Metabólica Labeling e Membrana Fracionamento para Comparative Analysis proteômica de

O objetivo geral do seguinte experimento é separar diferentes subcompartimentos da membrana e estudar sua composição proteica diferencial. Isso é alcançado por meio da marcação com isótopos estáveis de células em diferentes condições, permitindo assim a diferenciação dos tratamentos. Na análise por espectrometria de massas, como segundo passo, o material celular proveniente dos dois tratamentos é misturado, o que garante um processamento conjunto e reduz a variação entre amostras.

Em seguida, subcompartimentos da membrana plasmática são purificados e separados, por meio de centrifugação em gradiente de sacarose, em subcompartimentos estéreis ricos e subcompartimentos empobrecidos estéreis. São obtidos resultados de centrifugação em gradiente que mostram abundâncias proteicas diferenciais nos subcompartimentos sob diferentes tratamentos, com base em dados de espectrometria de massa quantitativa. A principal vantagem deste protocolo em relação aos métodos existentes, como o Western blot, é que podemos registrar quantitativamente a distribuição de milhares de proteínas nos subcompartimentos e, assim, descobrir novos candidatos envolvidos em processos de sinalização.

A demonstração visual deste método é fundamental, pois a purificação me de um sistema bifásico é difícil de aprender. A razão para isso é que o processo envolve muitas etapas, e o controle preciso e o manuseio cuidadoso são muito importantes. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de sinalização ao descobrir novos candidatos proteicos como reguladores de processos de membrana. Comece cultivando culturas de suspensão celular de arabidopsis ana marcadas e não marcadas, conforme descrito no protocolo textual.

Células homogeneizadas a partir de cerca de um litro de culturas de suspensão celular com sete dias de idade em nitrogênio líquido, misture quantidades iguais de culturas celulares congeladas marcadas e não marcadas com base no peso fresco em um béquer e adicione dois volumes do tampão H, coloque imediatamente o béquer sobre um agitador e agite até que o material esteja derretido e sem gelo. Filtre o homogenato através de uma camada de pano tipo mirro em tubos de centrífuga de 250 mililitros; após o balanceamento das amostras com o tampão H, centrifugue a 10.000 ×g durante oito minutos. Após a centrifugação, carregue o sobrenadante em tubos de ultracentrífuga pré-resfriados com um volume de aproximadamente 32 mililitros.

Após equilibrar as amostras com o tampão h, pelotizar as microsomas por centrifugação a 100.000 Gs e quatro graus Celsius durante 30 minutos. Após a centrifugação, remover o sobrenadante, que contém as proteínas solúveis. Uma pequena quantidade dessa fração pode ser armazenada para precipitação proteica adicional e análise subsequente das proteínas solúveis; ressuspender o pellet de membrana de cada amostra na quantidade respectiva de tampão R conforme descrito no protocolo textual e aplicar na parte superior do sistema bifásico U um dois.

Se o sistema bifásico de seis gramas for utilizado, carregue exatamente dois gramas do pellet de membrana ressuspendido e carregue o mesmo volume de tampão puro R usado para a suspensão de ressuspenção da amostra no tubo U2. Misture lentamente os tubos U1 e U2 invertendo-os 30 vezes a aproximadamente uma inversão por segundo. Centrifugue as amostras a 1500 Gs e quatro graus Celsius por 10 minutos. Após a centrifugação, remova a fase superior de U2. Transfira a fase superior de U1 para U2 antes de repetir a centrifugação usando os mesmos parâmetros. Em seguida, transfira a fase superior de U2 para os tubos de ultracentrífuga, dilua com cinco volumes do tampão R e misture completamente. Centrifugue as amostras a 200.000 Gs e quatro graus Celsius por uma hora.

Por fim, reutilize. Suspenda o pellet da membrana em uma pequena quantidade de tampão T e E para o isolamento de membranas resistentes a detergentes. Após verificar a concentração da fração de membrana plasmática por ensaio de Bradford, adicione Triton X-100 à fração de membrana plasmática numa proporção de detergente para proteína, peso por peso, entre 13 e 15, e uma concentração final de detergente entre 0,5 e 1%. Agite as amostras a aproximadamente 100 RPM e quatro graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, adicione três volumes de sacarose 2,4 molar a um volume da membrana plasmática tratada para obter uma concentração final de 1,8 molar de sacarose. Prepare o gradiente de sacarose em tubos para ultracentrifugação, adicionando as respectivas soluções de sacarose sobre a fração de 1,8 molar. Centrifugue as amostras a 250.000 ×g e 4 graus Celsius por 18 horas. Remova cuidadosamente os tubos de ultracentrifugação do rotor para evitar a perturbação da banda de baixa densidade, que pode ser visível como um anel esbranquiçado na interface entre as soluções de 0,15 molar e 1,4 molar de sacarose.

Às vezes, nada pode ser visto, mas a fração proteica resistente ao detergente ainda está presente. Remova uma fração de volume de 0,75 mililitro do topo do gradiente, frações dois e três, que abrangem os volumes de cerca de 1,5 mililitro acima do anel da interfase e 0,5 mililitro abaixo do anel da interfase.

Representam a fração de membrana resistente ao detergente. Colete essas frações em tubos Falcon de 15 mililitros. As frações nove e 10 contêm a fração de membrana solúvel em detergente e também podem ser coletadas para comparação.

Para iniciar a extração de proteínas da fração resistente a detergentes, adicione quatro volumes de metanol às frações coletadas e vórtex bem. Em seguida, adicione um volume de clorofórmio antes de vórtex novamente completamente. Por fim, adicione três volumes de água e vórtex bem, centrifugue as amostras a 2000 Gs por cinco minutos.

