Name: Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprenda a avaliar o potencial miogênico de progenitores musculares derivados de células iPSC em modelos murinos de regeneração muscular. Este método permite analisar enxerto e diferenciação celular in vivo.

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Os autores agradecem a Giulio Cossu, Martina Ragazzi e todo o laboratório por uma discussão e apoio úteis, e Jeff Chamberlain por fornecer gentilmente vetor MyoD-ER. Todos os experimentos envolvendo animais vivos foram concluídos de acordo com todas as agências, regulamentos e diretrizes regulatórias e institucionais relevantes. O trabalho no laboratório de autores é apoiado pelo Uk Medical Research Council, European Community 7th Framework projects Optistem and Biodesign e o Italian Duchenne Parent Project.

1. Avaliação do Potencial miogênico e engrafado
<ol><li>
In vitro: Diferenciação induzida pelo MYOD<ol>
<li>Gerar uma linha celular estável de IDEMs transduzidos com o vetor lentiviral myoxifen-ER indutível de tamoxifen, titulando a multiplicidade de infecção (MOI; por exemplo, 1, 5 e 50) utilizando a coloração descrita em 1.1.9 (MyHC) como resultado da eficiência do procedimento.</li>
		<li>Cubra um prato de 3,5 cm com 1 ml de 1% de Matrigel e incubar por 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Lave a placa duas vezes com idem médios e semeados 1 x10 5 MyoD-ER transduzidos no prato de cultura tecidual de 3,5 cm e incubar a 37 °C em meio de crescimento.</li>
		<li>Espere que as células atinjam a confluência em um ou dois dias e, em seguida, adicionem 1 μM 4OH-tamoxifen no meio de crescimento(1ª dose).</li>
		<li>Após 24 horas, substitua o meio de crescimento por meio de diferenciação complementado com 1 μM 4OH-tamoxifen (2ª e última dose).</li>
		<li>Substitua metade do meio por um novo meio de diferenciação a cada dois dias.</li>
		<li>Examine diariamente as culturas para a formação do miotube.</li>
		<li>Após uma semana (5 dias em meio de diferenciação), lave as placas suavemente com PBS e fixe com 4 % de paraformaldeído por 5 min no RT.</li>
		<li>Realize uma mancha de imunofluorescência com anticorpos contra a cadeia pesada de minocina (MyHC) para confirmar a presença de moxutadores. Contra-mancha com um corante nuclear (por exemplo, Hoechst).</li>
	</ol>
</li>
</ol>A eficiência da diferenciação é avaliada como o percentual de núcleos dentro das células myhc-positivas: proceda para o próximo passo se a eficiência for >50%.
<ol start="2"><li>
In vivo: engraftment em um modelo de regeneração muscular aguda Para avaliar a contribuição in vivo dos IDEMs MyoD-ER para a regeneração muscular, as células são previamente rotuladas com uma codificação vetorial para a proteína fluorescente verde (GFP) que permitirá rastreá-las dentro do tecido. Os IDEMs myoD-ER GFP são então injetados em músculos murinos adultos, anteriormente feridos com uma miotoxina (por exemplo, cardiotoxina). Para evitar a rejeição imune contra células xenogênicas (como HIDEMs) ou geneticamente manipuladas/corrigidas, é necessário usar camundongos imunodeficientes ou imunossupressores.<ol>
<li>Pré-trate os animais com uma injeção intra-peritoneal de 3,5 μl/g de 10 mg/ml tamoxifen (forma liposolúvel) 24 horas antes do transplante e células pré-tratamento adicionando 1 μM 4OH-tamoxifen (forma aquosa) no meio de crescimento durante a noite antes do dia do transplante.</li>
		<li>Administre anestesia e analgesia ao camundongo seguindo as diretrizes específicas que regulam procedimentos cirúrgicos na instalação animal.</li>
		<li>Injetar 25 μl de cardiotoxina de 100 μM (CTX; de Naja mossambica mossambica; ATENÇÃO: substância potencialmente prejudicial) nos músculos tibialis anteriores (TA).</li>
		<li>24 horas após o tratamento dos animais com tamoxifen e CTX, desprendem as células por experimentação e contagem.</li>
		<li>Centrifugar as células a 232 x g por 5 min.</li>
		<li>Lave a pelota celular em PBS Ca2+- e Mg2+livre, centrífuga e, em seguida, reapridar suavemente a pelota celular em Ca2+- e MG2+- PBS livre para uma concentração final de 106 células/30 μl, que será o volume final de cada injeção.</li>
		<li>Injete 30 μl de suspensão celular nos músculos anteriormente feridos usando uma seringa com agulha de 29 ou 30 G. Preste atenção especial ao remover a agulha do músculo. Faça-o lentamente, evitando derramar a suspensão da célula através da pista da agulha. Não transplante o TA contralateral e use-o como controle, injetando 30 μl de Ca2+- e   MG2+-PBS livre para replicar as condições do transplantado.</li>
		<li>Trate os animais com tamoxifeno por mais seis dias e administre analgesia (por exemplo, Carprofen) por mais dois dias.</li>
		<li>Explane os músculos a partir de 14 dias após o transplante em diante. Processe e analise as amostras conforme detalhado nos Protocolos 4 e 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Transplante em Modelos de Camundongos de Distrofia Muscular
Este ensaio de transplante permite avaliar a extensão do enxerto de IDEMs em modelos de camundongos de distrofia muscular. Os animais, tratados da seguinte forma, também podem ser avaliados para amenização funcional do fenótipo da doença. Os testes funcionais podem ser realizados a partir de duas semanas após o transplante. A fim de melhorar o enxerto considere realizar exercícios de esteira de pré-transplantação (como descrito no Protocolo 3) e/ou injeções de células seriais a cada três semanas para 3x (ou seja, para um total de 3 injeções/músculo).
<ol><li>Transplante intramuscular<ol>
