Name: Exame do Synaptic Vesicle Reciclagem Usando FM Corantes Durante Evocado, espontânea, e as atividades de Synaptic miniatura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a examinar a reciclagem de vesículas sinápticas usando corantes FM em terminais nervosos funcionais. Este protocolo permite avaliar atividades sinápticas evocadas e espontâneas, ampliando a compreensão da neurotransmissão.

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Os autores agradecem aos membros do laboratório Harata para discussões úteis durante toda a execução deste trabalho. Este trabalho foi financiado por doações da Associação Americana do Coração, a Fundação Distonia Pesquisa Médica, o Edward Mallinckrodt, Fundação Jr., da National Science Foundation e da Fundação Whitehall para NCH

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Descrevemos os protocolos de coloração e descoloração vesículas sinápticas em resposta a evocada, atividade sináptica espontânea e miniatura, e para geração de imagens durante a fase de descoloração. Em adição aos protocolos existentes, que têm incluído um novo protocolo de observar a descoloração FM com base na actividade sináptica em miniatura. Usando estes protocolos, que anteriormente identificado anormalidades nos neurônios cultivados a partir de um modelo do rato da distonia distúrbio de movimento. Na comparação c...

A funcionalidade das vesículas sinápticas é um importante determinante da transmissão sináptica. Essas vesículas libertar neurotransmissores quando se fundem com a membrana plasmática pré-sináptica (exocitose), e tornam-se pronto para um outro ciclo de libertação depois de ser regenerada a partir da membrana plasmática (endocitose) e recarregado com neurotransmissor. A investigação sobre a dinâmica dos mecanismos subjacentes e reciclagem das vesículas sinápticas foi muito acelerado pela introdução de corantes estiril FM 1. Estas moléculas anfipáticas, que têm carga positiva grupos de cabeça hidrófilos e caudas hidrofóbicas (vários corantes na Figura 1A, stereoview de FM1-43 na figura 1B), de forma reversível pode entrar e sair de membranas lipídicas sem impregnar a. Grupos de corantes FM compartilham características semelhantes que influenciam a gama de luz que eles emitem. Por exemplo, FM2-10, FM1-43, e FM1-84 tem uma dupla ligação entre os dois compostos cíclicos e shoemissão verde w. A diferença entre eles é o comprimento da cauda hidrofóbica, que determina a sua hidrofobicidade e, por conseguinte, a taxa de saída da membrana (departitioning). Nos casos de FM5-95 e FM4-64, três ligações duplas ligação dos compostos cíclicos, e que mostram emissão vermelha. Estes corantes são diferentes no que diz respeito às suas partes hidrofílicas. Em todos os corantes de FM, a intensidade da fluorescência aumenta quando eles são inseridos em membranas biológicas, devido a um aumento no rendimento quântico do ambiente hidrófobo em relação ao ambiente hidrofílico. Assim, as alterações na intensidade de FM representam as alterações no volume de membrana. As diferentes cores (espectros de emissão) e hidrofobicidades fazer a FM tinge uma ferramenta de pesquisa versátil na reciclagem de vesículas sinápticas. Com base nestas características, os corantes FM são principalmente utilizados de acordo com o seguinte esquema, quando analisando reciclagem das vesículas sinápticas (Figura 2). Neurons são banhadas em uma solução extracelular contendo o corante FM, permitindo que ele seja levado para vesículas sinápticas (SVS), que fazem através de endocitose (coloração). O corante é então lavado por aplicação de uma solução extracelular livre de corante, isto revela as terminações nervosas funcionais, isto é, apenas aqueles submetidos a endocitose activamente, devem conter um conjunto de vesículas sinápticas que são carregados com o corante (Figura 2 abaixo). Exocitose subsequente conduz à perda do corante FM para o espaço extracelular e uma perda concomitante de fluorescência (descoloração, devido a tanto o departitioning para um ambiente hidrofílico e difusão para longe do local de exocitose). Por conseguinte, as alterações na intensidade de fluorescência de FM são indicadores de vesícula sináptica exo e endocitose. Corantes FM foram utilizados para corar e Destain as vesículas sinápticas em vários organismos e preparações 2,3. Exemplos incluem neur mamíferosculturas onal 4-9, fatias de cérebro de mamíferos 10,11, junções neuromusculares 12,13, neurônios bipolares da retina 14,15, e as células ciliadas da cóclea 16. Normalmente em tais experiências, tanto coloração e descoloração são acionados por extensivamente estimular os neurônios (atividade evocada). Recentemente, no entanto, a reciclagem de vesícula sináptica em resposta à estimulação fraco foi também analisado, como tem de reciclagem, na ausência de um estímulo externo (actividade sináptica e espontânea diminuta) 9,17-19. Atividades sinápticas espontâneas e miniatura são definidos como aqueles que ocorrem na ausência de estímulos externos, com o primeiro envolvendo a queima espontânea de potenciais de ação (Figura 3). Essas atividades sinápticas fracas estão associados a mudanças menores em sinais de FM que aquelas desencadeadas por estimulação extensa. A medição requer que as alterações na fluores FMintensidade cia refletir com precisão a exocitose das vesículas sinápticas ou endocitose mas as alterações não de artefatos em intensidade. Uma causa do artefacto é a presença de coloração não específica da membrana plasmática por corantes FM. Washout gradual deste componente vai conduzir a uma mudança gradual na intensidade da fluorescência medida, que serão erroneamente atribuído às actividades sinápticas. Este factor pode ser reduzido por métodos adequados (ver protocolo). A causa mais notável do artefato é a fotodegradação de corante FM retida dentro vesículas sinápticas. As mudanças relacionadas à fotodegradação na intensidade FM deve ser pequeno em comparação com os biológicos (sinápticas) mudanças que são medidos. O recente desenvolvimento de câmaras sensíveis, por exemplo, a câmara do dispositivo de carga acoplada multiplicação de electrões (EMCCD), faz com que seja possível, para minimizar a fotodegradação, encurtando o tempo de exposição e enfraquecimento da intensidade da luz usada para excitar o fluoróforo. Outra causa do artefato é um i derivan o nível de concentração da microscopia de luz. O desvio do foco, durante uma sessão de imagem pode ser causada por efeitos mecânicos ou térmicos, e erroneamente conduzir a uma mudança na intensidade de fluorescência medido. Aqui descrevemos protocolos e equipamentos que tornam possível a utilização de corantes FM para analisar a reciclagem de vesículas sinápticas, mesmo no contexto de uma fraca ou nenhuma estimulação, em particular, a actividade sináptica em miniatura. Mostramos exemplos de coloração e descoloração de vesículas sinápticas evocadas durante os eventos e espontânea, utilizando culturas de neurônios do hipocampo de roedores, e imaginando a fase de descoloração. Também demonstramos como avaliar o grau de FM corante fotodegradação, na ausência de qualquer perda corante FM devido às atividades sinápticas.