Usando uma centrífuga de bancada, remova a fase aquosa acima da camada proteica na interfase. Em seguida, adicione três volumes de metanol e vortex. Remova completamente o sobrenadante S antes de recolher o pellet para preparar a digestão em solução.

Inicie a digestão em solução dissolvendo a amostra em um pequeno volume de ureia seis molar, tiroidina dois molar pH oito, abreviado como UTU. Utilize o menor volume possível que seja compatível com a amostra. Após centrifugar as amostras e realizar a digestão conforme descrito no protocolo do texto, dilua a amostra com quatro volumes de tris HCl 10 milimolar pH oito.

Em seguida, adicione um microlitro de tripsina por 50 microgramas de proteína da amostra e incube durante a noite à temperatura ambiente com agitação constante a 700 RPM; centrifugue as amostras a 4.000 ×g por 10 minutos. Por fim, acidifique as amostras até uma concentração final de 0,2% de TFA para atingir pH dois, adicionando aproximadamente um décimo do volume de ácido tricloroacético a 2%. Para fabricar pontas C18 em estágio sólido, coloque um disco C18 em uma superfície plana e limpa, como uma placa de Petri plástica descartável.

Recorte um pequeno disco utilizando uma agulha hipodérmica de ponta romba com diâmetro de 1,5 milímetros. O disco adere à agulha e pode ser transferido para uma ponteira de pipeta. Empurre o disco para fora da agulha e fixe-o na extremidade cônica de uma ponteira de pipeta utilizando um pedaço de sílica fundida ou tubo que se encaixe no interior da agulha. Condicione uma ponteira tipo C 18 colocando 50 microlitros da solução B sobre a ponteira preparada.

Gire a ponta na centrífuga a 2000 RPM durante dois minutos. Em uma centrífuga de bancada, equilibre a ponta da fase usando 100 microlitros da solução a. Gire a ponta a 5.000 ×g em uma centrífuga de bancada. Repita a etapa de equilibração e a centrifugação.

Carregue a amostra no disco pipetando cuidadosamente a amostra dentro da ponteira que contém o disco. Gire as ponteiras na centrífuga até que todo o volume da amostra atravesse o disco C 18. Lave as ponteiras duas vezes com 100 microlitros da solução A. Após centrifugar as ponteiras, colete o EIT em um tubo de reação novo de 1,5 mililitro com 40 microlitros da solução B e centrifugue.

Mais uma vez, concentre a amostra no evaporador a vácuo sob condições ideais. Interrompa o processo de desidratação quando restar apenas cerca de um ou dois microlitros de líquido. Como etapa final, adicione um volume final de nove microlitros de solução de suspensão Resus à amostra e transfira-a para a placa de microtitulação para análise por espectrometria de massas.

O enriquecimento de proteínas da membrana plasmática pode ser demonstrado por meio de análise proteômica de pequenas alíquotas de membrana plasmática, frações e proteínas na fase inferior do sistema bifásico. A fase inferior contém as membranas internas da célula. Por exemplo, proteínas tipicamente conhecidas da membrana plasmática, como proteínas quinases receptoras, apresentam alta abundância na fração de membrana plasmática e baixa abundância na fração da fase inferior que contém as membranas internas.

Por sua vez, proteínas conhecidas do retículo endoplasmatico apresentam alta abundância na fração da membrana interna e não foram observadas na fração da membrana plasmática. O subsequente enriquecimento das frações de membrana resistentes a detergentes resultará, em casos ideais, na formação de um anel esbranquiçado de vesículas membranosas de baixa densidade. Em aproximadamente um quinto da altura do tubo, a maior abundância da proteína remn foi encontrada nas frações de membrana resistentes a detergentes ou frações DRM, como esperado.

Por outro lado, proteínas que não estão presentes na membrana, microdomínios como um transportador A b, C não apresentam um aumento na abundância na fração DRM. Além disso, contaminantes típicos, como uma proteína mitocondrial do complexo F zero da A TPAs e uma proteína ribossomal do ribossoma 60 S, não mostram abundância enriquecida na fração DRM. Embora quantidades mínimas ainda possam ser identificadas após análise por espectrometria de massas, as razões de abundância proteica do estado de fosforilação de proteínas na membrana plasmática, frações de culturas celulares marcadas e não marcadas, podem ser distinguidas quantitativamente.

Os resultados típicos da janela de quantificação MS quant devem mostrar uma razão de intensidade iônica de um para um na maioria dos peptídeos identificados. Aqueles peptídeos cuja razão de intensidade iônica se desvia significativamente da proporção um para um são considerados como diferencialmente regulados entre o cultivo celular marcado e não marcado, e são candidatos para associação com proteínas afetadas pelo tratamento aplicado. Um bom controle de qualidade para confirmar o sucesso da marcação metabólica é a coalescência de ambas as versões do peptídeo, marcada e não marcada, formando um único pico na separação por nano HPLC, conforme mostrado aqui.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três dias, desde o início da extração até a aplicação da amostra no espectrômetro de massas. Após este procedimento, outros métodos, como a Western Blot, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a suplementação de proteínas-alvo específicas. Assim, após assistir a este vídeo, deveremos ter uma boa compreensão de como misturar culturas celulares vegetais marcadas com isótopos estáveis, como realizar uma purificação de membrana plasmática por meio de um sistema bifásico e como separar compartimentos subcelulares de membrana ricos em esteróis dos empobrecidos em esteróis.