Name: Viva Imagem Ensaio para Avaliação das Funções de Ca 2 + E esfingomielinase na reparação de Pore-formando feridas Tóxicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 25 s
Description: Aprenda a utilizar o corante lipofílico FM1-43 em imagem de células vivas para medir a cinética de remoção de toxinas formadoras de poros da membrana plasmática. Este ensaio sensível avalia os requisitos de cálcio e esfingomielinase para reparo celular.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R37 AI34867 e R01 GM064625 a NWA Agradecemos ao Dr. R. Tweten da Universidade de Oklahoma para a expressão plasmídeo SLO.

1. Transcricional silenciamento de ASM <ol><li> Semente de 1,5 x 10 5 células HeLa em 2 ml de DMEM meio de crescimento (DMEM de alto teor de glucose com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 1% de Penn-Strep) em pratos de fundo 35 milímetros de vidro (MatTek) e incubar durante a noite a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. </li><li> No dia seguinte, aspirado de fora os meios de crescimento e substituí-la com 2 ml de DMEM reduzida meio de soro (DMEM com 4% de FBS), pelo menos 1 hr antes de adicionar a mistura de transfecção siRNA. </li><li> Prepare quatro tubos para a mistura de oligo transfecção siRNA. Em tubos A e C, adicionar 250 uL de Optimem soro reduzida e 4 ul de Lipofectamina RNAiMax, por 35 milímetros prato a ser transfectada. No tubo B, adicionar 250 mL de Optimem reduzido soro e 8 mL (160 pmol) de controle de conteúdo GC médio oligo (Controle siRNA), por 35 milímetros prato a ser transfectadas. Em tubo D, adicionar 250 mL de Optimem reduzido soro e 8 mL (160 pmol) de SMPD1 oligo (siASM), por 35 milímetros prato to ser transfectados. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Combinar os tubos A e B para formar o complexo de transfecção para o Controle de siRNA, e tubos de C e D para o ASM siRNA. Incubar as reacções à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Adicionar as misturas de reacção a transfecção de controlo siRNA e ASM siRNA lentamente, gota a gota, para os respectivos pratos de fundo de 35 mm de vidro e incubar a 37 ° C / 5% de CO 2. Às 24 horas após a transfecção, aspirar delicadamente fora da mídia e substitua-o por meio de crescimento fresco DMEM. Para eficiente knockdown ASM, os pratos devem ser ainda incubada a 37 ° C / 5% de CO 2 durante cerca de 31 horas (total de 55 horas) antes de imagens em tempo real. </li></ol> 2. Preparação de Reagentes para Live Microscopia <ol><li> Prepara-se uma solução de toxina recombinante formador de poros estreptolisina O (SLO), a uma concentração de 100 ng / mL em PBS frio 1x sem Ca 2 + e Mg 2 +. A SLO utilizado nestes ensaios é um constitutivelmutante y activo cisteína que não requer agentes para reduzir a actividade, gentilmente fornecido pelo Dr. Rod Tweten, University of Oklahoma. A toxina foi expressa em E. coli BL21 DE3 e purificado sob condições nativas, como descrito previamente 16. </li><li> Preparar a solução de estoque FM1-43: Ressuspender FM1-43 em pó liofilizado em DMSO para criar uma solução de 25 mM. </li><li> Preparar a solução de A: Diluir a solução estoque FM1-43 em DMEM frio com Ca 2 + para uma concentração final de 4 | iM (1,5 ml são necessários por MatTek prato) e armazenar em gelo até ser necessária. </li><li> Prepare a Solução B: Diluir a solução estoque FM1-43 em DMEM frio, sem Ca 2 + e 10 mM de EGTA (Ca 2 +-DMEM livre) para uma concentração final de 4 | iM (1,5 ml necessários por MatTek prato) e armazenar em gelo até necessário. </li><li> Pré-quente (37 ° C) 1 ml de solução A e solução B, em tubos de Eppendorf. </li><li> Mantenha em soluções de gelo de DMEM com Ca 2 + e Cum DMEM 2 sem +. </li></ol> 3. Imagens de células vivas de FM1-43 Influx em SLO tratadas e células não tratadas <ol><li> Encher um recipiente metálico raso de tamanho médio com gelo moído, invertê-lo num recipiente de vidro grande com