Grampo patch Gravações de Embryonic Cells Zebrafish Mauthner
10 de setembro de 2013
Nós desenvolvemos uma preparação cordão intacto cérebro espinhal para gravar e monitorar a atividade elétrica através de patches gravação braçadeira dos neurônios e outras células Mauthner reticulospinais em embriões de peixe-zebra. Assim, somos capazes de gravar correntes sinápticas excitatórias e inibitórias, a atividade do canal voltagem-dependentes e potenciais de ação dos neurônios-chave em um embrião em desenvolvimento.
O objetivo geral deste procedimento é registrar as propriedades sinápticas e de excitabilidade do peixe-zebra embrionário na boca de suas células. Isso é feito dissecando primeiro o embrião do peixe-zebra para expor a superfície ventral do cérebro posterior. O segundo passo é colocar a preparação dissecada no palco de um microscópio patch clamp e identificar a boca em suas células.
Próximo patch. Prenda as células M usando o modo de gravação apropriado e registre a atividade sináptica e as propriedades de excitabilidade. A etapa final é analisar os dados registrados para determinar as propriedades sinápticas ou de excitabilidade.
Em última análise, o patch clamping dessas células é usado para mostrar as propriedades dos receptores sinápticos em um organismo em desenvolvimento. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão duas áreas principais de dificuldade. A primeira é a dissecação.
A segunda formação da cena gig pode ser desafiadora. Tive a ideia para este método pela primeira vez quando decidi trabalhar em uma preparação de peixe-zebra na qual o cérebro posterior estava ligado à medula espinhal, demonstrando que o procedimento será burram Roy, um estudante de doutorado em meu laboratório, Comece este procedimento preparando o prato de dissecação forrado com Sard. Primeiro, fixe as arruelas na corrediça com graxa.
Em seguida, adicione sardinha líquida no centro da lavadora. A sardinha geralmente cura durante a noite e forma uma pequena cama circular na lâmina de vidro, que se torna a base do prato de dissecação. Depois de colocar uma lamínula na lâmina, coloque-a na câmara de gravação para servir de base para a dissecação.
Depois, prepare as soluções necessárias. As soluções extracelulares devem ser deixadas à temperatura ambiente, enquanto as soluções intracelulares devem ser mantidas estéreis. Pode-se também adicionar 0,1% de amarelo à solução intracelular, de modo que a visualização da morfologia das células M possa ser realizada no final do experimento para confirmar a identidade celular.
Em seguida, crie os embriões de peixe-zebra do tipo selvagem em água com ovo a 28,5 graus Celsius e colete e prepare de acordo com a publicação anterior. Para dissecação, transfira os embriões para a placa de dissecação que também serve como câmara de registro. Em seguida, anestesiá-los por sete a 10 minutos.
Em uma solução salina anestesiante que se aproxima da solução salina fisiológica, pode-se determinar se eles estão adequadamente anestesiados examinando a resposta a um leve beliscão da cauda. Depois, prenda os embriões através do não acordo e no prato de linha de proteção SIL com fio de tungstênio de 0,001 polegada sob um microscópio de dissecação com ampliação de 25x. Ajuste a ampliação do escopo de dissecação para 40 a 50 x para realizar a dissecção.
Agora, remova os olhos da mandíbula e o prosencéfalo usando uma fina pinça. Retire suavemente o rombencéfalo da medula do nó subjacente, trabalhando cuidadosamente a pinça entre a medula do nó e o cérebro. Em seguida, vire suavemente o cérebro posterior para que a superfície ventral fique voltada para cima.
Esse posicionamento fornece bom acesso às células M, que geralmente estão dentro de cinco a 10 micrômetros da superfície ventral em embriões jovens e de 20 a 50 micrômetros em larvas mais velhas. Em seguida, mova cuidadosamente a preparação para a configuração de gravação, onde o experimento do patch clamp pode ser executado. As células M são visualizadas com contraste de interferência diferencial, embora outros modos de imagem também possam ser usados para se preparar para o patch clamping.
Comece puxando algumas pipetas de CLA com vidro de silicato bo de paredes finas. Em uma pipeta de tração horizontal, os diâmetros da ponta são de cerca de 0,2 a 0,4 micrômetros após o polimento a fogo para uma borda lisa, e o cone da haste tem cerca de quatro milímetros de comprimento. Encha a ponteira da pipeta com solução intracelular, mergulhando-a no líquido intracelular.
Em seguida, insira uma agulha de seringa na pipeta e expulse suavemente a solução intracelular da seringa. Para terminar de encher a pipeta, conecte a pipeta ao ampestágio da cabeça do amplificador Na configuração de eletrofisiologia, é importante manter o estágio do cabeçote em um ângulo de aproximadamente 45 graus em relação ao eixo horizontal, pois isso garante um ângulo de entrada para a pipeta adequado para a formação de vedações de alta resistência com a boca em sua célula logo antes de a pipeta abaixar na solução do banho, Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva na pipeta para reduzir a chance de bloqueio da ponta. Continue a se aproximar da célula M com uma pequena quantidade de pressão positiva na pipeta.