<li>Pré-trate os animais com injeção intra-peritoneal de 3,5 μl/g de 10 mg/ml tamoxifen (formulação liposolúvel) 24 horas antes do transplante e células pré-tratamento adicionando 1 μM 4OH-tamoxifen (formulação aquosa) no meio de crescimento durante a noite antes do dia do transplante.</li>
		<li>Despeça por trippsinização, conte e centrifuge as células a 232 x g por 5 min.</li>
		<li>Lave a pelota celular em PBS Ca2+- e Mg2+- livre, centrífuga e, em seguida, resuspenda a pelota em Ca2+- e MG2+-livre PBS para uma concentração de 106 células/30 μl.</li>
		<li>Administre analgesia e desinfete a pele do animal (opcional) com um desinfetante à base de iodo ou clorexidina povidone. Isso também ajudará a localização dos músculos tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GC) e quadríceps femoris (QC; especificamente os músculos vastos intermedius).</li>
		<li>Injete 30 μl de suspensão celular nos músculos usando uma seringa com agulha de 29 ou 30 G. Para o TA, insira 5 mm da agulha 2 mm abaixo da inserção do tendão proximal (direção craniocaudal) com uma inclinação de 15° em relação à tíbia e injete lentamente a suspensão celular enquanto retrai a agulha (esvazie a seringa com 2 mm da agulha ainda dentro do músculo). Para o GC e QC, repita o mesmo procedimento detalhado para o TA, sendo a principal diferença a inserção caudocranista da agulha 2 mm acima da junção miotendinous do tendão de Aquiles para o tendão de Aquiles e 2 mm acima do tendão distal para o QC (inclinação de 15° em relação ao fêmur). Preste atenção ao remover a agulha do músculo, a fim de evitar derramar a suspensão celular através da pista da agulha. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: Em caso de baixo enenxerto considere injetar camundongos juvenis (1-2 semanas de idade)com 3 x 105 células/10 μl (note que neste caso o tamoxifeno precisa ser administrado subcutâneamente).</li>
	</ol></li>
	<li>Transplante intra-arterial Esta parte do protocolo permite que a avaliação da capacidade de MIDEMs e HIDEMs sejam entregues na circulação arterial, cruzem a parede do vaso e contribuam para a regeneração muscular esquelética nos músculos a jusante até o local da injeção.<ol>
<li>Pré-tratamento de animais e células como descrito acima na etapa 2.1.1.</li>
		<li>Despeça-se por trippsinização e filtro com um coador de células de 40 μm (para remover clusters da suspensão celular no caso improvável de que a exposição noturna ao tamoxifen possa impulsionar a fusão e a formação de miotubes a partir de células adjacentes) contar e centrifugar as células a 232 x g por 5 minutos</li>
		<li>Lave a pelota celular em PBS Ca2+- e Mg2+sem livre, centrífuga e, em seguida, resuspenda a pelota em Ca2+- e Mg2+-free PBS com 0.2 International Unidades de heparina de sódio (opcional) a uma concentração celular final de 106 células/50 μl. Adicione 10% Corante azul patente (concentração final: 1,25 mg/ml em soro fisiológico normal ou Ca2+- e MG2+-livre PBS) à solução a fim de visualizar a distribuição da suspensão celular.</li>
		<li>Administre anestesia e analgesia ao camundongo de acordo com as diretrizes que regulam procedimentos cirúrgicos na instalação específica de animais institucionais.</li>
		<li>Raspe a região inguinal (também conhecida como triângulo femoral ou de Scarpa) e desinfete a pele com um desinfetante à base de iodo ou clorexidina povidone.</li>
		<li>Faça uma incisão de 5-7 mm e localize o feixe femoral: veia, artéria e nervo (o nervo coloca lateralmente na artéria e na veia medial).</li>
		<li>Remova suavemente a fáscia conectiva que cobre o feixe com fórceps.</li>
		<li>Separe a veia femoral e o nervo da artéria introduzindo suavemente a ponta de um fórceps (ou uma agulha de 30 G) entre eles e aumentando progressivamente o orifício. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: A veia femoral é frágil: preste atenção para não beliscá-la com os fórceps durante seu desprendimento da artéria femoral. Em caso de hemorragia, drene o sangue com gaze estéril e use um micro cauterizador para facilitar a hemostasia.</li>
		<li>Levante a artéria com uma ponta dos fórceps e aperte a artéria com a outra ponta.</li>
		<li>Fure a artéria com uma seringa equipada com uma agulha de 30 G. Injete 50 μl de suspensão celular a jusante da área fixada, a uma velocidade de infusão de aproximadamente 5 μl/seg. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: Ressuspenque cuidadosamente as células na seringa antes da injeção: é vital evitar a precipitação de células e a formação de bolhas de ar dentro da seringa. O diâmetro da artéria femoral é ligeiramente menor do que uma agulha de 30 G: tenha cuidado para não truncar a artéria ao inserir a agulha. O corante azul patente permite reconhecer a eficácia da injeção: se corretamente injetado, todo o membro rapidamente ficará azul claro.</li>
		<li>Remova lentamente a agulha e as fórceps da artéria para restaurar a corrente sanguínea no membro.</li>
		<li>Aplique pressão com gaze estéril para evitar sangramento e/ou cauterização conforme necessário.</li>
		<li>Sutura a ferida e monitore os animais até a recuperação da anestesia.</li>
		<li>Administre a analgesia por 3 dias e inspecione a ferida diariamente (em caso de infecção por feridas, discuta isso com o pessoal da instalação animal e administre antibióticos conforme necessário).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Medidas de Resultado em Animais Distróficos Transplantados: Teste de esteira
