese as comparações entre os mutantes. Células terminais do ramo de gordura corporal (FB) são facilmente encontrados junto ao tronco dorsal, lateral à linha média. As células do Grupo G terminais laterais (LG) são facilmente encontradas e estão localizadas imediatamente lateral da linha média ventral (Figura 1H). Nota: nos (TR10) segmentos mais anteriores (Tr1) e posterior o arranjo de célula terminal é divergente de outros segmentos. Nós só analisar as células terminais em segmentos Tr2-TR9. Células terminais dorsais têm um padrão de ramificação mais estereotipados do que outras células do terminal da traquéia. Isto pode depender de sinais autónomas adicionais, não-celulares, e isso deve ser considerado quando se decide se a incluí-los na análise. </li><li> Uma vez que uma célula de terminal de interesse tiver sido identificado, a captura de uma imagem utilizando a ampliação desejada; tipicamente 10X ou 20X é melhor (Figura 2A). Nota: devido a padrões de ramificação variáveis, tentar capturar imagens que incluem como muitos ramos e dicas ramo como possível. </li><li> Sem mover o palco, desligue a fluorescência e acender a luz transmitida para capturar uma imagem de campo claro da mesma célula e plano focal (Figura 2B). O lúmen será visualizado como escura contrastante dentro do espaço celular terminal. Se planejando quantificar ramos terminais celulares e lúmens, recolher várias imagens em múltiplos planos focais de cada célula terminal. </li></ol> 5. Análise e Quantificação da morfologia celular Terminal Usando ImageJ <ol><li> Abra as imagens fluorescentes e brightfield usando o ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) plug-in NeuronJ ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> ). </li><li> Usando o &quot;Add traçados&quot; ferramenta, traçar manualmente os ramos e lúmen da célula do terminal inteiro. </li><li> Usando a ferramenta &quot;Etiqueta traçados&quot;, renomear e reColor atribuir a cada linha dentro do trace uma designação específica. </li><li> Usando a ferramenta &quot;Definir parâmetros&quot;, ajustar a largura da linha 6-10 pixels (512x512 para imagens obtidas a partir da câmera digital conectada ao microscópio composto. Para câmaras maior ou menor resolução, a largura de pixel deve ser dimensionado de forma adequada), utilizando todos outras configurações padrão e clique em &quot;OK&quot;. Em seguida, use a ferramenta &quot;Faça snapshot&quot; para tirar uma foto. Escolha &quot;Draw trace&quot; para obter um instantâneo do traço que pode ser mostrado, lado a lado com o original. </li><li> Selecione a ferramenta &quot;Measure traçados&quot; e selecione o tipo de rastreamento (ou seja, que se ramifica para medir com base nas designações específicas atribuídas no passo 5.3). Em seguida, selecione &quot;Mostrar medições de rastreamento&quot; e &quot;Limpar medições anteriores&quot; e clique em &quot;Executar&quot;. Isto produzirá uma folha de cálculo que contém o nome, a etiqueta, o comprimento (em pixels), e outros dados para a imagem. Estes dados podem ser salvos como uma planilha do Microsoft Excel para posterior estatísticaanálise. </li></ol>

<ol><li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System%5BTitle%5D)+AND+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li>
<li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li>
<li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Zpr1+%28Zinc+Finger+Protein+1%29+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649(2012).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087(2011).</li>
<li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li>
<li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li>
<li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li>
<li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+GFP%2F%C3%9F-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li>
<li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila%3A+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm concorrentes interesse financeiro.

A técnica de fixação calor aqui descrito é uma ferramenta rápida e conveniente para as células terminais traqueais imagem Drosophila larvas. Aqui, podemos utilizar esta técnica para examinar o padrão de ramificação e do lúmen de células do tipo selvagem. Células de traquéia expressando GFP, impulsionada pelo promotor específico traqueal fôlego, pode ser facilmente visualizado através da cutícula larval após a fixação de calor. Os padrões de ramificação específicos de células individuais do terminal, be...

