Optogenetic Perturbação da atividade neural com Iluminação Laser no Semi-intacta

Neste protocolo, iniciamos alimentando a larva de genótipo apropriado com alimento à base de E contendo todo o trans A TR. Cada larva é fixada e dissecada em solução salina normal para substituir a solução salina normal por solução de Ringer com dois milimoles de cálcio e posicionar a preparação de LABA na platina do microscópio. O movimento da LABA dissecada é filmado com uma câmera CCD. Ao iluminar localmente o sistema nervoso, podemos perturbar a atividade neural de um subconjunto de neurônios em um momento específico, ao mesmo tempo em que monitoramos o movimento da mesma preparação intacta.

Olá, sou Tega no laboratório do Dr. A. Olá, sou Hi Kosaka, também no nível Oph do laboratório do Dr. A.

A locomoção é um sistema modelo útil para o estudo de circuitos motores. Devido às técnicas genéticas altamente desenvolvidas neste protocolo, realizaremos manipulação optogenética de neurônios motores enquanto monitoramos o movimento do animal. Ao utilizar lasers no microscópio confocal, um subconjunto de neurônios pode ser estimulado e as respostas motoras à perturbação espaciotemporal desses neurônios podem ser analisadas.

Então vamos começar. Mantenha linhagens de Drosophila de K six G four US CHR two ou K six G four US NPHR em frascos plásticos contendo alimento vivo padrão. Adicione uma solução TL ao fermento na concentração apropriada e misture bem. Espalhe o fermento sobre uma placa de suco de maçã.

Retire o segundo ou terceiro indivíduo em SLA dos frascos. Coloque o indivíduo na placa com espaço de levedura contendo um TR. Cubra a placa com papel alumínio para manter o TR no escuro. Incube o indivíduo a 25 graus C por um período de tempo apropriado.

Esta é uma câmera CCD para visualização do mesmo laboratório intacto. Conecte a câmera CCD a um microscópio confocal convencional com um desprendimento SEMA. Pegue o saguão A TRA e enxágue-os com água.

Para remover os restos de alimento do corpo, coloque a larva com o dorso voltado para cima no prato frio com guarda C. Fixe com alfinetes entomológicos na cabeça e na cauda. Adicione solução salina normal sem cálcio.

Faça uma pequena incisão próxima à cauda com tesoura microcirúrgica a partir da incisão. Faça um corte longitudinal ao longo da linha média dorsal. Tenha cuidado para não danificar o cordão nervoso ventral e os nervos periféricos.

Realize uma pequena incisão lateral do pino da cabeça em cada canto da parede corporal dissecada. Remova os órgãos internos, exceto o cérebro e o cordão nervoso ventral. Substitua a solução salina normal pela solução de ringer com cálcio modelo 2 milhões.

Acople uma objetiva seca de potência total no microscópio confocal e coloque a preparação laboratorial na platina do microscópio. Obtenha uma imagem de transmissão da preparação dissecada com um laser vermelho para localizar o cordão nervoso ventral utilizando o microscópio confocal. Defina a região de interesse na imagem de transmissão; o molde de zoom é útil para determinar a região específica de interesse.

Altere o conjunto de filtros do microscópio para iluminar com luz de 488 nanômetros ou 559 nanômetros. Visualize a parede corporal iluminando o preparado com a lâmpada de halogênio. Monitore o preparado com uma câmera CCD acoplada ao microscópio confocal.

Lembre-se do movimento da parede corporal e comute o feixe de laser apenas para manipular temporariamente as atividades neurais enquanto monitora o movimento peristáltico; o movimento no mesmo preparo intacto é observado e registrado pela câmera CCD. Este laboratório expressa CHL dois em neurônios modernos. Iluminar um ou dois segmentos do cordão nervoso ventral ativa neurônios modernos nos segmentos, o que por sua vez induz a contração muscular nos segmentos correspondentes da parede corporal, estimulando outros segmentos no nervo ventral.

O frio induz contração de outros segmentos do corpo. O NPHL foi expresso em neurônios motores quando alguns segmentos do cordão nervoso ventral foram estimulados com um laser amarelo. A onda propagante foi interrompida no segmento correspondente da parede corporal.

A onda então reiniciou a partir do segmento paralisado quando a eliminação a laser foi desativada. Este protocolo esclarece o procedimento para realizar perturbação optogenética da atividade neural com lasers no mesmo nível circular inativo em movimento. O cordão nervoso ventral e o nervo periférico não devem ser danificados durante essa dissecação para obter estimulação suficiente.

A potência de iluminação deve ser ajustada alterando a potência do laser, a velocidade de varredura ou o número de repetições no microscópio confocal. Este é o protocolo completo. Obrigado por assistir e boa sorte em seus experimentos.