A partir de duas semanas após o transplante celular, é possível avaliar a amenização funcional da capacidade motora dos camundongos tratados com os testes da esteira. Este teste permite a avaliação da tolerância ao exercício/resistência dos camundongos tratados. Um rato é considerado cansado quando se deita na área de descanso por mais de 5 segundos, sem tentar reengajar a esteira após uma série de 3 estímulos mecânicos consecutivos (um a cada 5 segundos). As medidas da linha de base começam aproximadamente um mês antes do tratamento e são usadas para avaliar a melhoria de cada animal testado. Este teste pode ser seguido por ensaios adicionais para monitorar a fragilidade das fibras, melhora da força, engrafia, diferenciação de células transplantadas e amelieração morfológica dos músculos transplantados (ver Discussão).
<ol><li>Aclimatar os animais (geralmente três grupos: tratados, não tratados e controles tipo silvestre/não distrófico) ao exercício antes da primeira medição: coloque a esteira a uma velocidade de 6 m/min por 10 minutos. Repita o procedimento dia não por uma semana. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: Registo todas as medições na mesma hora do dia para evitar vieses devido aos ciclos circadianos.</li>
	<li>Coloque os animais na esteira, que já foi montada anteriormente com uma inclinação de 10°.</li>
	<li>Ligue a esteira, com uma velocidade inicial de 6 m/min (forneça um estímulo mecânico suave no caso de os animais não estiverem dispostos a iniciar o exercício).</li>
	<li>Inicie o temporizador e aumente a velocidade em 2 m/min a cada 2 minutos.</li>
	<li>Assim que um animal fica na área de descanso por mais de 5 segundos sem tentar reengajar a esteira, toque-a suavemente com uma vara para estimular o reinício do exercício (veja acima).</li>
	<li>Regisso desempenho (tempo e ou distância) de cada animal.</li>
	<li>Repita as medições semanalmente ou a cada 10 dias por pelo menos 3x.</li>
	<li>Repita o mesmo procedimento após o transplante.</li>
	<li>Analise os dados de desempenho comparando a medição de cada animal com o desempenho da linha de base. Sugerimos traçar os valores em um gráfico como uma porcentagem da capacidade média do motor em relação à linha de base e analisá-los por um teste ANOVA de uma ou duas vias seguido de pós-teste apropriado para comparar os grupos.</li>
</ol>SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: use um mínimo de 5 animais/grupo com correspondência de idade, genótipo e sexo e repita as medidas por pelo menos 3x após o transplante.
4. Avaliação do Engrafamento celular e diferenciação em músculos transplantados
Os músculos transplantados e de controle são colhidos no momento apropriado (<2 dias para análise de engraftment de curto prazo, 2-3 semanas para médio prazo e > 1 mês para análise de longo prazo). Se as células transplantadas forem rotuladas com GFP, o enxerto em músculos recém-isolados pode ser avaliado por fluorescência direta sob um estereóscópio equipado com UV.
<ol><li>Coloque e oriente ao longo do eixo vertical músculos recém-isolados na goma de tragachanth (6% c/v)</li>
	<li>Desidrate as amostras em isopentane pré-ciclimada por um minuto, congele-as em nitrogênio líquido por pelo menos 2 minutos e coloque-as imediatamente a -80 °C para armazenamento.</li>
	<li>Processe as amostras com um criostat para obter seções de 7 μm de espessura em slides polarizados. Prove a maioria dos músculos nos slides, coletando aproximadamente 8-10 slides com 30-40 seções/slide. É aconselhável coletar uma série de seções em um tubo de 1,5 ml para realizar ensaios de biologia molecular/bioquímica.</li>
	<li>Avalie o enxerto celular com diferentes manchas imunofluorescentes, dependendo da configuração experimental. Por exemplo, no caso do transplante HIDEM em camundongos Sgca-null/scid/bg, manchas com: a) um anticorpo contra Lamin A/C para detectar núcleos de células humanas enxertados; b) um anticorpo contra laminina para visualizar a estrutura geral do músculo; e c) um anticorpo contra Sgca para detectar a restauração derivada do doador da proteína ausente no animal distrófico.</li>
	<li>Quantifique, usando um microscópio de fluorescência, o número de núcleos doadores por seção muscular dentro e fora das fibras musculares e o número de miofibers esqueléticos derivados de doadores por seção.</li>
</ol>5. Histopatologia Muscular
Análises histopatológicas permitem a avaliação da estrutura morfológica do músculo transplantado. A melhoria arquitetônica na estrutura tecidual é esperada como resultado da abordagem da terapia celular.
<ol><li>Fixar os músculos recém-isolados com 4% de paraformaldeído por 1 hora a 4 °C.</li>
	<li>Desidratar as amostras com um gradiente ascendente de sacarose (por exemplo, 7,5-15-30% c/v).</li>
	<li>Deixe os músculos durante a noite na solução de sacarose mais alta.</li>
	<li>Incorpore as amostras em Tissue Tek OCT, coloque-as em isopentane pré-cichilled até que o OCT se torne sólido (evitando a imersão completa das amostras), congele-as em nitrogênio líquido por pelo menos 2 minutos e coloque-as imediatamente a -80 °C para armazenamento.</li>
	<li>Processe as amostras com um criostat para obter seções de 7 μm de espessura conforme descrito acima.</li>
	<li>Manche as seções com hematoxilina e eosina ou tricromome de Masson de acordo com os protocolos do fabricante padrão.</li>
</ol>A hematoxilina e a coloração de eosina permitem calcular marcas do músculo regenerador, tais como: a) o número de miofibers; b) área transversal; c) o número de miofibers contendo um núcleo central. O tricromome de Masson é usado para calcular o índice fibroso, feito subtraindo a área total ocupada pelos miofibers esqueléticos da área total da imagem: a área resultante reflete principalmente o infiltrado conjuntivo e gordo do músculo. Todas as análises nas imagens poderiam ser realizadas usando o software ImageJ (NIH) com a ferramenta de medição e o plugin do contador de células.