Forma celular é crítico para a função das células individuais dentro de um organismo, bem como células que funcionam como parte de um tecido ou órgão. Nós usamos células terminais de Drosophila traqueais, um componente do sistema respiratório de insetos, para investigar os mecanismos moleculares que participam no controle de dois tipos conservados de morfologia celular: Desvios e formação do tubo (lumenogenesis). Células terminais estão localizadas nas pontas de uma rede de tubos ramificados que funciona para fornecer oxigénio aos tecidos internos 1 e têm uma morfologia ramificado elaborado, que depende de uma via de sinalização do FGF, que é controlado por níveis de oxigénio dentro dos tecidos locais-alvo 2. Ramos terminais celulares são tubos finos, com cheias de gás lúmen subcelulares que atravessam cada ramo. As arquitecturas celulares distintas de células de terminal, juntamente com a facilidade através da qual a análise genética pode ser realizada em Drosophila, tornar essas células um modelo excelente fou investigar os mecanismos de crescimento celular, a ramificação, e a formação do tubo intracelular. Células Terminal provaram um modelo útil para compreender algumas das vias de sinalização que levam à diferenciação de células ramificadas, conseqüência, e maturação 2-4. Usando este sistema imparcial, telas para a frente genéticos para mutantes morfogênese celular foram realizados, gerando insights sobre os mecanismos que controlam a forma da célula 5,6. Por exemplo, estas telas tenham revelado que um RabGAP específico é necessário para a polaridade do citoesqueleto e o tráfico de vesículas na formação de lúmen e de posicionamento 7, que a adesão mediada pela integrina é necessária para a estabilidade do ramo 8, e que as proteínas de PAR-polaridade epiteliais regular tráfico membrana polarizado necessário tanto para a ramificação e formação de lúmen 9. Outros estudos em células de terminais têm mostrado que a acumulação de actina assimétrica e organização de microtúbulos é necessária para o alongamento das células e lumenogenesis <saté&gt; 10. Assim, diversos mecanismos biológicos, células conservadas contribuir para a morfogénese do terminal da célula. Aqui, descrevemos um método para corrigir rapidamente as larvas Drosophila terceiro instar intacto para análise de células ramificação terminal e formação de lúmen. Este protocolo pode também ser efectuada em ambos os primeiro e segundo instar animais. A chave para esta técnica é a capacidade de visualizar as células terminais que estão geneticamente marcadas através da expressão da proteína fluorescente directamente através da cutícula larval de animais intactos. Uma vez que este procedimento não requer quaisquer manipulações pós-fixação, tais como a coloração do anticorpo, para observar as células, que é bem adequado à análise de alto rendimento, incluindo o rastreio genético ou fármaco. A expressão da proteína fluorescente que revela a estrutura dos ramos cheias de citoplasma. Formação do tubo pode ser controlado em paralelo utilizando microscopia de campo claro para identificar o lúmen cheio de gás, o que contrasta com o ambiente fluido enchatecidos ed. Incluído neste protocolo é o método para a geração de mosaicos genéticos baseados no sistema MARCM 11, para produzir as células terminais mutantes homozigotos marcadas com proteínas fluorescentes em animais unlabeled contrário. Isto é necessário, uma vez que as células terminais só elaborar suas estruturas complexas relativamente tarde no desenvolvimento; mosaicos genéticos permitem a derivação de requisitos de genes em outros tecidos anteriores em desenvolvimento. . Gerar clones MARCM, traquéia são rotulados usando o driver específico-traqueal sem fôlego (BTL) 12 aqui descrito é o protocolo para o cromossomo X Drosophila, por outros cromossomos, um procedimento semelhante pode ser usado, com reagentes genético apropriado para o cromossoma ser examinados. Aqui, a traqueia são rotulados por expressão de uma GFP citoplasmaticamente localizada, mas o procedimento funciona igualmente bem com a expressão de outras proteínas fluorescentes, tais como DsRed. Além disso, nós incluímos um método para quantificar os padrões de ramificação e formação de lúmen em células de terminais, com base em métodos desenvolvidos para a caracterização de padrões de ramificação neuronal 13. Este tipo de dados quantitativos pode ser crítico para discernir o papel exacto de genes no processo de ramificação ou lumenogenesis, bem como permitindo comparações directas entre diferentes mutantes 9.

<table><tbody><tr><td>Aluno Dumont #5 fórceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ16 Microscópio de dissecação (ou equivalente)</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>AxioImager M1 microscópio composto (ou equivalente)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Equipado com AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Conjunto de Filtros 38HE</td></tr><tr><td>100% Glicerol</td><td>BioExpress</td><td>M152-4L</td><td></td></tr><tr><td>Genótipo do estoque</td><td></td><td></td> da mosca<td>: cuba de w FRT19A: GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP e FRT19A</td></tr><tr><td>Genótipo</td><td></td><td></td><td>: e FRT19A</td></tr></tbody></table>

exame<em&gt; drosophila</em&gt; larval células terminais traqueais por microscopia de luz