A pressão positiva empurra suavemente a célula de um lado para o outro e, quando posicionada imediatamente sobre a célula, forma uma pequena covinha na membrana celular. Agora deixe a pipeta no lugar por alguns segundos para limpar suavemente a superfície da célula para que uma vedação forte entre a pipeta e a membrana possa ser formada. Em seguida, libere a pressão positiva na pipeta para iniciar a vedação.
Uma pequena quantidade de pressão negativa juntamente com potencial de pipeta negativo resulta na formação de selos giga em poucos segundos. Em seguida, altere o potencial de retenção no amplificador para menos 60 milivolts. Rompa a membrana celular com uma série de pulsos curtos de sucção.
Em seguida, registre imediatamente os potenciais de membrana e minimize os artefatos de capacitância. Compense a capacitância da célula e a resistência de acesso em 70 a 85%A resistência de acesso deve ser monitorada a cada 30 segundos a um minuto e, se houver uma alteração de 20% ou mais, aborte o experimento. Assim que o experimento terminar e dados suficientes forem adquiridos, sacrifique o embrião removendo o cérebro posterior com um par de fórceps.
Esta figura mostra os registros representativos das correntes excitatórias dos receptores A MPA e NMDA obtidas de 48 embriões HPF. Aqui estão os PSCs espontâneos de A MPA ME registrados de uma célula M com um potencial de retenção de menos 60 milivolts. E este é o ME PSCs médio.
Aqui estão as PSCs espontâneas de A MPA e NMDA me registradas de uma célula M com um potencial de retenção de 40 milivolts. E esta é a média de ME PSCs glutamato me PSCs foram registradas na presença de um TTX micromolar para bloquear potenciais de ação cinco micromolares estritos nove e 100 micromolares ritoxina para bloquear glicina e G ocorrência mostrada. Aqui estão os PSCs de IM espontâneos registrados de uma célula M com um potencial de retenção de menos 60 milivolts.
E as PSCs médias de IM foram registradas na presença de um TTX micromolar para bloquear os potenciais de ação. Um ácido quimérico milimolar para bloquear a atividade do receptor de glutamato e 10 micromolares por Qing para bloquear a ocorrência de GABA. Estes são os potenciais de ação registrados de uma célula M nesta célula em particular.
Um estímulo de limiar SRA de 0,48 nano amperes provocou vários potenciais de ação, mas um estímulo ao limiar resulta apenas na produção de um único potencial de ação. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas a quatro horas, se executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como corrigir o registro de grampo de células M e outros neurônios espinhais reticulares em embriões de peixe-zebra.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método para registrar a atividade elétrica de neurônios de Mauthner e células reticulospinais em embriões de peixe-zebra utilizando uma preparação intacta do encéfalo e medula espinhal. A técnica permite a análise de correntes sinápticas, atividade de canais ativados por voltagem e potenciais de ação em neurônios em desenvolvimento.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Biologia do Desenvolvimento
Antecedentes
- Os embriões de peixe-zebra são valiosos para o estudo do desenvolvimento neuronal.
- Os neurônios de Mauthner desempenham um papel fundamental na resposta de fuga.
- As técnicas de patch clamp são essenciais para investigar as propriedades sinápticas.
- Compreender a atividade sináptica é crucial para obter insights sobre a circuitaria neural.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para registrar a atividade neuronal em embriões de peixe-zebra.
- Investigar as correntes sinápticas excitatórias e inibitórias em neurônios-chave.
- Analisar as propriedades dos receptores sinápticos durante o desenvolvimento embrionário.
Métodos Utilizados
- Dissecação de embriões de peixe-zebra para expor o cerebelo.
- Uso de microscopia de patch clamp para registrar atividade em neurônios de Mauthner.
- Aplicação de soluções específicas para ambientes intracelulares e extracelulares.
- Análise de dados para determinar propriedades sinápticas e de excitabilidade.
Resultados Principais
- Gravações bem-sucedidas de correntes sinápticas excitatórias e inibitórias.
- Caracterização da atividade de canais ativados por voltagem em neurônios em desenvolvimento.
- Identificação das propriedades dos receptores sinápticos em peixe-zebra embrionário.
- Demonstração da eficácia do método para futuros estudos eletrofisiológicos.
Conclusões
- O método desenvolvido é eficaz para estudar a atividade neuronal em embriões de peixe-zebra.
- Os conhecimentos obtidos podem aprimorar a compreensão do desenvolvimento neural.