<ol><li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).</li>
<li>Minasi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meso-angioblast%3A+a+multipotent%2C+self-renewing+cell+that+originates+from+the+dorsal+aorta+and+differentiates+into+most+mesodermal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues.</a> Development. 129, 2773-2783 (2002).</li>
<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat. Commun. 2, 499 (2011).</li>
<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).</li>
<li>Sampaolesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+of+alpha-sarcoglycan+null+dystrophic+mice+through+intra-arterial+delivery+of+mesoangioblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts.</a> Science. 301, 487-492 (2003).</li>
<li>Sampaolesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoangioblast+stem+cells+ameliorate+muscle+function+in+dystrophic+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs.</a> Nature. 444, 574-579 (2006).</li>
<li>Tedesco, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Genetically+Corrected+Human+iPSC-Derived+Progenitors+in+Mice+with+Limb-Girdle+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
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<li>Chaouch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+skin+fibroblasts+expressing+conditional+MyoD+as+a+renewable+and+reliable+source+of+converted+human+muscle+cells+to+assess+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies%3A+validation+of+an+exon-skipping+approach+to+restore+dystrophin+in+Duchenne+muscular+dystrophy+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells.</a> Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).</li>
<li>Kimura, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-lineage+regulated+myogenesis+for+dystrophin+replacement%3A+a+novel+therapeutic+approach+for+treatment+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).</li>
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<li>Wu, S. M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+potential+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine.</a> Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).</li>
</ol>

