Geração de subcutânea e intra-hepática Humanos carcinoma hepatocelular Xenoenxertos em Immunodeficient Ratos

O objetivo geral deste procedimento é gerar carcinoma hepatocelular humano hepatocelular subcutâneo ou hepático interno ou xenoenxertos de CHC em camundongos imunodeficientes. Isso é feito preparando primeiro fragmentos de tumor ou uma suspensão de célula única de uma amostra fresca de CHC humano fresco para implantação nos camundongos para xenoenxertos subcutâneos. O próximo passo é injetar células tumorais ou implantar fragmentos tumorais em uma bolsa dorsal subcutânea para xenoenxertos intra-hepáticos.

O próximo passo é injetar células tumorais no baço ou no fígado, ou implantar fragmentos tumorais diretamente no fígado na etapa final. Os animais são observados por várias semanas até que os tumores se desenvolvam. Em última análise, os xenoenxertos de CHC humano podem ser usados para estudar muitos aspectos da biologia do tumor, incluindo os mecanismos de tumorgênese e respostas a novas terapias.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o uso de linhagens celulares ou xenoenxertos subcutâneos, é que, com esta técnica, as amostras primárias de câncer de fígado humano e os xenoenxertos intra-hepáticos derivados de pacientes fornecem um modelo biológico mais realista de carcinoma hepatocelular humano. Demonstrando o procedimento estará Sharif Ahmed, um cientista pesquisador de pós-doutorado do meu laboratório para implantação subcutânea dos fragmentos tumorais. Primeiro coloque o camundongo anestesiado em decúbito ventral, mantendo a anestesia inalatória de flúor com bocal.

Aplique gel lacrimal para proteger os olhos do animal de lesões traumáticas e, em seguida, esterilize a área dorsal raspada com esfoliação cirúrgica Betadine, seguida de etanol a 70% e, por último, com solução de iodopovidona. Em seguida, use uma tesoura afiada para fazer uma incisão de cinco milímetros na pele. Insira a ponta de uma tesoura cega fechada no espaço subcutâneo e, em seguida, abra suavemente a tesoura para desenvolver uma bolsa grande o suficiente para acomodar um fragmento de tumor.

Em seguida, use um par de pinças finas para inserir o fragmento tumoral na bolsa subcutânea usando clipes para fechar a incisão após o fragmento ter sido colocado pouco antes da injeção de suspensão de lótus de células tumorais em matrigel em uma seringa de insulina tampada com uma agulha de calibre 29 por meia polegada. Em seguida, insira a agulha no espaço subcutâneo de um animal anestesiado e raspado, avançando a agulha vários milímetros ao longo do plano subcutâneo para longe do local da punção e descarregue o conteúdo da seringa Para preparar o animal para enxerto com tecido tumoral humano. Comece administrando subcutaneamente 350 microlitros de solução salina normal estéril com uma agulha de calibre 27 por meia polegada em uma seringa de um mililitro no dorso do pescoço de um animal anestesiado para compensar preventivamente qualquer perda de fluido intraoperatório.

Em seguida, depois de anestesiar o camundongo em decúbito dorsal em uma almofada pré-aquecida, estenda os membros do animal e prenda-os com fita adesiva na superfície de operação para otimizar a exposição do abdômen ventral e do tórax. Posicione uma lâmpada de aumento acima do animal e, em seguida, esterilize a pele raspada no abdômen ventral e no tórax, conforme demonstrado. Usando uma tesoura afiada, faça uma incisão bilateral transversal na pele subcostal e, em seguida, divida as camadas musculares para expor todo o fígado.

Coloque um ponto na pele acima do processo xifóide e prenda-o ao bocal com fita adesiva para permitir uma melhor exposição do fígado e das estruturas circundantes. Em seguida, estabilize o fígado com dois aplicadores com ponta de algodão adjacentes e posteriores ao tecido. Em seguida, use uma tesoura afiada para dividir o ligamento falciforme ligado ao lobo mediano do fígado.

Mobilize o lobo esquerdo do fígado com um aplicador de ponta de algodão e posicione um nó solto de cinco suturas de seda ao redor do lóbulo. Avance o nó o mais próximo possível em direção ao pedículo bi do lobo esquerdo e, em seguida, aperte-o. Em seguida, use uma tesoura para extirpar o lóbulo distal à ligadura, deixando um pequeno coto para evitar o deslizamento do nó e subsequente hemorragia.