gelo, e adicionar gelo adicional deixando apenas a superfície do fundo do recipiente de metal exposto. Coloque uma toalha de papel molhado na parte inferior metal exposto para permitir a transferência, mesmo térmica. </li><li> Pegue um tratado com siRNA controle prato MatTek (Amostra 1) e coloque-a sobre o papel toalha molhada fria. Gentilmente aspirar fora todas as mídias e lavar 3x com frio Ca 2 + livre DMEM. Após a última lavagem, aspirar fora todas as mídias no prato. </li><li> Para imagem associada à célula FM1-43 em células sem SLO ferida (Exemplo 1) na presença de Ca2 +, adicionar 180 mL de solução fria B para a lamela de vidro do centro do prato de fundo de 35 mm de vidro e incubar durante 5 min em gelo (Tabela 1). </li&gt; <li> Coloque MatTek prato na plataforma de um microscópio confocal de aquecida a 37 ° C e equipado com uma câmara ambiental (o qual mantém a temperatura, a humidade e os níveis de CO 2). Encontre o campo de células que será fotografada olhando através de um 1,3 objetiva de 40X NA (Nikon). Se estiver disponível, ligue PerfectFocus ou um dispositivo semelhante para corrigir a deriva térmica. </li><li> Adicionar 1 ml de solução A pré-aquecido suavemente para o lado do prato de 35 mm e substituir tampa do compartimento do meio ambiente (Tabela 1). </li><li> Adquirir imagens para 4 min a 1 frame a cada 3 s usando software de imagem apropriado (Volocity no sistema de microscopia confocal disco giratório UltraView Vox Perkin Elmer). Excitação de FM1-43 é realizada com uma linha de laser 488 nm, utilizando um filtro dicróico com uma banda de passagem de 488 nm e de emissão de discriminação é conseguido através do uso de um filtro de emissão de 527 (W55). Níveis de potência do laser e sensibilidade da câmara são definidas para atingir exposições de imagem de 100 ms. </li><li> Repita os passos 3.2 a 3.6 para detectar FM1-43 em células de controlo tratadas com siRNA sem ferimento SLO (Amostra 2), na ausência de Ca2 +, excepto que devem ser adicionadas no passo 3.5 Solução B (Tabela 1). </li><li> Para medir a FM1-43 fluxo em células tratadas com siRNA de controlo feridos com SLO quer na presença (Exemplo 3) ou ausência de Ca2 + (Exemplo 4), adicionar 180 mL de solução fria B contendo SLO para a lamela de vidro do centro 35 mm prato fundo de vidro e incubar por 5 min no gelo como no passo 3.3. Repita os passos 3,2 por 3,6; ajustar adicionando ou Solução A Solução B ou no passo 3.5 (Tabela 1). </li><li> Para determinar o papel da ASM no reparo da membrana plasmática, repita os passos 3,2-3,6 usando células tratadas com siRNA ASM para todas as condições (amostras 5-8) (Tabela 1). </li><li> Para determinar o papel de esfingomielinase extracelular recombinante (SM) nacinética de reparação da membrana plasmática (reflectidos pela inibição em FM1-43 afluxo) (Exemplos 9-10), SM é adicionado (0-50 mU), quer da solução A ou solução B na etapa 3.5 e, em seguida, adicionado às células durante células vivas imagiologia de um volume total de 1 ml (Tabela 1). </li></ol> 4. Quantificação de FM1-43 em células Afluxo <ol><li> Após os filmes tenham sido adquiridos, medir a intensidade de fluorescência intracelular de FM1-43 usando o software de análise de imagem (Volocity Suite, PerkinElmer). Desenhar uma região de interesse na região citosólica de cada célula no campo e aplicar as ferramentas de software para determinar a FM1-43 intensidade média de fluorescência ao longo de todos os quadros de vídeo. </li><li> Para ajustar as variações na inicial FM1-43 coloração, os dados para cada vídeo é expresso como vezes de aumento na intensidade de fluorescência ao longo do tempo, e representada para cada condição diferente. O vezes de aumento na fluorescência de cada ponto de tempo individual porcélula é calculada como F T / F 0, onde T é F a fluorescência média no ponto de tempo específico, e F 0 é a fluorescência média em t = 0 (Figuras 1-2). </li></ol>