F.S.T. registrou um pedido de patente internacional (não. PCT/GB2013/050112) incluindo parte da estratégia descrita neste artigo. Ele recebeu financiamento da Promimetic e DWC Ltd. para sua pesquisa.

Os iPSCs podem ser expandidos indefinidamente, preservando seu potencial de auto-renovação e, portanto, orientados a diferenciar-se em uma ampla gama de linhagenscelulares 12. Por essa e outras razões, as células-tronco/progenitoras derivadas do iPSC são consideradas uma fonte promissora para abordagens autólogas de genética e terapia celular13. Um trabalho publicado anteriormente pelos Autores relatou a geração de progenitores miogênicos e camundongos humanos de iPSCs com um fenótipo semelhante ao ...

Mesoangioblasts (MABs) são progenitores musculares associados ao vaso derivados de um subconjunto de pericílitos1-3. A principal vantagem dos MABs sobre progenitores musculares canônicos, como as células satélites4, reside em sua capacidade de atravessar a parede do vaso quando entregue intra-arterial e, portanto, contribuir para a regeneração muscular esquelética nos protocolos de terapia celular. Este recurso foi avaliado e confirmado em modelos murinos e caninos de distrofia muscular1,5,6. Esses estudos pré-clínicos construíram as bases para um primeiro ensaio clínico de fase I/II baseado no transplante intra-arterial de MABs idênticos ao doador HLA em crianças com distrofia muscular de Duchenne (EudraCT nº 2011-000176-33; atualmente em andamento no Hospital San Raffaele de Milão, Itália). Um dos principais obstáculos das abordagens terapêuticas celulares, onde bilhões de células são necessárias para tratar o músculo de todo um corpo, é o limitado potencial proliferativo do "medicamento" (as células). Além disso, foi recentemente demonstrado que não é possível obter MABs de pacientes afetados por algumas formas de distrofias musculares, pois ocorre na distrofia muscular de cinta de membros 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
Para superar essas limitações, foi recentementeestabelecidoum protocolo para a deriva de células-tronco/progenitoras semelhantes ao MAB de iPSCs humanos e murinos. Este procedimento gera populações celulares facilmente expansíveis com uma assinatura genética vascular e imunofenótipo altamente semelhante aos MABs derivados de músculos adultos. Após a expressão do fator regulatório miogênico MyoD, tanto os IDEMs murinos quanto humanos (respectivamente MIDEMs e HIDEMs) passam por diferenciação muscular esquelética terminal. Para atingir esse objetivo, os IDEMs podem ser transduzidos com vetores capazes de conduzir a expressão MyoD, seja constitutivamente ou de forma indutível8-10. É utilizado um vetor lentiviral contendo myoD cDNA fundido com o receptor de estrogênio (MyoD-ER), permitindo assim sua translocação nuclear sobre a administração de tamoxifen (análogo de estrogênio)11. Essa estratégia resulta na formação de miótubos multinucleados hipertróficos, com alta eficiência7. Notavelmente, os IDEMs não sãotumorgênicos, podem engrafar e diferenciar os músculos hospedeiros no momento do transplante e podem ser geneticamente corrigidos usando diferentes vetores (por exemplo, lentivírus ou cromossomos artificiais humanos), abrindo caminho para futuras estratégias terapêuticas autólogas. A derivação, caracterização e transplante de IDEMs foram descritas na publicação acima7. Este documento protocolar detalha os ensaios realizados para avaliar a diferenciação miogênica in vitro dos IDEMs e as medidas subsequentes de desfecho para testar a eficácia de seu transplante em modelos de regeneração muscular.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>MegaCell DMEM</td><td>Sigma</td><td>M3942</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Sigma</td><td>I3390</td><td></td></tr><tr><td>Soro</td><td>de cavalo Euroclone</td><td>ECS0090L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Lonza</td><td>DE14801F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS Livre de Cálcio/Magnésio</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ITS (Insulina-Transferrina-Selênio)</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de aminoácidos não essenciais</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fer-In-Sol</td><td>Mead Johnson</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ferlixit</td><td>Aventis</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido Oleico</td><td>Sigma</td><td>01257-10 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido Linoleico</td><td>Sigma</td><td>L5900-10 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Humano bFGF</td><td>Gibco</td><td>AA 10-155</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fatores de crescimento reduzidos Matrigel</td><td>Becton Dickinson</td><td>356230</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Mayne Pharma</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução azul tripano</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>PREJUDICIAL</td></tr><tr><td>Corante azul patenteado</td><td>Sigma</td><td>19, 821-8</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td> PREJUDICIAL <td>Sigma</td><td>T5648</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tamoxifeno 4-OH</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pLv-CMV-MyoD-ER(T)</td><td>Addgene</td><td>26809</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cardiotoxina</td><td>Sigma</td><td>C9759</td><td>PREJUDICIAL</td></tr><tr><td>Povidona iodo</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Goma Tragachant</td><td>MP Biomedicals</td><td>104792</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopenthane</td><td>VWR</td><td>24,872,323</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecido Tecidual OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>VWR</td><td>27,480,294</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Corrediças de vidro polarizadas</td><td>Thermo</td><td>J1800AMNZ</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>E4382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma</td><td>HHS32</td><td></td></tr><tr><td>Tricrômico</td><td>Bio-Optica</td> de Masson <td>04-010802</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo de Cadeia Pesada de Miosina de Camundongo</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-lamin A/C de camundongo</td><td>Novocastra</td><td>NLC-LAM-A/C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Fluka</td><td>B2261</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo anti laminina de coelho</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">MATERIAIS E EQUIPAMENTOS</td></tr><tr><td>Sutura antibacteriana adsorvível 4-0</td><td>Ethicon</td><td>vcp310h</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringa de agulha 30 G</td><td>BD</td><td>324826</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Esteira</td><td>Instrumento</td><td></td> Columbus<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Esteromicroscópio</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Leica</td><td>DMIL LED</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Unidade de isoflurano</td><td>Harvad Apparatus</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fibra óptica</td><td>Euromecs (Holanda)</td><td>EK1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Vet Tech</td><td>C17A1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bisturis</td><td>Swann-Morton</td><td>11REF050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinça cirúrgica</td><td>Fine Scientific Tools</td><td></td><td>5/45</td></tr><tr><td>Cauterizador de alta temperatura</td><td>Bovie Medical</td><td>AA01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">MEDIA COMPOSITION</td></tr><tr><td colspan="4">A composição do meio é detalhada abaixo. HIDEMs meio de crescimento: <ul> <li>MegaCell Dulbecco's Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM)</li> <li>5% de soro fetal bovino (FBS)</li> <li>2 mM de glutamina</li> <li>0,1 mM de &beta;-mercaptoetanol</li> <li>1% de aminoácidos não essenciais</li> <li>5 ng/ml de fator de crescimento de fibroblastos básicos humanos (bFGF)</li> <li>100 UI ml de penicilina</li> <li>100 mg/ml de estreptomicina</li> </ul> Alternativamente, se alguns dos reagentes acima não estiverem disponíveis, os HIDEMs podem ser cultivados em: <ul> <li>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</li> <li>10% FBS</li> <li>2 mM de glutamina</li> <li>0,1 mM de &beta;-mercaptoetanol</li> <li>1% Aminoácidos não essenciais (NEAA)</li> <li>1% ITS (insulina/transferrina/selênio)</li> <li>5 ng/ml humano bFGF</li> <li>100 UI ml de penicilina</li> <li>100 mg/ml de estreptomicina</li> <li>0,5 &mu; Ácidos M oleico e linoleico</li> <li>1,5 &mu; M Fe2+ (Fer-In-Sol)</li> <li>0.12 &mu; M Fe3+ (Ferlixit)</li> </ul> Meio de crescimento MIDEMs: <ul> <li>DMEM</li> <li>20% FBS</li> <li>2 mM de glutamina</li> <li>5 ng/ml de bFGF</li> <li>100 UI ml de penicilina</li> <li>100 mg/ml de estreptomicina</ li> </ul> Meio de diferenciação: <ul> <li>DMEM</li> <li>2% Soro de cavalo (HS)</li> <li>100 UI ml de penicilina</li> <li>100 mg/ml de estreptomicina</li> <li>2 mM de glutamina</li> </ul> </td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Lista de Reagentes, Materiais, Equipamentos e Meios.</td></tr></tbody></table>

