Name: Medindo o Crescimento e Expressão Gênica Dynamics do Tumor-Targeted S. Typhimurium Bactérias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprenda a medir a dinâmica de crescimento e expressão gênica de bactérias S. Typhimurium em tumores usando imagem de bioluminescência em modelo murino. Este método permite monitorar terapias bacterianas em oncologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos H. Fleming para a leitura crítica e edição do manuscrito. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de Pós-Doutorado Misrock (TD) e NDSEG graduação comunhão (AP). SNB é um investigador HHMI.

1. Preparação celular <ol><li> Linhagens de células utilizando técnicas de cultura de células padrão. Neste experimento, foi utilizado OVCAR-8 células (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Crescer as células-alvo a uma confluência de 80-100%. </li><li> Incubar as células em 5 ml de tripsina durante 5 min, em seguida, adicionam-se 5 ml de meio RPMI + FBS para inactivar a tripsina. </li><li> Células colheita e contar com um hemocitômetro. Ressuspender em DMEM livre de fenol vermelho em uma concentração alvo de aproximadamente 5 x 10 7 células / ml, ou cerca de 200 mL por frasco. </li><li> Adicionar 15% de redução do fator de crescimento Matrigel (BD Biosciences) e manter a suspensão de células em gelo até a implantação. </li></ol> 2. Implantação do Tumor <ol><li> Anestesiar quatro semanas femininos Ncr / Nu ratos velhos que usam 3% isoflurano e esperar cerca de 5 min para garantir a anestesia profunda. Use pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia. </li><li> Carregar as células (100 ul por tumor) numa seringa de 1 ml e anexar uma 27 1/ 2 agulha de calibre. </li><li> Para cada um dos dois locais de injecção flanco traseiras bilaterais, levantar a pele suavemente com uma pinça para fazer uma tenda e injectar células na base. Tome cuidado para não penetrar muito profundamente, produzindo sangue. Use uma pinça para remover suavemente a seringa sem respingos. </li><li> Controlar o crescimento do tumor por dia, durante 10 - 20 dias até um diâmetro de tumor de 2-4 mm, é alcançado. </li></ol> 3. Bactérias Preparação <ol><li> Iniciar uma cultura durante a noite de bactérias em 3 ml de LB + ampicilina mídia a partir de um estoque C -80 congelador ou placa refrigerada. Neste experimento, utilizou-se S. typhimurium estirpe ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-). </li><li> Na manhã seguinte, dilui-se a cultura de 1:100 em LB filtrou-se e crescer a DO600 0,4-0,6. </li><li> Girar e lavar 3 vezes em tampão fosfato salino (PBS) e ressuspender em definitivo uma DO600 de 0,1 (cerca de 1 x 10 7 células / ml). </li></ol> 4. Bactérias Injection <ol><li> Anestesiar o animal umd posição de lado, com a cauda apontada para sua mão dominante. Use pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia. </li><li> Dilatar a veia da cauda com água morna ou uma lâmpada de calor. </li><li> Carregar as bactérias (100 ul por rato) numa seringa de 1 ml e dobrar a ponta apenas menos do que 90 graus. </li><li> Alinhar a ponta da seringa com a veia da cauda, ​​penetrar a uma profundidade rasa (deve sentir nenhuma resistência), e injectar bactérias. Observe o deslocamento bloodflow para uma injeção de sucesso. </li></ol> 5. Rato de imagem <ol><li> Anestesiar animais na câmara de indução seguida, coloque cada mouse sobre a plataforma de imagem. Use pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia. Manter o posicionamento preciso para assegurar resultados quantitativos entre os pontos temporais. </li><li> Animais de imagem usando o sistema de imagem IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences). Se uma imagem mais do que um lugar de animais, barreiras de luz entre eles para evitar cross-illuminação. Os animais devem ser fotografada em primeiro lugar no lado ventral para confirmar a localização de bactérias. </li><li> Imagem de animais dorsalmente usando IVIS a cada 2 horas, para a duração da experiência (36 horas). Gerar um campo de tempo para um dado ROI. </li></ol> 6. Quantificar Biodistribution bacteriana <ol><li> Eutanásia animais usando CO 2 e colocar na parte de trás em uma fralda absorvente. </li><li> Ligue o animal para expor os dois flancos traseiros tumores subcutâneos. Cortar o tecido da pele circundante, para separar e remover os tumores. Segurando o tumor com uma pinça, retire a pele com um movimento tesoura invertida. Quando a maior parte da pele foi separada, a remover completamente o tumor, usando uma pinça. </li><li> Coloque os órgãos em microtubos pré-pesados. Uma vez que a massa destes tubos pode variar significativamente, é importante pré-pesar de resultados quantitativos. </li></ol> 7. Quantificar Biodistribution bacteriana <ol><li> Para cada ponto de tempo, consumo e pesar os tumores. </li><li> Adicionar 500 ul de PBS + 15% de glicerol e homogeneizar utilizando um Tissue-Tearor (BioSpec). Lavar as homogeneizador 3 vezes com etanol entre amostras. </li><li> Gerar diluições em série e placa para contagem de colônias de bactérias. Para prato várias diluições em uma única placa, utilizar placas pré-seccionados. </li></ol>

