O Em ovo CAM-ensaio como um Xenograftmodel para o Sarcoma

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O objetivo geral deste procedimento é realizar um ensaio de membrana toica de pintinho ou CAM para estudar o comportamento do sarcoma, célula ou enxerto. Isso é feito primeiro fazendo uma janela na casca de um ovo no terceiro dia de incubação. Na segunda etapa, no nono dia de incubação, o material tumoral é preparado.

Então, após a remoção da camada epitelial, o tumor é adicionado ao came Durante a etapa final do dia 16 de incubação, o CAM é fotografado, colhido e fixado em formalina para avaliação histológica. Em última análise, a histologia clássica h e d e a imuno-histoquímica são usadas para demonstrar sarcoma, proliferação celular e vascularização por invasão e reações do hospedeiro. A principal vantagem desta técnica de métodos existentes, como xenoenxerto na maioria dos modelos, é que ela é simples de aprender e relativamente barata.

Ele também permite que você estude uma miríade de atividades associadas à metástase em um período de tempo muito curto e não requer um comitê de ética. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa do sarcoma, como o efeito das interações do hospedeiro do tumor na sobrevivência do tumor, a reconstituição do microambiente tumoral e o recrutamento de células do estroma. As implicações dessa técnica se estendem à terapia personalizada para sarcoma, pois o próprio material do paciente pode ser estudado.

Tudo Esta nova técnica pode nos fornecer novos insights sobre a neurogênese SAR. Também é muito aplicável a outros sistemas, como a oncogênese em geral. Comece usando um bisturi estéril para cortar a amostra do tumor em pedaços pequenos, não maiores que um milímetro cúbico, removendo todas as áreas calcificadas.

Em seguida, pese a amostra e transfira dois a quatro gramas do tecido para um tubo de dissociação. Digerir o tecido em 2,5 mililitros de colagenase dois e 2,5 mililitros de soluções de DN a. Após o processamento do tecido, de acordo com o protocolo de dissociação do tumor H, filtre a suspensão resultante através de um filtro de células de 150 mícrons.

Agora centrifugue a suspensão em uma força centrífuga apropriada, como 100 a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de remover cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta, incubar o pellet em 10 mililitros de lise eritrocitária, tamponar à temperatura ambiente com tação ocasional. Após 10 minutos, adicione 25 mililitros de meio de cultura para interromper a reação depois de girar a suspensão novamente, o pellet deve ser branco, descarte o sobrenadante e adicione cinco mililitros de meio às células e, em seguida, filtre a suspensão através de um filtro de células de 70 mícrons.

Use um contador automático de células para determinar o número de células vivas por mililitro no desenvolvimento. No terceiro dia, insira uma agulha de calibre 18 na ponta do ovo e remova dois mililitros da albumina para diminuir o nível do OVO chorio toda a membrana tóica ou came. Agora aplique um filme adesivo semipermeável na parte superior marcada da concha para evitar o derramamento de partículas da concha no came durante o corte da janela.

Em seguida, faça um orifício de introdução com um pequeno todo na superfície do ovo. Não danificar o came durante a abertura do invólucro é a parte mais complicada do procedimento. Usamos tesouras afiadas segurando-as horizontalmente em uma mão enquanto mantemos o ovo na outra mão.

Agora, use uma tesoura cirúrgica estéril e pontiaguda para cortar uma janela quadrada de um centímetro na casca. O coração pulsante e os vasos adjacentes do embrião devem agora ser visíveis na superfície da gema do ovo. Remova todos os óvulos não fertilizados ou embriões mortos.

Em seguida, sele a janela com mais filme adesivo semipermeável. Depois de girar a suspensão do tumor novamente, ressuspenda o pellet em gel de matriz extracelular resfriado de uma vez 10 a seis células por 100 microlitros de gel. Mantenha esta solução no gelo derretido.

Em seguida, sob fluxo laminar, use uma tesoura cirúrgica estéril para extirpar parte do filme adesivo semipermeável. Remova a camada de células epiteliais tocando levemente no came com uma haste de vidro estéril. Em seguida, adicione 4 gotas de 25 microlitros da suspensão de gel ECM da célula ao came, permitindo que o gel ECM polimerize entre as aplicações.

Desta forma, é criada uma placa aderente contendo as células cancerígenas. Em seguida, sele a janela do invólucro novamente com filme adesivo semipermeável. Após o período de incubação experimental apropriado, use uma tesoura cirúrgica para ampliar a janela da concha, tomando cuidado para não cortar muito baixo.