<table><tbody><tr><td>Gerador de pulsos</td><td>AMPI</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/" target="_blank"&gt;Estimulador isolado&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Digitimer</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds3-isolated-constant-current-stimulatorstimulus-isolator/" target="_blank"&gt;DS3&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Este é usado para avaliar a morfologia celular em baixa ampliação.</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TiE</td><td>Este é usado para imagens de fluorescência e luz transmitida de alta resolução, com mínima deriva de foco.</td></tr><tr><td>Lente objetiva</td><td>Nikon</td><td></td><td>Recomenda-se uma lente de imersão em água. Uma lente de imersão em óleo pode ser usada, exceto quando a estrutura imageada estiver profunda em relação à superfície da lamínula (&lt;i&gt;por exemplo&lt;/i&gt; &gt;10 &amp;mu;m).</td></tr><tr><td>Cubo de filtro</td><td>Nikon</td><td>77032509</td><td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em para FM1-43</td></tr><tr><td>Cubo de filtro</td><td>Nikon</td><td>77032809</td><td>490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em para FM4-64.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Câmera EMCCD</td><td>Andor Technology</td><td>iXon EM+ DU-860</td><td>Esta câmera EMCCD é usada para detecção de fluorescência de alta sensibilidade.</td></tr><tr><td>Chiller de recirculação líquida</td><td>Solid State Cooling Systems</td><td>Oasis 160</td><td>Este é usado para perfusão contínua da câmera com água refrigerada, mantendo uma temperatura de -80&amp;deg;C, reduzindo assim o ruído.</td></tr><tr><td>LED</td><td>CoolLED-Custom Interconnect</td><td>490 nm</td><td>Esta fonte de luz é usada para controle rápido de ligar/desligar da excitação de fluorescência.</td></tr><tr><td>Software de aquisição de imagens</td><td>Andor Technology</td><td>Solis</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de imagem</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21BRFS</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusão rápida</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>D,L-AP5</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0106</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxina</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1069</td><td>Atenção: reagente tóxico. Manipular com cuidado.</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43 fixável por aldeído (FM1-43FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64 fixável por aldeído (FM4-64FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina equilibrada de Hanks&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>Mínimo Meio Essencial</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td>Esta solução não contém vermelho de fenol, que interferiria na imagem de fluorescência.</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Atenção: reagente tóxico. Manipular com cuidado.</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr></tbody></table>

exame do synaptic vesicle reciclagem usando fm corantes durante evocado, espontânea, e as atividades de synaptic miniatura

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Vesículas sinápticas em terminações nervosas funcionais sofrem exocitose e endocitose. Esta reciclagem das vesículas sinápticas pode ser efetivamente analisados ​​usando corantes estiril FM, que revelam turnover da membrana. Protocolos convencionais para o uso de corantes FM foram concebidos para a análise de neurônios seguinte estimulada (evocado) atividade sináptica. Recentemente, protocolos tornaram-se disponíveis para a análise dos sinais de FM que acompanham as atividades sinápticas mais fracos, como eventos sinápticas espontâneas ou em miniatura. A análise destas pequenas alterações nos sinais de FM requer que o sistema de imagem é suficientemente sensível para detectar pequenas alterações na intensidade, ainda que as mudanças de artefatuais de grande amplitude são suprimidas. Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser aplicado a evocado, espontânea, e actividades sinápticas em miniatura, e usar os neurónios do hipocampo em cultura como um exemplo. Este protocolo inclui também um meio de avaliar a taxa de fotobranqueamento de corantes FM, como este é um significativofonte de artefactos quando imagens pequenas alterações em intensidade.