Usando uma técnica semelhante, ligue e ressece a maior parte do lobo mediano do fígado e, em seguida, use surgicel e pressão suave com um aplicador com ponta de algodão ao longo das superfícies de corte do parênquima hepático para obter hemostasia completa. Finalmente, execute o xenoenxerto intra-hepático de um fragmento tumoral ou células tumorais, ou o xenoenxerto intra-hepático de células tumorais por injeção esplênica, conforme demonstrado nas seções a seguir. Para implantação intra-hepática de fragmentos tumorais, use uma lâmina de bisturi número 10 para primeiro fazer uma incisão de três milímetros de comprimento e profundidade na superfície do fígado.

Em seguida, aplique imediatamente o surgicel e uma leve pressão no local da incisão por 60 a 90 segundos para obter a hemostasia Quando a hemostasia completa for alcançada, use uma pinça fina para colocar um fragmento de tumor na incisão hepática. Em seguida, aplique um pequeno pedaço de cirúrgica sobre a incisão para implantação hepática de células tumorais por injeção direta no fígado. Insira uma agulha de seringa de insulina carregada com suspensão de células tumorais no fígado exposto e avance a ponta alguns milímetros além do local da punção ao longo do plano subcapsular.

Descarregue suavemente o conteúdo da seringa e remova a agulha do fígado. Em seguida, coloque o surgicel sobre o local da punção e aplique uma leve pressão com um aplicador com ponta de algodão para evitar o vazamento da suspensão de células tumorais e obter hemostasia completa para xenoenxerto intra-hepático de células tumorais por injeção no baço. Posicione os camundongos na posição de decúbito lateral direito e use uma tesoura afiada para fazer uma incisão subcostal esquerda de um centímetro para entrar na cavidade peritoneal.

Em seguida, use um aplicador com ponta de algodão para refletir o estômago no lado direito do animal. Para expor o baço manuseando os tecidos adiposos circundantes com uma pinça fina e traumática, entregue o baço na incisão e coloque um duplicador de ponta de algodão atrás do baço para estabilizar o tecido. Agora use uma sutura de seda de cinco oh para colocar um nó de pretético solto ao redor do baço acima do pólo inferior.

Insira uma agulha de seringa de insulina carregada com suspensão de células tumorais no pólo inferior do baço e avance-a além do nível do nó solto. Em seguida, descarregue lentamente o conteúdo da seringa, remova a agulha do baço e aperte o nó para evitar qualquer vazamento da suspensão de células injetadas. Finalmente, recoloque o baço na cavidade peritoneal.

Nesta imagem, é mostrada uma amostra de ressecção hepática de um paciente com CHC que não recebeu nenhuma terapia adjuvante ao tumor. A caixa branca indica uma porção viável do tumor perto da periferia que foi obtida para xenoenxerto. O desenvolvimento e o crescimento de xenoenxertos subcutâneos podem ser prontamente monitorados pelo exame diário dos camundongos receptores.

Por exemplo, a aparência típica de um xenoenxerto subcutâneo de CHC humano, que é visualmente distinto dos tecidos circundantes, e a aparência histopatológica correspondente do tumor são mostrados. A histologia do tumor demonstra as características típicas do CHC, incluindo células semelhantes a hepatócitos com AIA nuclear e alta razão citoplasmática dec nuclear, ausência de rastros portais e trabéculas distorcidas com aumento da espessura das placas hepatocelulares. Nessas imagens, as aparências típicas de um xenoenxerto de CHC humano intra-hepático obtido a partir da implantação direta de tecido tumoral no fígado, bem como a obtida a partir da injeção de células tumorais no baço, são mostradas com os tumores intraparenquimatosos indicados pela seta preta em cada imagem.

Esta seção histológica através da margem de um enxerto xog intra-hepático demonstra as características típicas do CHC humano e do fígado de camundongo adjacente ao normal. A tabela resume as taxas de enxerto tumoral alcançadas após o implante de tecidos primários de carcinoma hepatocelular humano em camundongos imunodeficientes. Usando as diferentes técnicas demonstradas para cada método de implantação, o denominador da taxa de absorção do tumor reflete uma amostra única de CHC humano.

Esses dados demonstram que, para tecidos primários de CHC humano, as taxas de enxerto subcutâneo são inferiores às taxas de enxerto intra-hepático alcançadas por injeção intra-esplênica de células tumorais ou implante intra-hepático de fragmentos tumorais, e que a hepatectomia parcial parece aumentar o enxerto intra-hepático. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar a técnica estéril e obter hemostasia completa, pois camundongos pequenos imunocomprometidos de seis a oito semanas são suscetíveis a infecções e podem não sobreviver nem mesmo a uma pequena quantidade de sangramento pós-operatório.