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Forma celular é crítico para a função celular. No entanto, apesar da importância da morfologia celular, pouco é conhecido sobre as células individuais como gerar formas específicas. Células terminais traqueais Drosophila tornaram-se um modelo genético poderosa para identificar e elucidar os papéis dos genes necessários para a geração de morfologias celulares. Células de terminais são um componente de uma rede tubular ramificada, o sistema traqueal que funciona de modo a fornecer oxigénio aos tecidos internos. Células de terminais são um excelente modelo para investigar questões de forma da célula que possuam duas arquitecturas celulares distintas. Primeiro, as células terminais têm uma morfologia ramificado elaborado, semelhante aos neurónios complexos, em segundo lugar, os ramos celulares terminais são formadas como tubos finos e contêm um lúmen ligada à membrana intracelular. A análise quantitativa do número de células ramo terminal, organização ramo e forma ramo individual, pode ser usado para fornecer informações sobre o papel do mecanismo genético específicomos na confecção de uma célula ramificada. Análise de formação de tubos nestas células pode revelar os mecanismos conservadas do tubulogenesis comuns a outras redes tubulares, tais como a vasculatura vertebrado. Aqui, descrevem técnicas que podem ser usadas para corrigir rapidamente, imagem e analisar os padrões de ramificação e em células de formação de tubo de terminal dentro larvas de Drosophila. Estas técnicas podem ser utilizadas para analisar as células terminais em animais de tipo selvagem e mutante, ou mosaicos genéticos. Devido à elevada eficiência deste protocolo, é também adequada para genético, baseado RNAi, ou telas da droga no sistema de Drosophila traqueal.

Os resultados são mostrados na Figura 2. Um grupo lateral, único (LG) célula do terminal mostra extensa ramificação subcelular (visualizado por GFP; A) e um cheios de gás lúmen subcelulares que atravessa cada um dos ramos (visualizadas por microscopia de campo claro, B). Estas imagens foram coletadas a partir de um mosaico L3 larva, gerado através do sistema MARCM descritos nas seções 1 e 2, eo calor fixa e fotografada, conforme descrito nas seções 3 e 4. Painéis C e D mostram um traço NeuronJ gerado, c...

Aqui, apresentamos um método para análise de microscopia de luz das células terminais traqueal em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas. Este método permite uma análise rápida do ramo lumen e morfologia em animais inteiros e seria útil para a análise dos mutantes individuais ou ecrãs de mutações que afectam o desenvolvimento das células do terminal.

Exame<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval células terminais traqueais por microscopia de luz