transplante de progenitores miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

IPSCs derivados do paciente podem ser uma fonte inestimável de células para futuros protocolos de terapia celular autóloga. Células progenitoras miogênicas/progenitoras derivadas do iPSC semelhantes aos mesoangioblasts derivados de pericílito (células-tronco/progenitoras derivadas do iPSC: IDEMs) podem ser estabelecidas a partir de iPSCs gerados a partir de pacientes afetados por diferentes formas de distrofia muscular. Os IDEMs específicos do paciente podem ser geneticamente corrigidos com diferentes estratégias (por exemplo, vetores lentivirais, cromossomos artificiais humanos) e aprimorados em seu potencial de diferenciação miogênica após a superexpressão do myogenesis regulator MyoD. Esse potencial miogênico é então avaliado in vitro com ensaios de diferenciação específicos e analisado por imunofluorescência. O potencial regenerativo dos IDEMs é ainda avaliado in vivo, notransplante intramuscular e intra-arterial em dois modelos representativos de camundongos que apresentam regeneração muscular aguda e crônica. A contribuição dos IDEMs para o músculo esquelético hospedeiro é então confirmada por diferentes testes funcionais em camundongos transplantados. Em particular, a amenização da capacidade motora dos animais é estudada com testes de esteira. O engrafamento celular e a diferenciação são então avaliados por uma série de ensaios histológicos e imunofluorescência em músculos transplantados. No geral, este artigo descreve os ensaios e ferramentas atualmente utilizados para avaliar a capacidade de diferenciação dos IDEMs, com foco nos métodos de transplante e medidas de desfecho subsequentes para analisar a eficácia do transplante celular.

