Melhorar a taxa de sucesso de cristalização de proteínas pela Random Microseed Matrix Screening

O objetivo geral deste procedimento é melhorar o número e a qualidade da difração de cristais de proteínas obtidos a partir de um experimento de triagem de cristalização. Para fazer isso, um material cristalino ou precipitado é identificado a partir de um experimento de triagem de cristalização de proteína existente estabelecido usando uma proteína alvo de interesse, o material cristalino ou precipitado é colhido e então usado para gerar um estoque de sementes de cristal. Em seguida, uma série de telas de cristalização é estabelecida contendo a proteína alvo de interesse e as sementes de cristal.

Finalmente, as telas de cristalização semeadas são monitoradas quanto à formação de cristais e quaisquer novos cristais de proteína são caracterizados. Em última análise, a aplicação deste procedimento pode resultar em um aumento do número, tamanho e qualidade de difração de cristais de proteínas obtidos a partir de experimentos de triagem de cristalização. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes, por exemplo, micro semeadura tradicional ou macro semeadura, são que ela pode ser realizada rapidamente, é altamente escalável e amostra significativamente mais espaço de cristalização do que outros métodos de semeadura.

Outra vantagem dessa técnica é que ela não requer o uso de matéria-prima cristalina de alta qualidade para a produção de sementes. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque um grau significativo de destreza manual é necessário durante as etapas de colheita e manipulação de cristais. Demonstração visual de se o método é crítico, pois a micro semeadura de matriz aleatória se desvia significativamente de outros métodos de semeadura de cristal.

As sutilezas desse método são a chave para o sucesso, e várias delas são difíceis de comunicar com precisão em forma de texto. Comece este procedimento apenas com uma bandeja de cristalização assentada usando um microscópio binocular ou sistema de imagem de cristal. Inspecione a bandeja todos os dias durante a primeira semana.

Então, uma vez por semana, anote o tamanho do cristal. Assim que não houver evidência de crescimento adicional, selecione um ou mais poços apropriados da bandeja para colher material cristalino. Para a geração de estoque de sementes, qualquer material pode ser usado, incluindo agulhas finas, luzes espiais, microcristais e cristais irregulares e mal formados.

O material mais antigo tem maior probabilidade de ser parcialmente reticulado e é menos adequado para uso em experimentos de semeadura. No dia da colheita, use um pães inflamados para fazer uma sonda arredondada de uma pipeta de pasto de vidro. Para fazer isso, aqueça a pipeta perto do meio até que fique macia.

Em seguida, remova-o rapidamente da chama e retire-o separando as pontas. Procure puxar o vidro para um diâmetro inferior a 0,25 milímetros no ponto em que ele está a cerca de 0,25 milímetros. Quebre o vidro e mergulhe brevemente a ponta quebrada na chama.

Repita esse processo até formar um hemisfério de vidro na extremidade com um diâmetro de aproximadamente 0,75 milímetros. Coloque um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo uma conta de semente no gelo. Em seguida, abra a bandeja de cristalização selecionada.

Bem, para 24 bandejas suspensas de poço. Use uma pinça para remover a lamínula. Em seguida, inverta a lamínula e coloque-a sobre uma superfície limpa e estável.

Para 96 bandejas de queda bem sentadas. Use um bisturi para cortar ao redor do filme plástico do teto na parte superior do poço selecionado e, em seguida, remova a parte excisada do filme do teto usando uma pinça. Remova 50 microlitros da solução do reservatório e transfira esse líquido para o tubo de microcentrífuga contendo a conta de semente, garantindo que o tubo permaneça no gelo o tempo todo.

É importante fazer isso exatamente como descrito e o mais rápido possível. Tome cuidado para esmagar completamente o material da semente com a sonda e recuperar o máximo que puder enquanto visualiza a amostra ao microscópio. Use a sonda de vidro preparada anteriormente para esmagar completamente os cristais na tampa.

Deslizamento cai. Pequenos cristais podem levar vários minutos para serem esmagados completamente. Os cristais fáceis de esmagar não são reticulados e não são cristais de sal.

Enquanto os cristais de sal produzem um clique distinto que pode ser ouvido e sentido quando são esmagados. Em seguida, remova cinco microlitros da solução do reservatório do tubo de contas de sementes e transfira para o subpoço equivalente para um experimento de gota sentada ou lamínula para um experimento de gota suspensa contendo o material cristalino a ser colhido. Pipete este líquido para cima e para baixo cinco a seis vezes para ressuspender o máximo possível do poço secundário ou do conteúdo da lamínula.

Retorne a suspensão ao tubo da miçanga e repita esta etapa mais duas vezes, garantindo que o máximo de material cristalino seja colhido Vórtice, a conta da semente por dois minutos, parando a cada 30 segundos para resfriar o tubo no gelo. Em 1,5, tubos de mililitros contendo solução de reservatório.