Em seguida, use uma pipeta para adicionar 300 a 500 microlitros de PBS na seção CAM contendo o material inoculado. Em seguida, fotografe a câmera através de um microscópio de fluorescência estéreo. Em seguida, use uma tesoura estéril para cortar a membrana na borda encostada na casca e coloque o came colhido em uma placa de Petri estéril cheia de PBS ou formaldeído tamponado.

Em seguida, fotografe os lados superior e inferior da câmera, com e sem filtro, como visto. Nesta primeira figura, os enxertos tumorais tornam-se aderentes ao came. Aqui, uma única suspensão celular do material do paciente exibindo uma placa seca e ligeiramente elevada pode ser observada nessas duas imagens.

O enrugamento acentuado da membrana que ocorre após a excisão do came é mostrado. A linha SAO dois forma uma placa de espalhamento sobre o CAM com um aumento distinto da superfície a partir do sétimo dia. Após a inoculação, o sinal GFP permanece forte, indicando células viáveis.

Essas placas contendo células SW 1 3 53 mostram uma diminuição na superfície e tendem a ter um came contraído, o que resulta em uma membrana enrugada. Após a colheita do sétimo dia, o sangramento é frequentemente observado. O sinal DSR diminui à medida que a sonda fluorescente se dilui após muitas divisões celulares, bem como se ocorrer sangramento.

Na maioria dos casos, a reação vascular do CAM é observada à medida que novos vasos tortuosos entram na amostra. Por exemplo, ramificações indicadas pelas pontas das setas e anastomosadas indicadas pelos asteriscos neste sangramento puntiforme indicado pelas setas, também podem ser observadas em toda a placa. Observe a migração das duas células SAOs paralelas aos vasos do came.

Essa reação vascular pode ser visualizada após a excisão do came na vista inferior, mostrando vasos tortuosos ao redor do enxerto ou placa. A reação vascular do CAM é observada no grupo de enxerto tumoral e no grupo de suspensão de células únicas. Evidências histológicas mostram que as duas células SAOs mantêm uma aparência de célula única em todo o volume completo do gel da matriz extracelular, causando um aumento da espessura e do diâmetro da placa.

As células tumorais invadem a camada mesodérmica do came, conforme indicado aqui pela seta, aumentando assim a distância entre as camadas endodérmica e dérmica do came como um zíper de abertura. Conforme indicado pela seta dupla, o padrão de crescimento das células SW 1 3 5 3 e de uma suspensão unicelular do sarcoma consciente de um paciente é mais agrupado com ilhas de células em uma extensão do gel da matriz extracelular. Conforme indicado pela seta, apesar de seu sítio ectópico de crescimento, observamos que as características essenciais e imuno-histoquímicas dos tumores de sarcoma originais foram mantidas no came.

Além disso, os enxertos tumorais tornaram-se revascularizados, como evidenciado pelo aparecimento dos eritrócitos de pintinho nucleados azul-escuros, conforme indicado pelas pontas das setas e encontrado nos vasos, a contagem de células de células KI 67 positivas e KI 67 negativas mostra um aumento constante no número total de células a partir do quarto dia para ambas as linhagens celulares. Após este dia, o número total de células permanece estável sete dias após a inoculação, o número de células positivas para KI 67 e o número total de células começam a diminuir. Uma proporção maior de células positivas para KI 67 é observada perto do came e uma proporção maior de células negativas para KI 67 na superfície da placa é observada.

Uma vez dominado, a técnica cam SA pode ser usada para analisar 50 x em um intervalo de 14 horas ao longo de três dias, se executada corretamente. Colorações e avaliações adicionais h e e podem ser realizadas e requerem três horas por 10 condições Seguindo este procedimento. Métodos adicionais, como imagens de estilo de vida, podem ser realizados para resolver problemas adicionais, como extravasamento ou ização de células cancerígenas marcadas com gripe.

Assim, com o desenvolvimento dessa nova técnica, ela permite que pesquisadores no campo de testes pré-clínicos explorem novos fatores prognósticos e terapêuticos em pacientes com sarcoma. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aplicar o material tumoral no cmaa e como traduzir suas observações microscópicas e microscópicas para uma melhor compreensão das interações do hospedeiro do tumor.