Os resultados representativos relatados seguem os principais ensaios in vitro/in vivo retratados no fluxo de trabalho na Figura 1. 48 horas após 4OH-tamoxifen administração Núcleos myoD-positivos são identificáveis dentro de IDEMs transduzidos myoD-ER na cultura(Figura 2A). As células então se fundem e se diferenciam em miótubos multinucleados(Figura 2B). Quando transplantados intramuscularmente em um modelo murino de lesão muscular aguda, os IDEMs contribuem pa...

Progenitores miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são candidatos promissores para estratégias de terapia celular para tratar distrofias musculares. Este protocolo descreve transplantes e medidas funcionais necessárias para avaliar o enenxerto e diferenciação dos mesoangioblastos derivados do iPSC (um tipo de progenitores musculares) em modelos de camundongos de regeneração muscular aguda e crônica.

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o potencial miogênico de progenitores musculares derivados de células-tronco pluripotentes induzidas em modelos murinos de regeneração muscular aguda e crônica. Isso é realizado primeiramente avaliando o potencial miogênico das células in vitro. O segundo passo consiste em transplantar as células por meio de injeção intramuscular.Alternativamente, as células são injetadas na artéria femoral por meio de um procedimento microcirúrgico. O passo final é avaliar a melhora funcional do fenótipo distrófico dos animais tratados. Por fim, ensaios de imunofluorescência e histologia são utilizados para demonstrar o enxerto e a contribuição funcional das células doadoras para os músculos do hospedeiro.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da regeneração do músculo esquelético, como a investigação de abordagens de terapia celular. As implicações desta técnica estendem-se ao tratamento das distrofias musculares, pois poderiam abrir caminho para estratégias de terapia celular autóloga utilizando progenitores de células IPS DER. Embora este método possa fornecer insights sobre terapias baseadas em células-tronco, ele pode ser aplicado a outros sistemas, como a entrega de moléculas, por via intramuscular ou intra-arterial, e subsequente análise do efeito sobre a função e a morfologia musculares.A ideia para este método surgiu quando percebemos que o cultivo de IPSL poderia fornecer uma abordagem para superar algumas das limitações das células-tronco adultas, como a disponibilidade a partir de biópsias de tecido e seu potencial de expansão. Comece gerando uma linhagem celular estável de células transduzidas com um vetor indutível por tamoxifeno que superexpressa o regulador de miogênese MyoD. Após o revestimento com gel de matriz a 1% e lavagem com meio, semeie uma placa com as células transduzidas e incube a 37 graus Celsius em meio de crescimento. As células devem atingir confluência em um ou dois dias.Quando estiverem prontas, adicione um micromolar de hidroxi-tamoxifeno ao meio de crescimento. Após 24 horas, substitua o meio de crescimento pelo meio de diferenciação suplementado com um micromolar de hidroxi-tamoxifeno.Examine diariamente as culturas quanto à formação de tubos miotubulares e substitua metade do meio por meio de diferenciação fresco. Troque o meio a cada dois dias quando as culturas estiverem prontas. Eles são utilizados em ensaios de transplante.Aqui, camundongos distróficos e imunodeficientes são utilizados para determinar o grau de enxertia para transplante intramuscular. Pré-trate os animais com uma injeção de tamoxifeno 24 horas antes do transplante. As células também devem ser pré-tratadas com tamoxifeno adicionado ao meio de crescimento na noite anterior.No dia do transplante, desprenda as células com tripsina, conte-as e centrifugue-as, lavando-as uma vez em PBS antes da ressuspensão, suspendendo-as em PBS livre de cálcio e magnésio numa concentração de tendo seis células por 30 microlitros. Após anestesiar o animal e higienizar a pele, localize o músculo tibial anterior. Identifique o ponto de inserção do tendão proximal e insira a agulha.Posicione a ponta a dois milímetros abaixo desse ponto. Insira cinco milímetros da agulha com uma inclinação de 15 graus em relação à tíbia e injete lentamente a suspensão celular enquanto retira a agulha. Esvazie a seringa mantendo dois milímetros da agulha ainda dentro do músculo.Tenha cuidado ao remover a agulha do músculo para evitar derramar a suspensão celular através do trajeto da agulha. Seguindo esses mesmos procedimentos, as injeções gastroanêmicas são realizadas dois milímetros acima da junção miotendínea do tendão de Aquiles e do quadríceps. As injeções fem são realizadas dois milímetros acima do tendão distal para transplante intra-arterial.Submeta os animais e as células a um pré-tratamento com tamoxifeno conforme demonstrado anteriormente. Quando prontos para o transplante, as células são preparadas como demonstrado previamente, exceto pelo fato de serem filtradas antes da centrifugação. Re-suspenda o pellet em PBS livre de cálcio e magnésio e adicione corante azul de patente a 10% para permitir a visualização da distribuição da suspensão