<ol><li>Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+phoP%2FphoQ-deleted%2C+aroA-deleted+live+oral+Salmonella+typhi+vaccine+strain+in+human+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers.</a> Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).</li>
<li>Leschner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Invasion+of+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+Is+Accompanied+by+Strong+Hemorrhage+Promoted+by+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha.</a> Plos One. 4 (8), (2009).</li>
<li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+tumor-targeting+bacteria+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).</li>
<li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+real-time+imaging+of+tumors+and+metastases+using+tumor-targeting+light-emitting+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli.</a> Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).</li>
<li>Choy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+noninvasive+fluorescent+and+bioluminescent+small+animal+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging.</a> Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).</li>
<li>Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-targeted+Salmonella+as+a+novel+anticancer+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector.</a> Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).</li>
<li>Fu, X., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+carcinoma+metastatic+models+constructed+in+nude+mice+by+orthotopic+transplantation+of+histologically-intact+patient+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens.</a> Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).</li>
<li>Ozbudak, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).</li>
<li>Elowitz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
<li>Toso, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+the+intravenous+administration+of+attenuated+Salmonella+typhimurium+to+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma.</a> J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).</li>
<li>Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+intravenous+administration+of+live+genetically+modified+salmonella+typhimurium+in+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma.</a> J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).</li>
<li>Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+perfect+%28bacterial%29+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor+gene+by+shRNA-expressing+Salmonella-mediated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi.</a> Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-seeking+Salmonella+amino+acid+auxotrophs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).</li>
<li>Nguyen, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+Salmonella+typhimurium+as+an+imageable+therapeutic+probe+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer.</a> Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+with+a+Salmonella+typhimurium+leucine-arginine+auxotroph+cures+orthotopic+human+breast+tumors+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice.</a> Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).</li>
<li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synchronized+quorum+of+genetic+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synchronized quorum of genetic clocks.</a> Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmentally+controlled+invasion+of+cancer+cells+by+engineered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria.</a> J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).</li>
<li>Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered gene circuits.</a> Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).</li>
<li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensing+array+of+radically+coupled+genetic+%27biopixels%27%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'.</a> Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).</li>
<li>Xu, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+delivery+of+siRNAs%3A+a+new+approach+to+solid+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy.</a> Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).</li>
<li>Zheng, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+amplified+protein+expression+therapy%3A+Salmonella+as+a+tumor-selective+protein+delivery+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector.</a> Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+balanced-lethal+host-vector+system+based+on+glmS%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS.</a> Plos One. 8 (3), e60511(2013).</li>
<li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Circuits+in+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic Circuits in Salmonella typhimurium.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li>
<li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+expression+dynamics+of+tumor-targeted+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+imaging+of+bacterial+infection+and+antibiotic+response+in+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Usando este procedimento, somos capazes de gerar campos de tempo para o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de bactérias que colonizam tumores. Embora estas medições são rotineiramente realizados in vitro em cultura descontínua ou dispositivos microfluidics, eles são muito mais difíceis de executar in vivo. Há diversas modificações que podem ser aplicadas a estes métodos. Quando foi utilizado o OVCAR-8 de linha de células para gerar os modelos de rato, um número d...