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

O objetivo geral deste procedimento é fixar rapidamente larvas de drosófila intactas para poder visualizar a morfologia de ramificações e tubos em células terminais traqueais. Isso é realizado primeiramente gerando células terminais homozigotas marcadas com proteína fluorescente em animais geneticamente mosaicos. O segundo passo do procedimento consiste em coletar larvas mosaicos e fixá-los usando calor.O terceiro passo é a obtenção de imagens de células terminais marcadas em animais fixados, utilizando a expressão de GFP para observar ramificações e microscopia de campo claro para observar tubos. O passo final é a quantificação das morfologias das células terminais. Em última análise, os resultados podem ser usados para distinguir e categorizar distintas morfologias celulares de células terminais selvagens e mutantes.A simples vantagem desta técnica em relação a técnicas existentes, como a fixação química, é que este método é extremamente rápido, podendo assim ser utilizado para análise de alto rendimento de células terminais traqueais. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois escolher larvas L3 e fixá-las rapidamente para preservar sua morfologia exige atenção e cuidado. Para produzir moscas mosaicadas.Utilize a técnica de marcação M com fêmeas portadoras da mutação a ser analisada. Monte os cruzamentos em frascos pré-oviposição com uma camada de pasta de levedura fresca e permita que as moscas depositem ovos por uma hora a 25 graus Celsius. Em seguida, transfira as moscas do frasco pré-oviposição para um frasco novo com pasta de levedura fresca e permita que depositem ovos por seis horas a 25 graus Celsius.Após seis horas, transfira os adultos de volta para os frascos de pré-oviposição para armazenamento e uso imediato em experimentos subsequentes. Submeta os frascos de oviposição coletados a choque térmico em banho-maria circulante por 45 minutos a 38 graus Celsius, garantindo que a superfície do meio esteja abaixo do nível da água para assegurar que todos os embriões sejam adequadamente submetidos ao choque térmico. Em seguida, incube os frascos submetidos ao choque térmico a 25 graus Celsius por quatro a cinco dias, até a fase de larvas de terceiro estágio.Comece a coletar com pinças finas. Retire cuidadosamente as larvas de terceiro estágio em movimento das bordas do frasco e coloque-as em glicerol 100% resfriado em uma pequena placa de plástico. Examine as larvas utilizando um microscópio estereoscópico de alta ampliação equipado com óptica fluorescente, com aumento de 10x ou 20x.Identifique as larvas com expressão em mosaico de células traqueais marcadas com fluorescência. Em seguida, utilizando pinças finas, retire cuidadosamente esses animais e coloque-os em uma gota de glicerol a 100% fresco sobre uma lâmina de microscópio de vidro branca. Vários animais podem ser colocados na mesma gota no mesmo ambiente do microscópio.Coloque a lâmina de vidro em um bloco de aquecimento a 70 graus Celsius até que os animais parem de se mover, o que ocorre dentro de 20 segundos. Inicialmente, os animais se contorcem, mas tornam-se rígidos e alongados. Uma vez mortos, a exposição prolongada leva a danos térmicos nas ramificações terminais, bem como danos aos lúmens.O sinal de GFP torna-se fraco e difuso. O momento da fixação térmica é crítico, pois uma fixação excessiva pode danificar as células, levando a uma análise enganosa ou difícil. Portanto, as amostras devem ser colocadas no bloco de aquecimento e fixadas até que parem de se mover, mas não por mais tempo que isso.Agora, usando pinças finas, oriente cuidadosamente todas as larvas fixadas paralelamente umas às outras. Em seguida, coloque suavemente uma lamínula sobre as larvas, evitando a formação de bolhas. A lamínula pode não ficar exatamente plana, mas isso não é um problema.Nos próximos 30 minutos, realize a imagem dos larvas. Como a fixação térmica degrada rapidamente as células terminais e os sinais de GFP tornam-se muito difusos. Em seguida, coloque a lâmina sobre a platina de um microscópio estereoscópico composto.Usando um objetivo de cinco x, localize os dois troncos dorsais paralelos que percorrem da região anterior à posterior na superfície dorsal do animal. Em seguida, localize as duas células terminais dorsais diretamente entre os dois troncos dorsais. Isso ajuda a identificar o segmento apropriado para análise.Uma vez orientados, gire os animais para imaginar as células terminais desejadas empurrando cuidadosamente a borda da lamínula com uma pinça. Fazer isso perpendicularmente ao eixo longo do animal faz com que as larvas girem lentamente. A seleção das células terminais apropriadas é essencial para resultados consistentes e comparações entre mutantes.As células terminais do ramo do corpo gorduroso são facilmente encontradas adjacentes ao tronco dorsal, laterais à linha média. As células terminais do grupo G lateral são facilmente identificadas e estão localizadas logo laterais à linha média ventral nos segmentos mais anteriores e posteriores. O arranjo da célula terminal é divergente em relação aos outros segmentos.Esses segmentos não devem ser examinados, mas sim concentrar-se nas células e segmentos. As células terminais dorsais TR de dois a nove possuem um padrão de ramificação mais estereotipado do que outras células terminais traqueais. Isso pode depender de sinais adicionais não autônomos celulares, e isso deve ser considerado ao decidir se elas devem ser incluídas na análise.Uma vez identificada uma célula terminal de interesse, capture uma imagem utilizando ampliação de 10x ou 20x devido aos padrões variáveis de ramificação. Tente capturar imagens que incluam o maior número possível de ramificações e pontas de ramificações sem mover o estágio. Desligue a fluorescência e ligue a luz transmitida.Para capturar uma imagem em campo claro da mesma célula e plano focal, a luz será fortemente contrastada dentro do espaço celular terminal. Para quantificar as ramificações celulares terminais e as luzes, colete múltiplas imagens em múltiplos planos focais de cada célula terminal. Algumas células requerem uma única imagem para coletar dados suficientes, entretanto, outras podem necessitar até três imagens individuais em diferentes planos focais.Para capturar todos os ramos, abra as imagens de campo claro com extremidades fluorescentes no ImageJ com o plugin NeuronJ instalado. Utilizando a ferramenta de adição de traçados, trace manualmente os ramos e o lúmen de toda a célula terminal; use a ferramenta de rotular traçados para renomear e recolorir, atribuindo a cada linha dentro do traçado uma designação específica para cinco imagens de 12 por 12 pixels. Use a ferramenta definir parâmetros para ajustar a largura da linha de seis a 10 pixels.Dimensione imagens de maior ou menor resolução conforme necessário. Deixe as outras configurações em seus valores padrão e pressione OK. Em seguida, use a ferramenta de captura de imagem.Para tirar uma imagem, escolha desenhar Traçado para obter uma captura do traçado que pode ser exibida lado a lado com a imagem original. Selecione a ferramenta de medição de traçados e selecione o traçado. Digite os ramos a serem medidos com base nas designações específicas.Em seguida, selecione exibir as medições de rastreamento. Depois, limpe as medições anteriores e clique em executar. Isso gerará uma planilha que contém o nome, o rótulo, o comprimento em pixels e outros dados da imagem a serem salvos para análise estatística.O protocolo descrito foi seguido para analisar células traqueais mutantes em larvas Mosaic L três visualizadas por GFP. A célula terminal do grupo lateral único rotulada como LG apresenta extensa ramificação subcelular ao microscópio de campo claro. Um lúmen subcelular preenchido com gás percorrendo cada uma das ramificações é evidente ao utilizar o Neuron J. Foi realizada uma traçagem das ramificações, bem como uma traçagem do lúmen. Neste animal não mosaic, a célula terminal do corpo gorduroso FB é identificada.Observe que a GFP é expressa em todo o sistema traqueal. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fixar rapidamente imagens e realizar análises quantitativas em células terminais traqueais intactas após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores utilizem as células terminais traqueais como um modelo fundamental para compreender aspectos da morfogênese celular usando células terminais traqueais.