Faça uma série de diluição para arquivar a diluição do estoque de sementes na solução do reservatório por um fator de quatro a 10 em cada estágio. Se a semente, o estoque e as diluições não forem usados imediatamente, coloque alíquotas de 10 a 20 microlitros em um freezer de 20 graus Celsius negativos ou 80 graus Celsius negativos para armazenamento. Uma vez congeladas, as existências de sementes podem ser mantidas indefinidamente até serem necessárias.

A triagem de cristalização RMMS pode ser realizada usando bandejas de 24 poços empregando o método de difusão de vapor de gota suspensa ou bandejas de 96 poços usando o método de difusão de vapor de gota sentada. Para realizar nossa triagem MMS em 24 bandejas suspensas de poços, use uma pipeta para transferir manualmente 300 microlitros de cada condição de uma tela de cristalização de 96 condições em 10 mililitros. Formato de tubo único para cada poço de 4 24.

As bandejas de cristalização bem pré-lubrificadas de cada reservatório de 300 microlitros transferem um microlitro de cada condição de cristalização para a superfície de uma lamínula de plástico correspondente, da qual as tiras protetoras dianteiras e traseiras foram removidas para um microlitro. Na lamínula, adicione um microlitro de solução de proteína e, em seguida, 0,5 microlitros de caldo de semente de cristal. Na primeira rodada de RMMS, é importante não usar a solução de estoque de sementes diluída.

Como quanto maior a concentração de sementes, mais acertos de cristalização serão obtidos. Inverta cada lamínula de modo que a gota de líquido fique voltada para baixo e posicionada acima da apropriada. Pressione bem para baixo a lamínula, comprimindo a graxa do teto e formando uma vedação segura.

Depois que todas as 96 gotas estiverem estabelecidas, transfira a bandeja para uma incubadora de quatro a 18 graus Celsius ou para uma sala de temperatura constante para armazenamento. Para realizar nossa triagem MMS em 96, bandejas de queda bem sentadas. Use um robô de cristalização ou uma pipeta de oito canais para transferir de 20 a 50 microlitros de cada condição de uma tela de cristalização de 96 condições em formato de bloco de poço profundo para cada poço correspondente da bandeja de cristalização.

Em seguida, transfira 1,0 microlitros de solução proteica, 1,0 microlitros de condição de cristalização e 0,5 microlitros de estoque de sementes para as gotas. Sele a bandeja usando uma folha de teto transparente e transfira-a para uma incubadora de quatro a 18 graus Celsius ou sala de temperatura constante para experimentos de armazenamento deve ser inspecionada uma vez a cada 24 horas por cinco dias após o estabelecimento e, posteriormente, uma vez a cada sete dias por até quatro semanas usando um microscópio binocular ou um sistema de imagem de cristal. Inspecione cada subpoço ou lamínula em sequência e registre qualquer evidência de formação de cristais.

Compare os resultados de nossos experimentos de triagem de MMS com os de telas não ED e registre quaisquer diferenças. Podem ser necessários vários ciclos observados de RMMS. Antes da difração ideal, cristais de qualidade são produzidos para ciclos adicionais.

Use os estoques de sementes diluídas arquivados conforme necessário para controlar o número de cristais por poço. Para demonstrar a eficácia do RMMS. Métodos de triagem foram aplicados à cristalização de henna, lisozima branca e catalisador de fígado bovino para cada condição de proteína 3 96.

Foram utilizadas telas de cristalização: J-C-S-G-P-A-C-T, e Morpheus. Então, após cinco dias, uma única condição de cada bandeja que foi encontrada para suportar o crescimento de material cristalino foi selecionada e usada para a geração de estoque de sementes. Após cinco dias, as bandejas de cristalização foram inspecionadas e o número de gotas com cristais foi registrado.

Esta figura resume os resultados deste experimento e fornece análise quantitativa para a lisozima da clara de ovo de galinha. Um aumento de quatro a dez vezes na taxa de sucesso de cristalização em comparação com bandejas não ED foi observado quando o RMMS foi aplicado a essa proteína. Notavelmente, para a catalase hepática bovina, apenas uma única condição na tela Morpheus produziu cristais em comparação com 55 condições identificadas após o uso de RMMS.

Além disso, houve um aumento de três e duas vezes na taxa de sucesso da cristalização de latas de fígado bovino usando telas JCSG e PACT, respectivamente, em todos os casos, e independentemente da tela de cristalização usada, nossa triagem MMS produziu um número total significativamente maior de cristais do que a triagem não RMMS. Concluímos que nosso MMS é uma abordagem simples, mas poderosa, que pode aumentar significativamente a taxa de sucesso dos experimentos de triagem de cristalização de proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um experimento de triagem de matriz semeada por micros aleatórios desde a identificação e colheita de material cristalino até a preparação do estoque de sementes de cristal e, finalmente, o estabelecimento da cristalização semeada Uma vez dominado.

Essa técnica pode ser feita em menos de uma hora. Para experimentos de triagem de micro semeadura de matriz aleatória realizados usando um robô de manuseio de líquidos ou em cerca de três horas para experimentos realizados manualmente. Ao tentar este procedimento, é importante garantir que todas as telas de cristalização semeadas estejam bem vedadas antes do armazenamento.