A biologia sintética progrediu rapidamente na última década e agora está posicionada para influenciar importantes problemas de energia e saúde. No entanto, a expansão na arena clínica tem sido retardado por questões de segurança e ausência de desenvolvimento de critérios de projeto para em circuitos genéticos in vivo. Acelerar aplicações médicas de alto impacto vai exigir a utilização de métodos que interagem diretamente com a infra-estrutura médica, circuitos genéticos que funcionam fora do ambiente de laboratório controlado, e hospedeiros microbianos seguras e clinicamente aceito. Um certo número de estirpes têm sido investigados para a terapia do cancro devido à sua capacidade para crescer preferencialmente em tumores. Estes incluíram C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, e S. typhimurium 3-8. S. typhimurium tem gerado interesse particular como eles exibiram segurança e tolerância em um certo número de ensaios clínicos em humanos 9-12. Estes bactericida<html> um foram inicialmente mostrado para criar efeitos anti-tumorais através da estimulação do sistema imunitário do hospedeiro e pela depleção de nutrientes necessários para o metabolismo de células do cancro. Produção de carga terapêutica foi adicionado mais tarde através de modificações genéticas. Embora estes estudos representam avanços importantes no uso de bactérias para as terapias do tumor, a maioria dos esforços actuais têm confiado na expressão de alto nível, que normalmente resulta na entrega de doses elevadas, os efeitos fora do alvo, e do desenvolvimento de resistência do hospedeiro 13-16 . Agora, a biologia sintética pode adicionar a produção de carga programável, utilizando circuitos genéticos computacionalmente desenhados que podem executar detecção avançadas e entrega 17-20. Estes circuitos podem ser concebidas para funcionar como sistemas de entrega que detectam estímulos específicos de tumores e auto-regulam a produção de cargas, conforme necessário. No entanto, o estudo da função destes circuitos in vivo tem sido até agora difícil. ve_content &quot;&gt; Desde plasmídeos são o quadro comum para circuitos sintéticos, nós descrevemos um método para caracterizar a dinâmica da expressão gênica baseada em plasmídeo in vivo utilizando um modelo de mouse. Estes métodos utilizam imagens luminescência time-lapse e medição quantitativa de biodistribuição. Juntos, essas abordagens fornecem uma estrutura para o estudo de redes baseadas em plasmídeo in vivo para aplicações clínicas.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina de 3/10 cc</td><td>BD Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Agulha PrecisionGlide </td><td>BD Biosciences</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X), líquido, com L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Caldo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Luria-Bertani</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr></tbody></table>

medindo o crescimento e expressão gênica dynamics do tumor-targeted<em&gt; s. typhimurium</em&gt; bactérias

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

O objetivo desses experimentos é gerar dados de curso de tempo quantitativos sobre o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de S. atenuada colônias bacterianas typhimurium crescimento dentro dos tumores. Geramos um modelo de xenoenxerto de tumores em ratos, por injecção subcutânea de uma linha de células de cancro do ovário humano, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Nós transformado cepas atenuadas de S. bactérias typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) com a luciferase expresso constitutivamente (luxCDABE) plasmídeo para visualização 2. Estas estirpes colonizar especificamente tumores, permanecendo essencialmente não virulento para o rato 1. Uma vez que os tumores eram mensuráveis ​​estabelecido, as bactérias foram injectados por via intravenosa através da veia da cauda, ​​com diferentes doses. Tumor-localizada, a expressão do gene bacteriano foi monitorizado em tempo real, ao longo de 60 horas utilizando umsistema de imagem in vivo (IVIS). Em cada ponto de tempo, os tumores foram excisados, homogeneizados e plaqueados para quantificar colónias bacterianas para a correlação com dados de expressão de genes. Juntos, estes dados produz uma medida quantitativa do crescimento in vivo de expressão do gene e da dinâmica do crescimento de bactérias no interior de tumores.

