Métodos para a realização Cruzes em Setaria viridis, Um novo sistema de modelo para as gramíneas

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como realizar cruzamentos para cter verus um novo sistema de modelo para as gramíneas. Isso é feito primeiro selecionando, aparando e rotulando o pináculo. O segundo passo é castrar a panícula aparada mergulhando-a em um banho-maria a 48 graus Celsius.

Em seguida, o pináculo aparado é usado como fêmea para polinização por um pináculo que está liberando pólen. A etapa final é colher as sementes duas semanas após a polinização cruzada. Em última análise, a coloração Gus das sementes híbridas putativas é usada para mostrar a eficácia da técnica.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a emasculação física, é que é menos invasiva e relativamente fácil de estabelecer em laboratório. Este método ajudará a acelerar a adoção do cter verus como modelo genético, facilitando a realização de cruzamentos. Para começar, remova uma célula para regar e, em seguida, encha uma bandeja com quatro por nove células com metro Mix 360.

Em seguida, borrife levemente as células e semeie sementes na superfície do solo, uma semente por célula. Em seguida, cubra as sementes com uma camada de solo, borrife a superfície do solo com 0,5 centímetros de espessura para umedecê-las e, em seguida, regue as planícies do fundo. Continue regando as células do fundo uma a duas vezes por dia após a semeadura, tomando cuidado para não regar demais.

Defina as condições da câmara de crescimento para 31 graus Celsius durante o dia e 22 graus Celsius à noite com um tratamento preda de 15 graus Celsius das 8h30 às 9h00. Mantenha também um horário de luz escura de 12 horas e defina a umidade relativa para 50% nessas condições. Satter verus a 10.1 florescerá 21 a 22 dias após a semeadura. Idealmente, a emasculação é realizada à tarde ou à noite.

Selecione o pentáculo primário em cada planta que tenha de uma a cinco flores desabrochando. Em seguida, corte a ponta do pentáculo e remova todas as flores na seção inferior das seções proximais do meio e da base usando uma pinça fina. Se a tiver apenas um décimo a um quinto das flores desabrochando.

Para reter a seção inferior da seção distal, média e superior do meio proximal para posterior corte, corte a ponta e apare as flores da base da panícula. Se uma panícula tiver de um quarto a metade das flores desabrochando, mantenha a seção intermediária proximal para aparar ainda mais e corte a seção intermediária distal. Depois que o pentáculo for cortado, use uma tesoura cirúrgica para aparar levemente as cerdas.

Tome cuidado para reter as cerdas na região que será polinizada para proteger as florzinhas de possíveis danos causados pelo calor. Para cada espigueta, retenha a florzinha madura superior. A florzinha superior terá maior probabilidade de antese no momento da polinização.

Em seguida, remova todas as flores que floresceram e todas as flores imaturas, deixando aproximadamente 20 a 30 flores por pináculo que são distribuídas uniformemente. Em seguida, marque um lado de cada flor com um marcador permanente vermelho. E registre o número de florzinhas na bandeira do pináculo com as seguintes informações, a data da emasculação, a duração e a temperatura na qual a emasculação é realizada.

Depois que a panícula for aparada, remova todos os perfilhos de cada planta para garantir a realocação de mais recursos para o desenvolvimento do pináculo principal. Uma hora antes da emasculação, defina um banho-maria a 48 graus Celsius para o tratamento térmico. Depois de pré-aquecido, dobre suavemente os pentáculos aparados e mergulhe três a quatro de cada vez em água morna por três a seis minutos.

Tenha cuidado para não quebrar a haste do pentáculo. A folha bandeira, que sub tende o pentáculo, não deve entrar em contato com água morna. Isso é para evitar danos causados pelo calor ao tecido foliar.

Uma vez realizada a emasculação pela duração desejada, remova as panículas do banho-maria e sacuda suavemente a água da panícula. Em seguida, cubra totalmente a panícula castrada com um saco de pão microperfurado personalizado e prenda-o com um laço de torção. Os micro sacos de pão perfurados podem ser personalizados de acordo com o tamanho da panícula.

Por fim, coloque as plantas de volta na câmara de crescimento até o dia seguinte. Às 9:00 da manhã no segundo e terceiro dia, mova os pais fêmeas emasculados e os machos não emasculados da câmara de crescimento para o laboratório para realizar cruzamentos, observar e adicionar outro vermelho. para as flores que floresceram ou estão florescendo.

Usando um marcador permanente vermelho, registre o número total de flores desabrochadas por panícula. Em seguida, registre a data da polinização e o nome do pai masculino na etiqueta para acompanhar quais cruzamentos foram realizados. Observe o horário de pico da antítese em pais masculinos em nossas condições de laboratório, as flores nos pentáculos do pai masculino começam a abertura síncrona por volta das 10h10 Uma vez abertas, o esforço completo da antera e a liberação de pólen ocorrerão após 20 minutos.

Inicie a polinização imediatamente quando amarelado. As anteras brancas são visíveis nas flores do pai masculino. As polinizações são realizadas no segundo e terceiro dias usando panícula para polinização por panícula ou antera para polinização por estigma.

Usando uma panícula destacada enquanto o macho, esfregue suavemente a panícula junto com a panícula emasculada para facilitar a polinização e descarte a panícula masculina para evitar contaminação, repita o processo de polinização até que cada pináculo emasculado tenha sido polinizado por dois a três pentáculos. O método mais eficaz é a polinização antes do estigma usando fórceps. Escolha uma flor que esteja florescendo com anteras brancas amareladas ou colha anteras e toque fisicamente o estigma da flor na mãe feminina.

Use uma flor do pai masculino para polinizar uma flor na panícula emasculada entre as polinizações de diferentes pais masculinos. Mergulhe a pinça em etanol a 95%, seguida de limpeza com lenços umedecidos Kim para evitar contaminação devido ao transporte de pólen entre diferentes cruzamentos. Uma vez realizada a polinização, cubra a panícula da mãe com um saco de pão microperfurado personalizado e prenda-o na base usando uma gravata de torção.

Após a polinização até a colheita das sementes, colha as sementes 14 a 16 dias após o dia da polinização e coloque a etiqueta no mesmo envelope das sementes. Sementes com marcas vermelhas em ambos os lados representam as sementes que resultaram do cruzamento genético controlado. Descarte todas as sementes sem marcas vermelhas, pois representam as sementes resultantes de flores recém-desenvolvidas.

Após a emasculação das sementes com manchas vermelhas, apenas de um lado provavelmente representarão as sementes resultantes da autopolinização. Finalmente, seque as sementes a 30 graus Celsius por dois dias. Armazene as sementes secas no laboratório ou, de preferência, em uma câmara de sementes.

Quando estiver pronto para uma análise mais aprofundada, remova as fises, se necessário. Os métodos descritos neste vídeo foram o resultado de vários ensaios usando diferentes temperaturas e tempos de tratamento para otimizar o processo de emasculação. O sucesso desse processo foi medido pelo número de sementes híbridas obtidas.

Seis sementes de um dos cruzamentos de teste onde o pai do sexo masculino carregava um repórter. A codificação do gene para beta glucuronidase é mostrada aqui. O gene repórter faz com que a semente fique azul quando corada, tornando o número de sementes híbridas fácil de contar Uma vez dominado, até 15 pentáculos podem ser cruzados por dia se o procedimento for realizado corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar cruzamentos em Aria verus.