<ol><li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeilbrunn%2C+L+%22The+dynamics+of+living+protoplasm%22">The dynamics of living protoplasm</a>. , Academic Press. (1956).</li>
<li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChambers%2C+R+%22Explorations+into+the+nature+of+the+living+cell%22">Explorations into the nature of the living cell</a>. , Harvard University Press. (1961).</li>
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<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Tam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+of+acid+sphingomyelinase+by+wounded+cells+promotes+endocytosis+and+plasma+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair.</a> J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).</li>
<li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J. Vis. Exp. (52), e2717(2011).</li>
<li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol-dependent+cytolysins%2C+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li>
<li>Zha, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingomyelinase+treatment+induces+ATP-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).</li>
<li>Buckley, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+three+membranes.+Channel+formation+by+aerolysin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin.</a> FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 Forthcoming.</li>
<li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin%2C+lysenin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Estudos anteriores sobre o prejuízo e membrana plasmática reparo mecânico contou com diversos mecanismos de células ferindo, desde soltando pérolas de vidro, micropipetting, corte, arranhão ou raspagem. A leitura de todos estes ensaios foi qualitativa do que quantitativa, e não dar informações precisas sobre a cinética do mecanismo de reparo. A capacidade das células para voltar a selar a sua membrana de plasma após estas formas de lesão foi medida através da presença ou ausência de marcadores adicionados ao fluido extr...