Usando este protocolo, somos capazes de gerar dados sobre o crescimento in vivo e da dinâmica de expressão de genes de bactérias específicas do tumor. O fluxo de trabalho global está resumida na figura 1. Na primeira etapa, nós injetar bactérias (verde) ea imagem do animal usando IVIS para medir a expressão do gene com luminescência (azul) como repórter. Em seguida, na segunda etapa, de consumo, homogeneizar e tumores placa para contagen...

O objetivo desses experimentos é gerar dados de curso de tempo quantitativos sobre o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de atenuado<em&gt; S. typhimurium</em&gt; Colônias de bactérias que crescem dentro dos tumores. Este vídeo aborda a preparação de células tumorais e implantação, preparação e injeção de bactérias, a imagem inteira animal-luminescência, a excisão do tumor, e contagem de colônias de bactérias.

Medindo o Crescimento e Expressão Gênica Dynamics do Tumor-Targeted<em&gt; S. Typhimurium</em&gt; Bactérias

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

O objetivo geral deste experimento é estudar a dinâmica da expressão gênica in vivo de bactérias S tyrian em crescimento no interior de tumores. Primeiro, em um modelo de câncer xenoenxertado em camundongo, as bactérias são injetadas intravenosamente pela veia da cauda. As bactérias colonizam o tumor e crescem exponencialmente enquanto a expressão gênica é visualizada utilizando repórteres luminiscentes.A imagem de bioluminescência de animais inteiros é realizada utilizando o sistema de imagem IVUS Spectrum. Ao longo de 24 a 48 horas, é obtida uma série temporal de imagens IVUS. Essa série de imagens é correlacionada com as contagens de colônias geradas pela homogeneização e plaqueamento de tumores.Conjuntamente, esses dados permitem-nos medir quantitativamente a expressão gênica e a dinâmica populacional de bactérias direcionadas a tumores in vivo, em tempo real, no preparo celular, em linhagens celulares utilizando técnicas padrão de cultura celular. Neste experimento, utilizamos células OCaR8 até atingir uma confluência-alvo de 80 a 100%. Colhemos e contamos as células em um hemocitômetro, ressuspendemos e colocamos em DMEM livre de fenol vermelho numa concentração-alvo de cinco

measuring-growth-gene-expression-dynamics-tumor-targeted-s

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Liu, P. C., et al. Projeto e uso de um morbidostato automatizado de baixo custo para evolução adaptativa de bactérias sob seleção de antibióticos. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra o uso de um chip microfluídico para visualizar e comparar o crescimento e a morfologia de cepas de E. coli do tipo selvagem e resistentes ao trimetoprima sob estresse antibiótico trimetoprima.

Crescimento bacteriano em um chip microfluídico para estudar a resistência a antibióticos

Descreve-se um método para controlar a ruptura endomembranar provocada pelas bactérias...

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Este artigo descreve o vídeo elevado rendimento oleoduto que tenha sido estabelecida com sucesso para infectar e analisar um grande número de embriões de peixes-zebra proporcionando uma nova ferramenta poderosa para o teste e composto de descoberta de medicamentos usando um animal vertebrado organismo inteiro.

Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas

Aqui, apresentamos abordagens fenômicas para a caracterização funcional de genes de fagos putativos. As técnicas incluem um ensaio desenvolvido capaz de monitorar o metabolismo anabólico do hospedeiro, as Placas de Ensaio Multi-fenótipo (MAPs), além do método consagrado de metabolômica, capaz de medir efeitos ao metabolismo catabólico.