Como um exemplo, mostramos resultados representativos para o curso de tempo da descoloração das vesículas sinápticas (Figura 4). Neurónios do hipocampo em cultura foram coradas com FM4-64 utilizando a actividade sináptica espontânea (passo 2.3) e lavou-se com solução livre de corante (solução 2 enxaguamento). A imagem mostra o curso inicial de tempo de descoloração usando atividade espontânea (passo 5.3) (parte inicial da linha contínua, a Figura 4A). Isto é seguido por o curso de tempo...

Descreve-se o uso de corantes estiril FM imagem sináptica reciclagem vesícula nos terminais nervosos funcionais. Este protocolo pode ser aplicado não só a evocada, mas também espontânea e actividades sinápticas em miniatura. O protocolo expande a variedade de eventos sinápticos que podem ser eficazmente analisados.

Exame do Synaptic Vesicle Reciclagem Usando FM Corantes Durante Evocado, espontânea, e as atividades de Synaptic miniatura

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A capacidade de medir a cinética de liberação de vesícula pode ajudar a fornecer a introspecção em alguns dos princípios básicos da neurotransmissão. Aqui usamos imagens em tempo real das vesículas marcadas com o corante fluorescente vermelho FM 4-64 para medir a taxa de liberação de vesículas pré-sinápticas no hipocampo culturas neuronal.

Medição Exocitose em Neurônios Usando Labeling FM

Corantes FM tem sido de inestimável ajuda na compreensão da dinâmica sináptica. FMs são normalmente seguidos sob o microscópio de fluorescência em condições de estimulação diferente. No entanto, fotoconversão de corantes FM combinado com microscopia eletrônica permite a visualização de distintas piscinas das vesículas sinápticas, entre outros componentes ultra-estrutura, em boutons sináptica.

Estudando Pools vesículas Synaptic usando fotoconversão de Corantes Styryl

A técnica de imagem ao vivo de fluorescência para quantificar o reabastecimento e mobilização de vesículas sinápticas específicas (SV) piscinas de terminais nervosos central é descrito. Duas rodadas de SV reciclagem são monitorados nos terminais nervosos mesmo fornecendo um controle interno.

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

Este vídeo demonstra um protocolo para estudar a reciclagem de vesículas sinápticas em junções neuromusculares em larvas de Drosophila que expressam channelrodopsina usando um corante fluorescente. A luz azul ativa as channelrodopsinas, causando influxo de cálcio e exocitose de vesículas sinápticas. O corante se integra às membranas neuronais e é internalizado durante a endocitose, resultando em maior fluorescência. A estimulação adicional da luz azul induz exocitose e liberação de corante, o...

Analisando a reciclagem de vesículas sinápticas e a absorção de corantes fluorescentes em larvas de Drosophila

Este artigo fornece um método para investigar a dinâmica de vesículas de neurotransmissores em células de neuroblastoma, usando uma construção de sinaptobrevin2-pHluorina e Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total. A estratégia desenvolvida para processamento de imagens e análise de dados também é relatada.

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

Endocitose da vesícula sináptica é detectada pela microscopia de luz de pHluorin fundido com proteínas de vesículas sinápticas e por microscopia eletrônica de absorção da vesícula.

Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

Vesícula sináptica (SV) ciclismo é o mecanismo de núcleo de comunicação intercelular em sinapses neuronais. Liberação e absorção de corante de FM são o principal meio de análise quantitativa do SV endo e exocitose. Aqui, nós comparamos todos os métodos de estimulação para conduzir FM1-43 ciclismo da sinapse de modelo de junção neuromuscular (JNM) de Drosophila .

Tintura de FM ciclismo a sinapse: comparando a despolarização de potássio alto, elétrica e Channelrhodopsin estimulação

Descrevemos um ensaio óptico para vesícula sináptica (SV) reciclagem em neurônios cultivados. Combinar este protocolo com duplo transfeccao de expressar uma proteína de interesse e o marcador pré-sináptica nos permite localizar sites pré-sináptica, sua vesícula sináptica, capacidade de reciclagem e determinar o papel da proteína de interesse.

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

A junção neuromuscular larval do peixe-zebra é um modelo atraente para o estudo da fisiologia sináptica. É passível de muitas técnicas experimentais, incluindo eletrofisiologia e imagens ópticas. Aqui, descrevemos um protocolo para transmissão sináptica de imagem usando uma sonda baseada em pHluorina sob um microscópio de epifluorescência vertical.

Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

Aprenda a examinar a reciclagem de vesículas sinápticas usando corantes FM em terminais nervosos funcionais. Este protocolo permite avaliar atividades sinápticas evocadas e espontâneas, ampliando a compreensão da neurotransmissão.

Exame do Synaptic Vesicle Reciclagem Usando FM Corantes Durante Evocado, espontânea, e as atividades de Synaptic miniatura

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