Ele tem sido conhecido há várias décadas que o reparo da membrana plasmática após a lesão mecânica é um 1,2 Ca 2 + processo-dependente. Estudos posteriores mostraram que o influxo de Ca2 + através da ferida provoca um processo de vigorosa de exocitose de vesículas intracelulares no local da lesão, que é necessária para selar 3,4. A taxa de perda de um corante fluorescente carregados para o citoplasma das células foi usada para avaliar a velocidade de reparação, e concluiu que resselagem foi completada dentro de &lt;30 seg após a lesão 5. Dois modelos foram inicialmente propostos para explicar a exigência de exocitose no reparo da membrana plasmática: 1) o modelo de &quot;patch&quot;, que sugeriu que influxo de Ca2 + através da lesão desencadeia fusão inicialmente homotipica de vesículas intracelulares, formando um grande &quot;patch&quot; que faria em seguida, ser aplicado para a membrana plasmática para selar a ferida 6 e 2) o modelo de redução de tensão, que propôs que a membrana added por Ca 2 + dependente de exocitose na vizinhança da ferida iria reduzir a tensão da membrana plasmática, o que facilita a nova selagem da bicamada 7. O papel do Ca 2 +-exocitose desencadeado no reparo da membrana plasmática foi reforçada por estudos que mostram que os lisossomos contêm uma molécula de Ca 2 + sensor, sinaptotagmina VII, o que facilita a sua exocitose e reparo da membrana plasmática das células lesadas 8,9,10,11 . No entanto, a evidência adicional indicou que exocitose por si só não foi suficiente para promover a reparação da membrana plasmática. Além lágrimas mecânicas na membrana do plasma, uma forma comum de lesão celular é a permeabilização de toxinas formadoras de poros produzidos por bactérias ou células imunitárias 12,13 14,15. Ao contrário de lágrimas mecânicos, proteínas formadoras de poros se inserir na membrana plasmática formando uma poro revestido a proteína estável, que não pode ser fechado de novo, simplesmente por aplicação de uma membrana de &quot;remendo&quot; ou por reduçãoção de tensão de membrana. Curiosamente, os estudos revelaram que as células de mamíferos têm um mecanismo eficaz para reparar a sua membrana de plasma após a permeabilização com proteínas formadoras de poros, e esse processo também requer a presença de extracelular de Ca 2 + 12. Esta descoberta levantou a questão de saber se a remoção transmembranar poros da superfície da célula, também é um processo rápido, tal como observado com feridas mecânicas 5. Surpreendentemente, os nossos estudos recentes mostraram que a nova selagem de células permeabilizadas com toxinas formadoras de poros tem propriedades muito semelhantes às da reparação de feridas mecânicas: o processo requer extracelular de Ca 2 +, e é completado dentro de ~ 30 segundos. Investigando esse processo com mais detalhes, que recentemente descobriu que, além de Ca 2 + exocitose regulada de lisossomos, reparo da membrana plasmática envolve uma forma rápida de endocitose, que é desencadeada pela liberação da enzima esfingomielinase ácida lisossomal (ASM) e é essencial não só para poe remoção dos poros transmembranares, mas também para a reparação de feridas mecânicos 16. Para determinar a cinética de relacração celular após permeabilização com proteínas formadoras de poros, em nosso laboratório, adaptado de uma metodologia de imagens ao vivo que tinha sido usado anteriormente para avaliar a nova selagem de fibras musculares isoladas ferido a laser 17. Este ensaio baseia-se nas propriedades do corante lipofílico FM1-43, que se intercala estavelmente no folheto exterior de bicamadas lipídicas aumento na intensidade de fluorescência. Quando a bicamada da membrana do plasma é interrompido ganhos corante extracelular acesso às membranas intracelulares, fornecendo um ensaio sensível para detecção de lesões da membrana plasmática e reparar 18,16,19,20. Para adaptar este ensaio para a avaliação de resselagem célula após permeabilização com proteínas formadoras de poros, se as células pré-incubadas a 4 ° C com a toxina bacteriana estreptolisina O (SLO), que se liga ao colesterol da membrana 21. Célula Synchronouspermeabilização pode, então, ser facilmente conseguido movendo as células de gelo para aquecer meio de uma fase de microscópio aquecida, a qual ativa a oligomerização e as alterações na conformação que leva à formação de poros transmembranares. Uma vantagem desta abordagem, ao longo dos ensaios publicados anteriormente usando o ferimento a laser, é de que um maior número de células podem ser analisadas simultaneamente num campo microscópico, proporcionando uma melhor amostragem da população de células. Dadas as semelhanças entre o processo de mecanicistas resselagem celular observada após a lesão mecânica e permeabilização com toxinas formadoras de poros, o ensaio aqui descrito proporciona um método muito versátil e eficiente para factores envolvidos no processo fundamental de reparação da membrana plasmática de dissecação. Como exemplo, mostra-se que é possível utilizar este ensaio para identificar os passos de Ca 2 + dependente e independente do processo de reparação.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagente</td></tr><tr><td>HeLa 229 linha celular</td><td>ATCC</td><td>CCL2-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Alta Glicose </td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Alta Glicose Sem Cálcio</td><td>Invitrogen</td><td>20168</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Optimem Soro Reduzido</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778</td><td></td></tr><tr><td>Conteúdo médio de controle GC RNAi oligo</td><td>Invitrogen</td><td>12935300</td><td></td></tr><tr><td>SMPD1 RNAi oligo</td><td>Invitrogen</td><td>HSS143988</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal Inativado por calor</td><td>Gemini-Bioproducts</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Esfingomielinase de Bacillus cereus</td><td>Sigma</td><td>S7651</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de fundo de vidro de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C9100-50</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de disco giratório</td><td>PerkinElmer</td><td>UltraViewVoX</td><td></td></tr><tr><td>Análise de software software</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity Suite</td><td></td></tr><tr><td>Câmara ambiental</td><td>Dispositivos de patologia</td><td>Câmara do sistema</td><td></td> LiveCell</tr></tbody></table>

viva imagem ensaio para avaliação das funções de ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; e esfingomielinase na reparação de pore-formando feridas tóxicas