- Essa abordagem pode facilitar pesquisas adicionais sobre mecanismos sinápticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O registro por patch clamp em células de Mauthner de embriões de peixe-zebra permite a medição direta da função de receptores sinápticos em um sistema nervoso vertebrado em desenvolvimento. Essa abordagem auxilia na validação de alvos ao fornecer dados quantitativos sobre neurotransmissão excitatória e inibitória durante janelas críticas do neurodesenvolvimento. A preparação intacta do cérebro-medula espinal preserva a circuitria nativa, aumentando a confiança preditiva em estudos mecanicistas de plasticidade sináptica e farmacologia de receptores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Investigar hipóteses terapêuticas por meio da medição de correntes excitatórias mediadas por AMPA e NMDA e correntes inibitórias mediadas por GABA/glicina em células de Mauthner em desenvolvimento.
- Valor Operacional: Permitir a redução de riscos biológicos mediante a validação funcional da expressão e atividade de receptores sinápticos em um contexto celular nativo.
- Valor Científico: Apoiar a confiança preditiva por meio do acompanhamento do desenvolvimento sináptico ao nível de célula única em diferentes preparações, reduzindo a variabilidade nas interpretações mecanicistas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Preparar sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho subsequentes, estabelecendo amplitudes e cinéticas de correntes sinápticas de referência em neurônios embrionários.
- Valor Operacional: Abordar a padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio de protocolos consistentes de dissecação, gravação e análise que mantenham conexões sinápticas funcionais.
- Valor Científico: Destacar a prontidão para triagem e a reutilização da plataforma ao permitir o retorno ao mesmo tipo celular (célula de Mauthner) entre preparações para estudos longitudinais do desenvolvimento sináptico.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discutir a relevância para doenças e o alinhamento com biomarcadores translacionais, relacionando medições de correntes sinápticas a processos neurodesenvolvimentais relevantes para modelos de distúrbios neurológicos.
- Valor Operacional: Descrever a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, utilizando o peixe-zebra embrionário como um sistema relevante para doenças em estudos de engajamento de alvos em estágios iniciais.
- Valor Científico: Focar no valor preditivo de redução de riscos, caracterizando a atividade de canais ativados por voltagem e as propriedades dos receptores sinápticos que orientam a triagem de compostos baseada em mecanismos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a Descoberta Inicial até a Identificação de Fármacos, ao fornecer leituras eletrofisiológicas que informam o engajamento do alvo e o mecanismo de ação em sistemas neuronais em desenvolvimento.
- Biologia da Descoberta: Explique como o método apoia a testagem de hipóteses, a elucidação de vias ou a redução de riscos biológicos por meio do registro das propriedades sinápticas e de excitabilidade de células de Mauthner em uma preparação intacta de bulbo raquidiano e medula espinhal.
- Triagem: Descreva a prontidão do ensaio, a reprodutibilidade ou as saídas quantitativas quando apoiadas pelo artigo, por meio da medição de correntes pós-sinápticas excitatórias e inibitórias espontâneas e evocadas sob isolamento farmacológico.
- Análises: Destaque as medições, leituras ou saídas estatísticas que ajudam as equipes a comparar condições mediante a análise de potenciais de membrana, capacitância, resistência de acesso e amplitudes e cinética das correntes sinápticas.
- Pesquisa Translacional: Relacione o método com a continuidade pré-clínica ou o alinhamento com biomarcadores somente quando o artigo o apoiar, ao permitir o estudo do desenvolvimento sináptico em um modelo vertebrado com relevância para o neurodesenvolvimento humano.
- Reutilização Corporativa: Apresente o método como uma capacidade reutilizável, e não como uma técnica de uso único, enfatizando a possibilidade de retornar à mesma preparação do tipo celular (célula de Mauthner) de preparação em preparação para análises longitudinais consistentes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista na função de receptores sinápticos durante o desenvolvimento.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de etapas definidas de dissecação, gravação e análise que mantêm as conexões sinápticas intactas.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre prosseguir ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em fases avançadas, permitindo a avaliação precoce dos efeitos de compostos sobre a excitabilidade neuronal em desenvolvimento e a transmissão sináptica.
- Impacto sobre o Portfólio: Priorização e decisões de avançamento ajustadas ao risco por meio de dados quantitativos de correntes sinápticas que reduzem incertezas em alvos envolvidos em vias de neurodesenvolvimento.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária em neurodissecção, eletrofisiologia de patch clamp e isolamento farmacológico de correntes sinápticas.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica, incluindo microscópio de patch clamp, amplificador, sistema de perfusão e óptica de contraste de interferência diferencial.
- Requisitos de padronização entre equipes quanto ao estadiamento de embriões, técnica de dissecção e critérios de formação de selo, para garantir a comparabilidade dos dados entre experimentos.
- Considerações sobre adaptação entre sistemas modelo devido às diferenças no tamanho neuronal, acessibilidade e composição sináptica entre embriões de peixe-zebra e outras preparações de vertebrados.
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem, incluindo o desafio técnico da dissecção e formação de gigasselo, especialmente para pesquisadores novos no método.