celular.Resuspenda cuidadosamente as células na seringa e remova todas as bolhas de ar antes da injeção; após a anestesia, depile e desinfete a área conforme mostrado, faça uma incisão de cinco a sete milímetros e localize o feixe femoral. Remova suavemente com pinça a fáscia conjuntiva que recobre o feixe. Em seguida, separe cuidadosamente a veia femoral e o nervo da artéria introduzindo suavemente a ponta da pinça entre eles e ampliando progressivamente o espaço.A veia femoral é frágil. Tenha cuidado para não pinçá-la durante sua separação da artéria femoral. Após a separação, levante a artéria com uma ponta da pinça e prenda a artéria com a outra ponta.Com uma agulha de 30 G, fure a artéria e injete 50 microlitros da suspensão celular a jusante da área clampada, a uma velocidade de infusão de aproximadamente cinco microlitros por segundo. Remova lentamente a agulha e a pinça da artéria para restabelecer o fluxo sanguíneo na extremidade. Aplique pressão com gaze estéril para evitar sangramento e/ou cauterize conforme necessário.O corante azul patente permite o reconhecimento imediato de uma injeção corretamente posicionada; se injetado corretamente, todo o membro ficará rapidamente azul claro, suturar a ferida e monitorar os animais até que se recuperem. Administrar analgesia por três dias e inspecionar a ferida. Alterações diárias na capacidade motora dos camundongos tratados são avaliadas pelo teste de esteira rolante. As medições basais começam aproximadamente um mês antes do tratamento e são utilizadas para avaliar a melhora de cada animal testado.O primeiro passo é aclimatar os animais ao exercício antes do teste. Para isso, ajuste a esteira a uma velocidade de seis metros por minuto durante 10 minutos. Repita este procedimento a cada dois dias durante uma semana.Uma vez que estejam familiarizados com o dispositivo, ajuste a inclinação para 10 graus e coloque os animais nas pistas da esteira. Ligue a esteira com uma velocidade inicial de seis metros por minuto. Dê um leve empurrão em qualquer animal que não esteja disposto a iniciar o exercício.Em seguida, inicie o cronômetro e aumente a velocidade em dois metros por minuto a cada dois minutos assim que um animal permanecer na área de repouso por mais de cinco segundos. Sem tentar reativar a esteira, toque-a suavemente com um bastão para estimular a retomada do exercício. Um camundongo é considerado fatigado quando permanece na área de repouso por mais de cinco segundos sem tentar reativar a esteira.Após uma série de três estímulos mecânicos consecutivos, um a cada cinco segundos, registre o desempenho de cada animal e repita as medições semanalmente ou a cada 10 dias por pelo menos três vezes, começando duas semanas após o transplante celular. Repita o mesmo procedimento nos camundongos tratados após o teste.Utilize comparações com a linha de base para avaliar alterações no desempenho. 48 horas após a administração de quatro doses de hidroxi-tamoxifeno, núcleos positivos para myo de são identificáveis em amostras transduzidas com myo DER em cultura. Como visto aqui.Após uma semana, as células se fundem e se diferenciam em tubos miotubulares multinucleados. Quando transplantados intramuscularmente em um modelo que simula lesão muscular aguda, os itens contribuem para a regeneração tecidual observada no teste na esteira. O teste de tolerância ao exercício mostra melhora na capacidade motora dos camundongos tratados após o transplante.As análises ex vivo de músculos transplantados revelam áreas positivas para GFP, representando o grau de colonização das IMS no tecido hospedeiro, demonstrando assim que as células doadoras se incorporam ao músculo distrófico. Importante, as células transplantadas são capazes de se diferenciar in vivo, formando novas fibras miológicas esqueléticas. Este exemplo mostra a expressão de alfa sarcoglicana a partir de IMS geneticamente corrigidas transplantadas em camundongos skid beige nulos para alfa sarcoglicana.A coloração com tricrômio de Masson revelou uma redução na quantidade de tecido fibrotico no músculo tratado. Após este procedimento, métodos como o teste de FreeWheel, o ensaio com Azul de Evans e a mecânica de fibra única ou de músculo inteiro podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a melhoria da capacidade motora voluntária, fragilidade da fibra e força específica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a capacidade de diferenciação muscular, o potencial de enxerto e a eficácia funcional de progenitores miogênicos derivados de células iPS utilizando ensaios in vitro, in vivo e ex vivo.

transplantation-induced-pluripotent-stem-cell-derived-mesoangioblast

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Rastreamento de Dinâmica de enxerto muscular em animais de pequeno In Vivo Fluorescent Imagem

Método para a dissociação enzimática, rotulagem superfície e purificação por citometria de fluxo de fibro / adipogénicos e progenitores miogênica de músculo esquelético murino.

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Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

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