Phenomics fago: Abordagens fisiológicas para Caracterizar Novel Proteínas Virais

O papel da variedade (segregação espacial) em cenários evolutivas podem ser examinadas utilizando sistemas microbianos simples no laboratório que permitem o ajuste da distribuição espacial controlada. Ao modificar a densidade de células fundador, vários níveis de sortimento pode ser visualizada usando cepas de bactérias fluorescente etiquetado nos biofilmes de colónias de Bacillus subtilis.

Monitoramento Espacial Segregação na superfície Colonizar microbianas Populações

Avaliação quantitativa do crescimento bacteriano é essencial para a fisiologia microbiana como um fenômeno de sistemas-nível de compreensão. Um protocolo para uma abordagem analítica e manipulação experimental são introduzidos, permitindo a análise precisa, elevado-throughput de crescimento bacteriano, que é um tema chave de interesse em biologia de sistemas.

Preciso, elevado-throughput análise do crescimento bacteriano

Descrito aqui é um método de análise de expressão gênica bacteriana em tecidos animais em nível celular. Este método fornece um recurso para estudar a diversidade fenotípica ocorrendo dentro de uma população bacteriana em resposta ao ambiente de tecido durante uma infecção.

Um método baseado em fluorescência para estudar o Regulamento de Gene bacteriano em tecidos infectados

O crescimento de culturas bacterianas radiolabeled em pratos do de microtitulação facilita a amostragem elevada da taxa de transferência que permite testes técnicos e biológicos múltiplos da repetição da abundância da associação do nucleotide, incluindo aquele de (p) ppgpp. Os efeitos das transições de crescimento provocados por fontes de estresse fisiológico, bem como a recuperação do estresse podem ser monitorados.

Usando microtiter prato Radiolabeling para múltiplo in vivo medições de Escherichia coli (p) ppGpp seguido por cromatografia em camada fina

Fenótipos de crescimento de leveduras são precisamente medidos através de imagens de lapso de tempo altamente paralelas de células imobilizadas crescendo em microcolônias. Simultaneamente, a tolerância ao estresse, a expressão proteica e a localização da proteína podem ser monitoradas, gerando conjuntos de dados integrados para estudar como as diferenças ambientais e genéticas, bem como a heterogeneidade de expressão genética entre as células isogênicas, modulam o crescimento.

Imagem ao vivo de alta taxa de microcolônias para medir heterogeneidade no crescimento e expressão genética

A persistência de antibióticos descreve a capacidade de pequenas subpopulações dentro de uma população isogênica sensível de tolerar transitoriamente altas doses de antibióticos bactericidas. O presente protocolo combina abordagens para caracterizar o fenótipo de persistência do antibiótico em nível molecular e celular após exposição de Escherichia coli a doses letais de ofloxacina.

Análise Populacional e Unicelular da Persistência de Antibióticos em Escherichia coli

Os bacteriófagos (fagos), vírus que infectam bactérias, são um componente integral do microbioma intestinal. Embora esses habitantes simbióticos impulsionem a aptidão bacteriana e a dinâmica populacional, pouco se entende sobre como eles afetam a homeostase intestinal e a doença. Este protocolo estuda fagos isolados de T4 dentro de um modelo murino, adaptável a outros pares fago-bactérias.

Interação Bacteriófago T4 e E. coli no Intestino Murino: Um Modelo Prototípico para Estudo da Dinâmica Hospedeiro-Bacteriófago In Vivo

Aprenda a medir a dinâmica de crescimento e expressão gênica de bactérias S. Typhimurium em tumores usando imagem de bioluminescência em modelo murino. Este método permite monitorar terapias bacterianas em oncologia.

Medindo o Crescimento e Expressão Gênica Dynamics do Tumor-Targeted

Explorar mais vídeos