Medindo o Crescimento e Expressão Gênica Dynamics do Tumor-Targeted S. Typhimurium Bactérias

O objetivo geral deste experimento é estudar a dinâmica da expressão gênica in vivo de bactérias S tyrian que crescem dentro de tumores. Primeiro, em um modelo de câncer de xenoenxerto de camundongo, as bactérias são injetadas por via intravenosa pela veia da cauda. As bactérias colonizam o tumor e crescem exponencialmente enquanto a expressão gênica é visualizada usando repórteres luminescentes.

A imagem de bioluminescência de animais inteiros é realizada usando o sistema de imagem de espectro IVUS. Ao longo de 24 a 48 horas, é feito um curso de tempo de imagens IVUS. Esta série de imagens está correlacionada com a contagem de colônias geradas por tumores homogeneizantes e plaqueados.

Juntos, esses dados nos permitem medir quantitativamente a expressão gênica e a dinâmica populacional de bactérias alvo do tumor in vivo em tempo real, passagem de preparação celular, linhagens celulares usando técnicas padrão de cultura de células. Neste experimento, usamos ocar oito células brutas para uma fluência alvo de 80 a 100% Colher e contar células em um hemo, citômetro, resus, suspensão e DMEM livre de vermelho de fenol a uma concentração alvo de cinco vezes 10 a sete células por mililitro, ou cerca de 200 microlitros por frasco. Adicione 15% de matrigel de fator de crescimento reduzido e mantenha a suspensão celular no gelo até a implantação do tumor.

Anes anestesiava camundongos nus fêmeas de quatro semanas usando 3% de flúor. Carregue as células 100 microlitros por tumor em uma seringa de um moinho e conecte uma agulha de calibre 27 e meio para cada um dos dois locais de injeção bilaterais no flanco posterior. Levante a pele suavemente com uma pinça para fazer uma barraca e injetar células na base.

Tome cuidado para não penetrar muito fundo produzindo sangue. Use uma pinça para remover suavemente a seringa sem respingos. Monitore o crescimento do tumor diariamente por 10 a 20 dias até que um diâmetro de tumor de dois a quatro milímetros seja atingido.

Preparação de bactérias, inicie uma cultura noturna de bactérias em meio LB de três mils mais antibióticos de um freezer de menos 80 ou de uma placa refrigerada. Neste experimento utilizamos a cepa ELH quatro 30 da manhã. Dilua a cultura de um a 100 em lb filtrado e cresça até um OD 600 de 0,4 a 0,6.

Gire e lave três vezes em solução salina tamponada com fosfato e ressuspenda a um OD final 600 de 0,1 ou cerca de uma vez 10 elevado a sete células por mil. Injeção de bactérias, anestesiar animais e posicionar com a cauda apontando para a mão dominante. Localize a veia da cauda e dilate usando água morna ou uma lâmpada de calor.

Carregue as bactérias 100 microlitros por mouse em uma seringa de um mil e dobre o chip a menos de 90 graus. Alinhe a ponta da seringa com a veia da cauda, penetre a uma profundidade rasa sem sentir resistência e injete bactérias. Observe o deslocamento do fluxo sanguíneo para uma injeção bem-sucedida.

Aguarde cerca de 12 a 18 horas antes de fazer exames de imagem para que ocorra a colonização. A imagem do camundongo anestesia os animais na câmara de indução. Em seguida, coloque cada mouse na plataforma de imagem.

Mantenha um posicionamento preciso para garantir resultados quantitativos entre os pontos de tempo, crie imagens de animais usando o sistema de imagem Ibis Spectrum. Se estiver visualizando mais de um animal, coloque barreiras de luz entre eles para evitar a dissecção do animal com iluminação cruzada, segurando o tumor com uma pinça. Remova a pele usando um movimento reverso de tesoura.

Movimento: Quando a maior parte da pele tiver sido separada, remova totalmente o tumor usando uma pinça. Coloque os órgãos e os tubos de microcentrífuga pré-pesados. Como a massa desses tubos pode variar significativamente, é importante pesá-los previamente para obter resultados quantitativos.

Quantificando a biodistribuição bacteriana para cada ponto de tempo excisar e pesar os tumores, adicionar 500 microlitros de PBS mais 15% de glicerol e homogeneizar usando uma ruptura de tecido, gera diluição em série e placa para resultados representativos de contagem de colônias bacterianas. Usando este protocolo, somos capazes de gerar dados sobre o crescimento in vivo e a dinâmica da expressão gênica de bactérias alvo do tumor. O fluxo de trabalho geral é resumido aqui.

Na primeira etapa, injetamos bactérias e fotografamos o animal usando ivus para medir a expressão gênica com luminescência como repórter. Então, no segundo estágio, extirpamos, homogeneizamos e plaqueamos tumores para contagem de colônias para determinar o número de bactérias que crescem no tumor. A bioluminescência gerada por cepas bacterianas é visualizada usando aumentos de sinal de ivus com a dosagem injetada com uma dosagem mínima de colonização em torno de cinco vezes 10 a cinco em todos os casos devido a atenuações.

As bactérias colonizaram especificamente tumores ou não crescem significativamente no sinal dos camundongos é quantificado usando unidades de radiância para normalizar o tempo de exposição ou valores típicos acima de 10 a seis ou mais são indicativos de colonização para uma determinada infecção O sinal aumenta com o tempo ao longo de 24 a 48 horas. O pico de início ocorre cerca de 36 horas após a injeção aqui, mas o tempo pode variar dependendo da cepa e do plasmídeo que está sendo usado. Certifique-se de posicionar o mouse exatamente da mesma maneira todas as vezes para garantir resultados quantitativos no próximo conjunto de experimentos.

A biodistribuição bacteriana é quantificada para medir o crescimento de bactérias ao longo do tempo em diferentes órgãos, bactérias e tumores viáveis são quantificados extirpando e homogeneizando o tumor e plaqueando sua diluição serial. Outros órgãos podem ser quantificados. Da mesma forma, aqui usamos o baço, pois a proporção do baço do tumor é uma medida típica de especificidade bacteriana após o cálculo usando o fator de diluição.

Essas contagens nos permitem medir a população bacteriana específica ao longo do tempo. À esquerda, podemos ver o número de bactérias crescer de forma constante ao longo da duração do experimento. Com um tempo de duplicação entre uma e três horas, substancialmente menor do que em experimentos de cultura em lote.

Isso provavelmente se deve às más condições de nutrientes no microambiente tumoral. À direita, quantificamos a proporção de baço tumoral e observamos que ela aumenta ao longo do experimento. O objetivo desses experimentos é monitorar quantitativamente a dinâmica do crescimento e a expressão gênica de bactérias e ambientes tumorais usando técnicas de imagem IVUS e contagem de colônias.

Mostramos que populações de bactérias podem ser caracterizadas in vivo em ambientes tumorais. No futuro, programas de expressão gênica mais complexos podem ser projetados e projetados para construir sistemas sofisticados de entrega terapêutica em bactérias.