examination-drosophila-larval-tracheal-terminal-cells-light

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós descrevemos um processo para a incorporação de fixação, corte e imagem da fase...

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

Para compreender como as formas de células complexas, como dendritos neuronais, são alcançados durante o desenvolvimento, é importante ser capaz de precisão organização de microtúbulos ensaio. Aqui nós descrevemos um método imuno etiquetagem robusta para analisar a organização dos microtúbulos dos dendritos arborização dendrítica neurônio sensorial, traquéia, músculos e...

Labeling imuno dos microtúbulos no Dendrites neurônio sensorial, traquéias, e Músculos no Drosophila Wall Corpo Larva

Este vídeo descreve a glândula linfática da Drosophila - o local primário de hematopoiese na larva da mosca - e mostra um exemplo de protocolo para dissecar e montar o órgão para imuno-histoquímica e imagens fluorescentes.

Dissecção de glândulas linfáticas larvais: isolando o órgão produtor de hemócitos de Drosophila

Este vídeo descreve a glândula anelar de Drosophila, uma estrutura endócrina complexa importante para a biossíntese e secreção de ecdisteróides e outros hormônios. O protocolo apresentado demonstra sua dissecção, fixação e imunocoloração.

Dissecção da glândula anelar larval: isolamento de órgãos endócrinos de desenvolvimento de Drosophila

Fonte: Jeong, S. Visualização do padrão de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a visualização de projeções axonais em embriões Drosophila. A imunomarcação de neurônios motores, a dissecção precisa para expor estruturas neuronais e a microscopia de contraste de interferência diferencial revelam coletivamente a arquitetura neuronal detalhada, enfatizando os padrões de projeção axonal.

Visualização de padrões de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila

Uma técnica simples e confiável para a visualização e quantificação das vias aéreas motilidade cílios e cílios fluxo gerado usando o mouse traquéia é descrito. Esta técnica pode ser modificado para determinar como uma ampla variedade de factores que influenciam a motilidade dos cílios, incluindo agentes farmacológicos, factores genéticos, exposições ambientais e / ou de factores mecânicos, tais como a carga do muco.

O método ex vivo para High Resolution Imaging de Motilidade Cilia em Rodent Airway Epithelia

A imunocoloração é uma técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células e proteínas dentro dos tecidos. Ao utilizar a sonicação, o protocolo descrito aqui alivia a necessidade de dissecar tecidos de Drosophila melanogaster de embriões e larvas em estágio avançado antes da imunocoloração. Fornecemos uma metodologia eficiente para a imunocoloração de larvas de montagem inteira fixadas em formaldeído.

Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Sistemas hematopoiéticas de mamífero Drosophila e compartilham muitas características comuns, tornando Drosophila um modelo genético atraente para estudar hematopoiese. Aqui demonstramos dissecção e montagem do principal órgão hematopoiético larval para imuno-histoquímica. Descrevemos também métodos para ensaiar vários compartimentos hematopoiéticos larvais incluindo hemócitos circulantes e células de cristal sésseis.

Métodos para examinar a linfa Gland e Hemócitos em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Descrevemos um método para rastreamento retrógrado dos neurônios motores embrionários Drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos.

Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos

Aprenda a analisar células terminais traqueais em larvas de Drosophila por microscopia de luz. Este método rápido de fixação térmica permite examinar morfologia de ramificações e lúmens em animais inteiros.

Exame

Explorar mais vídeos