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Lesão da membrana plasmática é um evento freqüente e feridas têm de ser rapidamente reparado para garantir a sobrevivência celular. Influxo de Ca2 + é um evento chave de sinalização que desencadeia a reparação de feridas mecânicas na membrana de plasma no interior ~ 30 seg. Estudos recentes revelaram que as células de mamíferos também selar sua membrana plasmática após permeabilização com poros formando toxinas em um processo de 2 + dependentes de Ca que envolve a exocitose da esfingomielinase ácida enzima lisossomal seguido por poro endocitose. Aqui, nós descrevemos a metodologia utilizada para demonstrar que os fechos das células permeabilizadas pela toxina estreptolisina também é rápida e dependente de influxo de Ca2 +. O desenho do ensaio permite a sincronização do evento lesão e uma medição precisa da cinética da capacidade de células para restaurar a integridade da membrana plasmática por imagem e quantificar o grau pelo qual o corante liphophilic FM1-43 às membranas intracelulares. Este live als ensaioo permite uma avaliação da sensibilidade da capacidade de exogenamente adicionados factores solúveis, tais como a esf ingomielinase para inibir a FM1-43 afluxo, que reflecte a capacidade de células para reparar a sua membrana plasmática. Este ensaio permitiu demonstrar pela primeira vez que esfingomielinase actua a jusante de Ca 2 + dependente de exocitose, desde adição extracelular da enzima promove a re-selagem de células permeabilizadas, na ausência de Ca 2 +.

Baixas concentrações de reparo da membrana plasmática bacteriana esfingomielinase (SM) de resgate em células empobrecido em esfingomielinase ácida lisossomal. Usando o ensaio de imagiologia FM1-43, que mostraram previamente que as células deficientes para a enzima lisossomal ASM e expostas a SLO ferindo na presença de Ca2 + têm um defeito membrana plasmática é resgatado pela adição extracelular da enzima humana recombinante 19. Desde o ASM lisossomal humana tem um pH óptim...

Imagens ao vivo de células expostas ao corante lipofílico FM1-43 permite a determinação precisa da cinética pelo qual as toxinas formadoras de poros são removidas a partir da membrana plasmática. Este é um ensaio sensível, que pode ser usado para avaliar os requisitos para Ca 2 +, esfingomielinase e outros factores de reparação da membrana plasmática.

Viva Imagem Ensaio para Avaliação das Funções de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E esfingomielinase na reparação de Pore-formando feridas Tóxicas

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar o corante lipofílico FM 1 43 na microscopia de células vivas para medir a cinética precisa da remoção de toxinas de baixo desempenho da membrana plasmática. Isso é realizado primeiramente por meio da pré-ligação da toxina a quatro graus Celsius. O segundo passo consiste em transferir a placa para a platina aquecida do microscópio e encontrar um plano focal no qual as células possam ser visualizadas.Em seguida, adicione o meio pré-aquecido apropriado e inicie imediatamente a aquisição de imagens. O passo final é analisar e quantificar a fluorescência intracelular do FM 1-43. Em última análise, este ensaio sensível pode ser utilizado para avaliar os requisitos de cálcio, fungo, mielina e outros fatores para a reparação da membrana plasmática.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o ferimento a laser, é que este ensaio de permeação por SLL permite a formação sincronizada de lesões na membrana plasmática que são muito uniformes em tamanho após o disparo da celulação. A imagem em tempo real de células vivas com a entrada de corante lipofílico permite a determinação precisa da cinética do reparo da membrana

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui descritos são protocolos utilizados para visualizar o processo dinâmico de MG53 mediada por reparação de membrana celular em animais inteiros e em nível celular. Estes métodos podem ser aplicados para investigar a biologia das células do plasma resealing membrana e medicina regenerativa.

Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas

Este vídeo demonstra um ensaio para estudar a eficiência de reselamento da membrana plasmática em células de mamíferos. As células são expostas a uma toxina bacteriana formadora de poros, que forma poros na membrana celular. Na presença de íons de cálcio extracelulares, o poro causa influxo de cálcio, induzindo eventos de resselamento da membrana. A eficiência de reselagem é avaliada usando corante de iodeto de propídio de ligação ao DNA, que só entra nas células sem uma membrana resselada.

Um ensaio baseado em fluorescência in vitro para medir a eficiência de resselamento da membrana plasmática

O processo de cura de feridas envolve as células tráfico de proteínas específicas e os compartimentos intracelulares para o local da lesão da membrana celular. Este protocolo descreve os ensaios para monitorar esses processos.

Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo

A pele adulta de C. elegans é um modelo tratável para estudos de respostas epiteliais de feridas, incluindo fechamento de feridas, formação de cicatrizes e imunidade inata.

Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no C. elegans

Aqui, é descrito um método que utiliza um sistema de infecção baseada inserção membrana permeável para estudar os efeitos de estreptolisina S, uma toxina segregada produzida por Streptococcus do grupo A, em queratinócitos. Este sistema pode ser facilmente aplicado ao estudo de outras proteínas bacterianas segregadas em diferentes tipos de células hospedeiras durante a infecção.

Implementação de um Sistema de Infecção baseado em Inserir Permeável Membrana para estudar os efeitos de secretada bacterianas toxinas em células hospedeiras de mamíferos

Membrana celular ferindo através de dois fotões laser é um método amplamente utilizado para avaliar a capacidade de fechamento de membrana e pode ser aplicado a vários tipos de células. Aqui, descrevemos um protocolo para em vitro viver de imagem membrana efectuou em dysferlinopathy paciente células após ablação a laser de dois fotões.

Ensaio de reparação da membrana celular usando um microscópio de dois fotões Laser

Aqui nós descrevemos um alta produtividade baseada em fluorescência do ensaio que mede a membrana plasmática, efectuou a eficiência por meio de análises fluorométrica e da imagem latente em células vivas. Este ensaio pode ser usado para triagem de drogas ou genes-alvo que regulam a membrana plasmática de fechamento em células de mamíferos.

Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

Descrevemos um não-invasivo na vivo de imagem protocolo que é simplificada e custo-benefício, utilizando o L-012, um analógico-luminol quimioluminescente, para visualizar e quantificar as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas em um modelo do rato excisional ferido.

Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

A inativação a laser assistida por cromóforos (CALI) mediada por AlPcS2a é uma ferramenta poderosa para estudar danos espaço-temporais de vesículas intracelulares (IVs) em células vivas.

Uma abordagem fotodinâmica no estudo da função da ruptura de vesículas intracelulares

Apresenta-se aqui um protocolo que utiliza promastigotas maiores de Leishmania para determinar a ligação, citotoxicidade e sinalização induzidas por toxinas formadoras de poros. É fornecida uma prova de conceito com estreptolisina O. Outras toxinas também podem ser usadas para alavancar os mutantes genéticos disponíveis em L. major para definir novos mecanismos de resistência a toxinas.

Decifrando o Mecanismo Molecular e a Função das Toxinas Formadoras de Furos Usando Leishmania Major

O método de punção termoplasmônica integra microscopia confocal, pinças ópticas e nanopartículas de ouro para estudar as respostas proteicas durante o reparo da membrana plasmática em células e vesículas unilamelares gigantes. A técnica permite a punção rápida e localizada da membrana, permitindo a identificação de proteínas-chave e seus papéis funcionais na intrincada maquinaria de reparo da membrana plasmática.

Uma Abordagem Termoplasmônica para Investigação do Reparo da Membrana Plasmática em Células Vivas e Membranas Modelo

Aprenda a utilizar o corante lipofílico FM1-43 em imagem de células vivas para medir a cinética de remoção de toxinas formadoras de poros da membrana plasmática. Este ensaio sensível avalia os requisitos de cálcio e esfingomielinase para reparo celular.

Viva Imagem Ensaio para Avaliação das Funções de Ca

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